張 倩，薩旭仁貴，吳昱含，楊 陽(yáng)，劉 振，滕玉鷗

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

伊曲康唑(圖1)，分子式為 C35H38Cl2N8O4，是臨床應(yīng)用廣泛的抗真菌藥物，屬于三唑類(lèi)抗真菌藥物家族的關(guān)鍵成員.它存在于世界衛(wèi)生組織的基本藥物清單上，是基本衛(wèi)生系統(tǒng)中最重要的藥物之一，其安全性毋庸置疑[1].目前可用的口服抗真菌劑伊曲康唑是一種有效的Hedgehog 途徑拮抗劑[2]，通過(guò)抑制羊毛固醇14α 去甲基化酶(麥角固醇合成的關(guān)鍵酶)破壞真菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性，從而使真菌生長(zhǎng)受到有效抑制[3].

近年來(lái)的報(bào)道顯示，伊曲康唑?qū)Χ喾N腫瘤均具有抑制作用.當(dāng)伊曲康唑與順鉑聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)人非小細(xì)胞肺癌原代異種移植模型中的腫瘤的抑制作用被顯著增強(qiáng)[4]；當(dāng)其與貝伐單抗聯(lián)合應(yīng)用于胃腸癌的治療時(shí)，抗癌作用也明顯增強(qiáng)[5].研究[6]發(fā)現(xiàn)，伊曲康唑和紫杉醇協(xié)同可以抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞原位異種移植模型中的腫瘤生長(zhǎng)，并認(rèn)為伊曲康唑是通過(guò)靶向作用于Hedgehog 和mTOR 通路在內(nèi)的多種途徑選擇性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞而發(fā)揮抑制作用.此外，伊曲康唑還可以抑制前列腺癌小鼠模型中的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[3]，老年人面部皮膚最常見(jiàn)的基底細(xì)胞癌也受到明顯抑制[7].因此，研究者們一致認(rèn)為，古老的抗真菌藥物伊曲康唑可以作為潛在的抗腫瘤藥物被進(jìn)一步開(kāi)發(fā)[3-7].

圖1 伊曲康唑的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of Itraconazole

腫瘤患者免疫功能低下的同時(shí)還要接受放射治療、化學(xué)治療，極易發(fā)生真菌感染.真菌感染已成為晚期腫瘤患者常見(jiàn)的并發(fā)癥和死亡原因.伊曲康唑聯(lián)合抗腫瘤藥物的治療方案具有抗腫瘤和抑制真菌感染的雙重功效.Kurosawa 等[8]前期研究發(fā)現(xiàn)，伊曲康唑?qū)Π⒚顾睾鸵劳胁窜罩委熑税籽‘a(chǎn)生的耐藥性具有逆轉(zhuǎn)作用，認(rèn)為其可作為恢復(fù)急性白血病多藥耐藥性的有力候選者，并具有抗真菌作用.王靜等[9]研究發(fā)現(xiàn)，伊曲康唑與多柔比星合用可明顯抑制人急性髓系白血病細(xì)胞KG1α 的增殖.但是，單獨(dú)使用伊曲康唑抑制人白血病的增殖作用卻鮮有報(bào)道.

此外，白血病抑制因子(LIF)及其受體是一種與干細(xì)胞增殖密切相關(guān)的重要分子，相關(guān)研究認(rèn)為L(zhǎng)IF及其受體在血管瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮了積極作用[10].同時(shí)，冉玉平等[11]研究發(fā)現(xiàn)：6 例嬰兒血管瘤患者通過(guò)口服伊曲康唑治療后，病情都于第1 個(gè)月內(nèi)得到控制，3 個(gè)月即有顯著的臨床改善.他們認(rèn)為使用伊曲康唑治療血管增生性疾病有望成為一種安全、方便的治療手段，然而，具體作用機(jī)制尚不清楚.

