張康華，姜珊，高鵬，代龍

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟南250355）

豬皮中膠原蛋白含量達到29%[1]，通過酶解豬皮膠原蛋白可得到具有多種生理活性的肽，其中抗氧化活性肽由于安全、高效等特點，被用于食品及化妝品中[2-3]。因此進行豬皮膠原肽抗氧化性的研究具有重要的現(xiàn)實意義。從豬皮中提取膠原蛋白的方法包括堿提取、酸提取、酶解提取、熱水提取[4-6]，其中仿生酶解應(yīng)用較廣，提取效果較優(yōu)，但工藝復(fù)雜，因加入了酸堿調(diào)節(jié)pH 值，后期需要除鹽易造成肽損失，且成本較高，因此本研究采用堿性蛋白酶及菠蘿蛋白酶在沒有外加酸堿調(diào)節(jié)pH 的條件下對豬皮進行酶解，根據(jù)參考文獻[7-14]及本實驗室前期優(yōu)化的酶解條件進行提取，然后對其進行超濾分離純化，得到不同分子量的膠原肽酶解液，再將上述各組分進行體內(nèi)外抗氧化活性實驗，考察其抗氧化能力。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

新鮮豬皮：購于龍大肉食店；堿性蛋白酶（2 000 U/mg）、菠蘿蛋白酶（2 000 U/mg）：上海佛森生物科技有限公司；牛血清白蛋白（LOT：Y13S9S70264）：上海源葉生物科技有限公司；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH，LOT：C10430696）、2，2’-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸） 二銨鹽（ABTS，LOT：C10144809）：上海麥克林生化科技有限公司；谷胱甘肽（LOT：D1711070）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；小白鼠雌雄各半：山東中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心；微量丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX）試劑盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒：上海信帆生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與型號

卷式超濾膜（1 kDa、3 kDa）：北京市旭邦膜設(shè)備有限責(zé)任公司；FA2204B 萬分之一電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司；BT300-2J 蠕動泵：保定蘭格恒流泵有限公司；真空冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；HH-S4 數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國宇儀器制造有限公司；UV-1800 紫外可見分光光度計：島津儀器有限公司；電滲析器：滄州市眾邦水處理技術(shù)有限公司；高速離心機：上海精密儀器有限公司。

2 方法

2.1 各分子量豬皮膠原肽的制備

取鮮豬皮，刮去皮下雜質(zhì)，以剪刀剪成厚度小于2 mm、長度小于2 cm 的碎塊，用5 倍量0.3%氫氧化鈉溶液浸泡8 h，濾去堿液，水洗至近中性，勻漿5 min，加8 倍量水加熱煮沸15 min，待冷至約55 ℃，加入1 %堿性蛋白酶，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，55 ℃保溫酶解1 h（60 r/min），再加入1 %菠蘿蛋白酶，55 ℃保溫酶解3 h（60 r/min），酶解液加熱煮沸15 min，過濾，濾液放冰箱中冷藏12 h，離心，取上清液減壓濃縮（60 ℃～65 ℃，-0.07 MPa～-0.08 MPa）至相對密度為 1.10～1.15（60 ℃），冷凍干燥（-47 ℃，15 Pa）后即得豬皮酶解原液凍干粉。取適量凍干粉溶于水，先后用不同分子截留量（3、1 kDa）的超濾膜進行分離，分別得到M＞3 kDa 組分、1 kDa＜M＜3 kDa 組分、M ＜1 kDa 組分。

2.2 各組分膠原蛋白肽含量指標測定

采用福林酚比色法[15]，以牛血清白蛋白溶液（0.22 mg/mL）為對照品，繪制出標準曲線，計算線性回歸方程，并從回歸方程中計算總肽的含量。

2.3 不同分子量肽體外抗氧化能力的測定

2.3.1 對DPPH 自由基清除能力的測定

精確稱量4.10 mg DPPH，溶解到100 mL 無水乙醇中，配制成濃度為6.5×10-5mol/L DPPH 乙醇溶液。分別吸取1 mL 樣液與1 mL DPPH 的無水乙醇溶液置于試管中，搖勻，在室溫反應(yīng)30 min 后在波長517 nm 處測定吸光度（A）i；分別吸取1 mL 樣液和無水乙醇于試管中，搖勻，室溫反應(yīng)30 min 后在517 nm 波長處測定吸光度（A2）；最后分別吸取1 mL DPPH 無水乙醇溶液與無水乙醇于試管中，搖勻，在室溫反應(yīng)30 min 后在517 nm 波長處測定吸光度（A0）[16]。按公式（1）計算清除率。