因此，本文將在前期研究的基礎(chǔ)上，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率、計(jì)數(shù)法繪制增殖曲線、顯微鏡觀察法記錄細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況、PI 染色法檢測(cè)細(xì)胞周期變化以及血管形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定伊曲康唑?qū)芮恍纬傻囊种谱饔茫芯恳燎颠蛞种迫寺运柙籽〖?xì)胞株K562 細(xì)胞增殖的作用及對(duì)腫瘤細(xì)胞血管生成的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

人慢性髓原白血病細(xì)胞株K562、人早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60、人急性T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat、人結(jié)腸癌細(xì)胞株 HCT-116、人肝癌細(xì)胞株HepG2、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，以上細(xì)胞株均由天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院藥物設(shè)計(jì)與合成研究室保存.人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468，美國(guó)菌種保藏中心(ATCC).

PRMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基、DMEM 低糖培養(yǎng)基、DMEM 高糖培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液、巴西胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(1×)溶液，賽默飛世爾科技公司.

伊曲康唑，分析純，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；喜樹(shù)堿(CPT)，分析純，北京偶合科技有限公司；MTT、RNase，北京索萊寶科技有限公司；濃鹽酸、異丙醇，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜，分析純，美國(guó)Amresco 公司；Annexin V-FITC凋亡試劑盒，天津三箭生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇，分析純，天津市盛迪達(dá)貿(mào)易有限公司；碘化丙啶(PI)，西格瑪奧德里奇中國(guó)有限公司；Triton X-100，寶生物工程(大連)有限公司.

超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠；Model 3100 series型CO2培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技公司；TX323L 型電子分析天平，島津國(guó)際貿(mào)易有限公司；Infinite F50 型基礎(chǔ)酶標(biāo)儀，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司；CKX41 型奧林巴斯倒置顯微鏡，奧林巴斯(中國(guó))有限公司；TISR 型尼康熒光倒置顯微鏡，尼康儀器(上海)有限公司；循環(huán)水式真空泵、LX-300 型迷你離心機(jī)、VORTEX-6 型漩渦混合器，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；342976 型流式細(xì)胞儀，碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司；YXQ-LS-50SI 型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率.將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562 細(xì)胞、HL-60 細(xì)胞、Jurkat 細(xì)胞、HCT-116細(xì)胞、HepG2 細(xì)胞、MDA-MB-468 細(xì)胞以及HUVEC細(xì)胞，1×PBS 清洗后分別用0.25%胰蛋白酶消化(貼壁細(xì)胞)，接種于96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞密度為5×104mL-1，每孔接種體積為100μL.將孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育一定時(shí)間(懸浮細(xì)胞孵育2 h，貼壁細(xì)胞孵育24 h).每組設(shè)3 個(gè)平行孔，每孔加入化合物體積為0.5μL.伊曲康唑?qū)嶒?yàn)組和CPT 陽(yáng)性對(duì)照組的加藥終濃度為0.01、0.1、1、10、100μmol/L.同時(shí)，設(shè)置等體積DMSO 溶劑為對(duì)照組.將孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育48 h 后，每孔加入5 mg/mL MTT 20μL，繼續(xù)孵育4 h 后終止培養(yǎng).貼壁細(xì)胞吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入100μL DMSO；懸浮細(xì)胞每孔直接加入100μL 鹽酸-異丙醇溶液后吹打混勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱中10 min 臜使甲 結(jié)晶充分溶解后，使用酶標(biāo)儀(貼壁細(xì)胞選擇490 nm、620 nm；懸浮細(xì)胞選擇580 nm、620 nm)測(cè)定吸光度(A).按照式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率，并計(jì)算半數(shù)有效抑制濃度IC50值.

1.2.2 K562 細(xì)胞增殖曲線繪制

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562 細(xì)胞以細(xì)胞密度為5×104mL-1接種于24 孔板上，每孔1 mL，同時(shí)設(shè)置對(duì)照孔；37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，分別加入終濃度為 1、3、10、30μmol/L 伊曲康唑，每孔5μL.對(duì)照孔為細(xì)胞懸液中僅加入含相同濃度DMSO.再將孔板置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，孵育0、24、48、72、96、120 h，對(duì)不同處理時(shí)間不同加藥濃度的細(xì)胞分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組細(xì)胞計(jì)數(shù)3次，計(jì)算平均值并使用GraphPad Prism 5 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

1.2.3 K562 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562 細(xì)胞以5×104mL-1細(xì)胞密度接種于6 孔板，每孔2 mL，同時(shí)設(shè)置對(duì)照孔.孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，分別加入伊曲康唑終濃度為1、3、10、30μmol/L，每孔10μL.對(duì)照孔細(xì)胞懸液中僅加入相同體積DMSO.再將孔板置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中分別孵育24 h 和48 h，在對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)使用顯微鏡觀察K562 細(xì)胞的形態(tài)變化，并進(jìn)行圖像采集.

1.2.4 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè)伊曲康唑?qū)562 細(xì)胞凋亡的影響

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562 細(xì)胞以5×104mL-1細(xì)胞密度接種于6 孔培養(yǎng)板，每孔2 mL，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h 后，分別加入終濃度為1、3、10、30μmol/L 的伊曲康唑；培養(yǎng)箱孵育48 h后，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，用預(yù)冷的1×PBS 吹懸細(xì)胞，2 500 r/min 離心5 min，再次棄去上清液，冰浴；加入100μL 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至室溫下進(jìn)行染色.首先，加入5μL Annexin VFITC，輕輕振蕩混勻，避光孵育10 min；然后再加入20μg/mL PI 5μL，輕輕吹打混勻，避光孵育5 min；最后補(bǔ)加400μL 1×Binding Buffer 并立即使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)試，實(shí)驗(yàn)需在1 h 內(nèi)完成，防止FITC 及PI 熒光淬滅影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性.

1.2.5 PI 染色檢測(cè)伊曲康唑?qū)562 細(xì)胞周期的影響

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562 細(xì)胞以5×104mL-1細(xì)胞密度接種于6 孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，分別加入伊曲康唑終濃度為1、3、10、30μmol/L；培養(yǎng)箱孵育48 h 后，收集細(xì)胞，2 500 r/min 離心5 min，棄去上清液，加1×PBS 緩沖液將細(xì)胞吹懸，2 500 r/min 離心5 min，再次棄去上清液；加入1 mL 75%的乙醇于4 ℃固定過(guò)夜，1 000 r/min 離心5 min，棄固定液；用1 mL 1×PBS 洗滌1 次，1 000 r/min 離心5 min，棄去PBS；用500μL PBS(含有50μg/mL PI、100μg/mL RNase A、0.2% Triton X-100)4 ℃避光染色30 min，然后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，最后使用Modfit 軟件分析PI 熒光強(qiáng)度圖.

1.2.6 基質(zhì)膠血管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)伊曲康唑?qū)UVEC細(xì)胞管腔形成的影響

基質(zhì)膠MatrigeL 是從小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性的基底膜抽提物.在室溫下可聚合成一種具有生物活性的基質(zhì)材料，上皮細(xì)胞可以在上面形成管狀結(jié)構(gòu)，因此可以利用內(nèi)皮細(xì)胞的這種特性來(lái)研究藥物對(duì)血管形成的影響.

取出已預(yù)冷的96 孔板，向每孔中加入50μL 基質(zhì)膠原液，輕輕晃動(dòng)使之均勻分布，要注意避免產(chǎn)生氣泡.再將96 孔板放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，使基質(zhì)膠原液凝固.

使用0.25%的胰蛋白酶消化HUVEC 細(xì)胞，吹打均勻后在每組實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)接種100μL 細(xì)胞密度為1×105mL-1的單細(xì)胞懸液，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔.待細(xì)胞貼壁后，分別加入濃度為0(用0.5% DMSO 代替)、0.1、1、10、100μmol/L 的伊曲康唑，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h.在熒光倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)的形成情況并隨機(jī)對(duì)其進(jìn)行拍照記錄，最后對(duì)管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)并作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 伊曲康唑?qū)Σ煌[瘤細(xì)胞增殖的影響

通過(guò)MTT 法對(duì)6 株不同的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了體外抗腫瘤活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)伊曲康唑?qū)Π籽〖?xì)胞，尤其是K562 細(xì)胞的抑制作用最為顯著(表1).伊曲康唑抑制K562、HL-60 細(xì)胞增殖的IC50值分別為(3.04±2.30)、(6.62±1.74)μmol/L，而伊曲康唑抑制Jurkat、HCT-116、HepG2 及MDA-MB-468 細(xì)胞增殖的IC50值均大于100μmol/L.本文選擇K562 細(xì)胞株展開(kāi)伊曲康唑抗腫瘤作用的后續(xù)研究.