2.3.2 對ABTS+自由基清除能力的測定

取7 mmol/mL 的ABTS 溶液15 mL，室溫下與等體積的4.9 mmol/mL 過硫酸鉀溶液混合后暗處放置12 h，制成 ABTS+儲備液，再用 pH 7.4 的 PBS 稀釋 20 倍制成ABTS+工作液。取不同濃度的樣品溶液和谷胱甘肽溶液1 mL，加入2.0 mL 的ABTS+工作液，震搖均勻后常溫暗處放置10 min，在734 nm 波長處測吸光度[17]。按公式（2）計算清除率。

式中：A1為樣品組吸光度，A2為樣品本底吸光度（以等體積蒸餾水代替ABTS+溶液），A0為空白對照組吸光度（以等體積蒸餾水代替樣品溶液）。

2.3.3 不同分子量豬皮膠原肽組分對O2-·活性清除能力測定

鄰苯三酚自氧化速率的測定參照李婷等[18]的測定方法。不同分子量豬皮膠原肽抑制鄰苯三酚自氧化速率的測定則按上述步驟，加入pH=8.2 緩沖液4.7 mL，然后分別加入不同分子量的豬皮膠原肽溶液，以蒸餾水補至4.2 mL，加入0.3 mL 鄰苯三酚迅速搖勻，同樣以10 mmol/L 鹽酸溶液作為空白管，同上測定。按公式（3）計算加入豬皮膠原肽后鄰苯三酚的自氧化速率，按公式（4）計算清除率。

式中：A3為 30 s 時的吸光度；A4為 4 min 時的吸光度；△A0為鄰苯三酚自氧化速率，△A 為加入豬皮膠原肽溶液后鄰苯三酚的自氧化速率。

2.3.4 不同分子量豬皮膠原肽組分對·OH 的清除能力測定

精密量取150 mmol/L pH=7.4 磷酸鹽緩沖液2.0 mL、7.5 mmo1/L 鄰二氮菲 0.2 mL、7.5 mmol/L 硫酸亞鐵溶液0.2 mL、不同豬皮膠原肽組分試樣0.4 mL、蒸餾水0.8 mL、體積分數(shù)0.1%過氧化氫0.4 mL 于試管中，混勻做試樣組，將各試管同時于37 ℃恒溫放置1 h，在536 nm 處測定吸光度?？瞻捉M以蒸餾水代替樣品，其余步驟同試樣組；空白對照組以蒸餾水分別代替試樣和雙氧水，其余步驟同試樣組[19-20]。按公式（5）計算·OH清除率。

式中：A試樣為試樣組的吸光度值，A0為空白組的吸光度值，A空白對照為空白對照組的吸光度值。

2.4 不同分子量膠原蛋白肽體內(nèi)抗氧化活性的測定

2.4.1 小鼠分組飼養(yǎng)和運動訓(xùn)練

按照體重進行隨機分組，共分成4 個組，一個對照組和3 個實驗組。且每組多養(yǎng)2 只～3 只預(yù)防灌胃或者運動訓(xùn)練時溺水發(fā)生意外。日常自由采食飲水，灌胃飼養(yǎng)35 d，灌胃時間安排在運動前2 h，對照組灌胃雙重蒸餾水，實驗組分別給予3 個不同分子量段的酶解肽液，飼養(yǎng)量為動物體重的3%。每天游泳訓(xùn)練一次，每次 20 min，水溫（30±2）℃，不負重。

2.4.2 血清的制備

運動后休息30 min，用暖風(fēng)機烘干小鼠，取血試管預(yù)先加入肝素抗凝劑（12 500 單位稀釋30 倍），并低溫烘干。頸動脈無麻醉狀態(tài)下取血，搖勻，即刻再放回冰浴中冷卻，3 000 r/min 離心10 min，分離血清，然后將血清傾入另一潔凈試管低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.3 指標測定

按照試劑盒指定的方法測定微量丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量、總超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase，T-SOD）活力、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）活力、總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC） 和過氧化氫酶（Catalase，CAT）活力。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同分子量膠原蛋白肽的含量測定結(jié)果

福林酚比色法標準曲線見圖1，不同分子量豬皮膠原蛋白肽含量測定結(jié)果見表1。

圖1 福林酚比色法標準曲線Fig.1 Standard curve of fosinophenol colorimetric method

3.2 不同分子量膠原蛋白肽的抗氧化能力測定結(jié)果

3.2.1 不同分子量膠原蛋白肽對DPPH 自由基清除能力的測定結(jié)果

不同分子量膠原蛋白肽對DPPH 自由基清除能力的測定結(jié)果見圖2。

表1 不同分子量豬皮膠原蛋白肽含量測定結(jié)果Table 1 Determination of collagen peptide content in pig skin with different molecular weight