表1 MTT法檢測(cè)伊曲康唑抑制腫瘤細(xì)胞增殖的IC50值Tab.1 MTT assay for IC50 values of Itraconazole on tumor cells

2.2 伊曲康唑?qū)562細(xì)胞增殖的影響

伊曲康唑?qū)562 細(xì)胞增殖的影響如圖2 所示.由圖2 可知：濃度為1 μmol/L 伊曲康唑作用于K562 細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的增殖并未受到明顯抑制.然而當(dāng)伊曲康唑的濃度分別提高到3、10、30 μmol/L 作用于K562 細(xì)胞0、24、48、72、96、120 h 時(shí)，細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，伊曲康唑濃度越大、作用時(shí)間越長(zhǎng)，K562 細(xì)胞生長(zhǎng)受到的抑制作用越明顯.結(jié)果表明，伊曲康唑抑制K562 細(xì)胞生長(zhǎng)的作用十分顯著且呈現(xiàn)出了濃度與時(shí)間的依賴(lài)性.

圖2 伊曲康唑?qū)562細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of Itraconazole on K562 cells proliferation

2.3 伊曲康唑?qū)562細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

細(xì)胞在凋亡過(guò)程中以及周期受到阻滯時(shí)均會(huì)出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化.伊曲康唑?qū)562 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響如圖3 所示.通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡(放大400倍)觀察發(fā)現(xiàn)：空白對(duì)照組的K562 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較旺盛，形態(tài)呈圓形，整體光亮；而伊曲康唑處理后K562 細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體、細(xì)胞變長(zhǎng)或細(xì)胞皺縮的現(xiàn)象.細(xì)胞凋亡的早期主要表現(xiàn)為包漿形成空泡，空泡與細(xì)胞分離后最終導(dǎo)致細(xì)胞破碎形成凋亡小體.細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)條狀則提示伊曲康唑?qū)562 細(xì)胞的細(xì)胞周期可能存在阻滯的作用.于是，在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證伊曲康唑?qū)562 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響.

圖3 伊曲康唑?qū)562細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響Fig.3 Effect of Itraconazole on K562 cells morphology

2.4 伊曲康唑?qū)562細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞高度有組織的程序性死亡過(guò)程，故又被稱(chēng)為程序性細(xì)胞死亡.凋亡介導(dǎo)的細(xì)胞死亡在正常發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)的維持中都具有重要意義，對(duì)于腫瘤的發(fā)生也具有十分重要的作用[12].在前期細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的基礎(chǔ)上，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步定量檢測(cè)DMSO 與伊曲康唑作用K562 細(xì)胞48 h 后細(xì)胞凋亡的結(jié)果，結(jié)果如圖4 所示.正常對(duì)照細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡細(xì)胞比例分別為1.08%和2.48%；低濃度伊曲康唑(1μmol/L)處理的K562 細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡細(xì)胞比例分別為1.12%和3.92%；較高濃度伊曲康唑(3 μmol/L)作用下K562 細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡細(xì)胞比例分別為 2.14%和 9.53%；而 10μmol/L 伊曲康唑作用的K562 細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡細(xì)胞比例逐步增加，分別為4.60%和10.53%；采用更高濃度的伊曲康唑(30 μmol/L)處理后，K562 細(xì)胞細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡細(xì)胞比例升高，分別為4.35%和12.57%.

圖4 伊曲康唑?qū)562細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of Itraconazole on apoptosis of K562 cells by staining with Annexin V/PI

伊曲康唑誘導(dǎo)K562 細(xì)胞凋亡率的分析如圖5所示.

圖5 伊曲康唑誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡率的分析Fig.5 Itraconazole-induced apoptotic rate of K562 cells

由圖5 可知，相同作用時(shí)間下，30μmol/L 伊曲康唑誘導(dǎo)K562 細(xì)胞的總凋亡率為17.92%，與DMSO引起的總凋亡比例3.56%相比，增加了5 倍.實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：伊曲康唑能夠誘導(dǎo)K562 細(xì)胞的凋亡，并呈現(xiàn)出濃度的依賴(lài)性.

2.5 伊曲康唑?qū)562細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果提示伊曲康唑在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)，對(duì)K562 細(xì)胞周期可能也有一定影響.為了驗(yàn)證這一假設(shè)，在DMSO 或不同濃度伊曲康唑處理K562 細(xì)胞48 h 后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了細(xì)胞周期變化.如圖6 所示，DMSO 處理的對(duì)照組G1期細(xì)胞比例為33.50%；1μmol/L 伊曲康唑處理的K562 細(xì)胞G1期細(xì)胞比例為36.63%；當(dāng)伊曲康唑濃度為3、10、30μmol/L 時(shí)，G1期細(xì)胞比例為逐步增加，分別為43.44%、47.90%，甚至達(dá)到50.28%.

從圖7 的細(xì)胞周期各時(shí)期的細(xì)胞比例分析中可以看出：隨著伊曲康唑濃度增加，G1期細(xì)胞比例也顯著增加，且存在劑量依賴(lài)關(guān)系，說(shuō)明伊曲康唑可以將K562 細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用.

圖6 不同濃度伊曲康唑?qū)562細(xì)胞周期的影響Fig.6 Effect of different concentration of Itraconazole on cell cycle of K562 cells

圖7 不同濃度伊曲康唑?qū)562細(xì)胞周期影響的分析Fig.7 Distribution of cell cycle of K562 cells treated with Itraconazole of different concentration

2.6 伊曲康唑?qū)UVEC細(xì)胞血管形成的影響

血管生成對(duì)腫瘤組織的發(fā)展和轉(zhuǎn)移有重要作用，如果沒(méi)有充足的血管，腫瘤細(xì)胞將會(huì)缺乏必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，只能進(jìn)入休眠階段，甚至發(fā)生壞死.另外，如果缺乏大量新生血管，腫瘤組織代謝產(chǎn)物堆積，遷移也會(huì)受到限制，所以抑制血管生成對(duì)于控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著很重要的意義[13].

血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC 具有較好的運(yùn)動(dòng)分化能力，可以在基質(zhì)膠中形成血管的管腔結(jié)構(gòu).本文接下來(lái)利用基質(zhì)膠血管形成實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度伊曲康唑?qū)UVEC 細(xì)胞血管形成的影響，進(jìn)一步評(píng)價(jià)了伊曲康唑抗腫瘤活性的多樣性.0.1、1、10、100μmol/L伊曲康唑處理HUVEC 細(xì)胞12 h 后，利用倒置熒光顯微鏡(放大100 倍)觀察細(xì)胞的血管生成情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8 所示.

圖8 不同濃度伊曲康唑?qū)UVEC細(xì)胞血管形成的影響Fig.8 Effect of different concentration of Itraconazole on HUVEC cell angiogenesis

DMSO 對(duì)照組的HUVEC 細(xì)胞在基質(zhì)膠上排列形成完整管腔結(jié)構(gòu)；0.1、1、10、100μmol/L 的伊曲康唑刺激HUVEC 細(xì)胞后，隨著作用濃度的增加，基質(zhì)膠上完整的管狀結(jié)構(gòu)逐漸被破壞，1μmol/L 伊曲康唑作用下的HUVEC 細(xì)胞已無(wú)法形成完整的管狀結(jié)構(gòu)，而呈現(xiàn)出線條狀的結(jié)構(gòu)；10μmol/L 伊曲康唑作用下，不僅無(wú)法觀察到完整的管狀結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)甚至呈現(xiàn)散點(diǎn)狀；100μmol/L 伊曲康唑作用的HUVEC 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組，伊曲康唑產(chǎn)生析出現(xiàn)象，但依舊可以觀察到呈散點(diǎn)狀態(tài)的HUVEC 細(xì)胞.血管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在一定濃度范圍內(nèi)，伊曲康唑可以顯著抑制HUVEC 細(xì)胞的血管形成，并具有濃度的依賴(lài)性.