圖2 DPPH 自由基清除結(jié)果Fig.2 DPPH radical scavenging results

根據(jù)圖2 可以看出，在0～6 mg/mL 的肽濃度內(nèi)，不同分子量豬皮膠原肽對DPPH 自由基都有一定的清除作用，且隨著豬皮肽濃度的增加，各組分對DPPH 自由基的清除率也隨之升高。其中，M＜1 kDa 組分和1 kDa＜M＜3 kDa 組分對DPPH 自由基的清除能力相近，清除率最高分別可達到87.73%、84.11%；酶解原液最大清除率為73.15%，而M＞3 kDa 組分的清除能力比酶解原液要弱，最大清除率為68.58%。

3.2.2 不同分子量膠原蛋白肽對ABTS+自由基清除能力的測定結(jié)果

不同分子量膠原蛋白肽對ABTS+自由基清除能力的測定結(jié)果見圖3。

圖3 ABTS+自由基清除結(jié)果Fig.3 Results of ABTS+radical scavenging

根據(jù)試驗結(jié)果可以看出，在0～1 mg/mL 的肽濃度范圍內(nèi)，3 個不同分子量肽段對ABTS+自由基清除能力大體一致。在肽濃度小于0.5 mg/mL 時，M＜1 kDa 組分和1 kDa＜M＜3 kDa 組分的抗氧化能力相近，并略強于 M＞3 kDa 組分；而在 0.5 mg/mL～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)，M＞3 kDa 組分的抗氧化能力最強，清除率最高可達到91.22%。

3.2.3 不同分子量豬皮膠原肽組分對O2-自由基清除能力的測定結(jié)果

不同分子量豬皮膠原肽組分對O2-自由基清除能力的測定結(jié)果見圖4。

圖4 O2-自由基清除結(jié)果Fig.4 Results of O2-free radical scavenging

通過比較各組分對O2-自由基的清除率，M＜1 kDa組分與1 kDa＜M＜3 kDa 組分的清除能力最強，酶解原液次之，3 kDa 組分最弱。并且隨著肽濃度的增加，各組分對O2-自由基的清除率也升高，并逐漸趨于穩(wěn)定。

3.2.4 不同分子量豬皮膠原肽組分對OH 自由基清除能力的測定結(jié)果

不同分子量豬皮膠原肽組分對OH 自由基清除能力的測定結(jié)果見圖5。

圖5 OH 自由基清除結(jié)果Fig.5 OH radical scavenging results

試驗結(jié)果顯示，各組分對OH 自由基清除能力的順序為：小于 1 kDa 組分＞1 kDa～3 kDa 組分＞大于 3 kDa組分，并且說明不同分子量豬皮膠原肽對OH 自由基清除存在量效關(guān)系。在肽濃度為5.4 mg/mL 時，各組分的清除率達到最高，分別為79.13%、63.24%、42.85%。

3.3 各組分豬皮膠原肽體內(nèi)抗氧化活性的測定結(jié)果

各組分豬皮膠原肽體內(nèi)抗氧化活性的測定結(jié)果見圖6。

圖6 各組分豬皮膠原肽的體內(nèi)抗氧化指標測定結(jié)果Fig.6 Determination of antioxidant indexes of pig skin collagen peptides in vivo

從圖6 可以看出，實驗組小鼠血清中的SOD、CAT、GSH-PX、T-AOC 與正常對照組比較均增大。MDA 是一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，可以直接反映機體的過氧化水平，各實驗組的MDA 生成量均比對照組有明顯下降。經(jīng)方差分析，各實驗組與對照組之間均具有統(tǒng)計學(xué)差異性（P＜0.05），此外，M＜1 kDa 組與 1 kDa＜M＜3 kDa 組無顯著性差異，而M＞3 kDa 組與另外兩個實驗組均存在顯著性差異。表明該法酶解得到的不同分子量的豬皮蛋白肽有著良好的體內(nèi)活性，說明利用酶解液灌胃小鼠具有提高生物抗氧化能力的功效，從而對機體起到保護作用。

4 結(jié)論

本實驗采用在pH 漸變條件下使用堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶分步酶解，再超濾分離純化，通過研究不同分子量肽段的體內(nèi)外抗氧化能力，表明此方法酶解得到的各組分豬皮膠原肽均有一定的抗氧化活性，經(jīng)過綜合比較，M＜1 kDa 組分的抗氧化活性最強，1 kDa＜M＜3 kDa 組次之，M＞3 kDa 組最弱，說明分子量大小會影響肽的抗氧化活性。本實驗在保證抗氧化活性的前提下達到了節(jié)約成本、降低肽損失的目的，證明此方法可行，以期為豬皮膠原肽的酶解方法提供新的參考。