3 討 論

2017 年6 月30 日，中國(guó)侵襲性真菌感染工作組報(bào)道了侵襲性真菌病(invasive fungal disease，IFD)是血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者重要的死亡原因之一，血液病患者IFD 的總體發(fā)病率不斷呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，即使接受造血干細(xì)胞移植后，IFD 病死率仍高達(dá)50%[14].值得注意的是，IFD 的預(yù)防治療與經(jīng)驗(yàn)治療策略中，伊曲康唑都被作為推薦使用的抗真菌藥物之一.

與此同時(shí)，長(zhǎng)期綜合化學(xué)治療與放射治療雙重療法，使得腫瘤患者伴發(fā)第二腫瘤的發(fā)生率明顯上升.患者無(wú)病生存期的延長(zhǎng)、繼發(fā)實(shí)體瘤者日益增多，且在白血病治療的進(jìn)程中尤為明顯.顧偉英等[15]以24 例白血病患者(伴發(fā)實(shí)體瘤類(lèi)型依次為胃癌6例，食管癌4 例，肺癌3 例，直腸癌、腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、鼻咽癌、皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤各2 例，腎癌l 例)作為研究對(duì)象，對(duì)其臨床特點(diǎn)與預(yù)后展開(kāi)分析，認(rèn)為關(guān)于白血病與實(shí)體瘤疊合的治療及預(yù)防，臨床上首先考慮的仍是原發(fā)病的緩解或治愈.但是，伴發(fā)的第二腫瘤同樣不可小覷.

此外，研究[16]報(bào)道顯示：口服普萘洛爾為治療嬰幼兒血管瘤的一線方案，然而對(duì)于一線治療無(wú)效的嬰幼兒血管瘤，研究者們迫切需要找到一種新型、安全、高效的藥物進(jìn)行代替.近來(lái)臨床上報(bào)道伊曲康唑在治療嬰幼兒血管瘤上療效顯著，不良反應(yīng)輕微，但伊曲康唑治療血管瘤的遠(yuǎn)期療效和作用機(jī)制尚未明確，有待進(jìn)一步研究和探索.

本文探討了單獨(dú)使用伊曲康唑?qū)θ寺运柙籽〖?xì)胞株K562 的增殖抑制作用及對(duì)血管生成的抑制作用，發(fā)現(xiàn)伊曲康唑不僅能夠通過(guò)誘導(dǎo)K562 細(xì)胞凋亡、發(fā)生G1期阻滯從而抑制K562 細(xì)胞的增殖，而且能夠顯著抑制HUVEC 細(xì)胞血管生成，且均呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)關(guān)系.對(duì)于血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者、血液系統(tǒng)惡性腫瘤伴發(fā)第二腫瘤患者以及血管瘤患者而言，這無(wú)疑是備受鼓舞的發(fā)現(xiàn).

綜上，有理由認(rèn)為：生物利用度高、安全性好且具有廣譜抗真菌作用的伊曲康唑極有可能成為臨床應(yīng)用前景廣闊的抗血液系統(tǒng)惡性腫瘤及抗血管瘤候選藥物，不僅具有抗真菌作用的附加益處，還有望抑制血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者所繼發(fā)的實(shí)體瘤發(fā)展.

盡管有伊曲康唑聯(lián)合其他抗腫瘤藥物的研究表明伊曲康唑是通過(guò)靶向作用于Hedgehog 和mTOR通路在內(nèi)的多種途徑選擇性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞而發(fā)揮抑制作用，但是單獨(dú)使用伊曲康唑治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤、血管瘤以及抑制血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者所繼發(fā)的實(shí)體瘤的相關(guān)研究甚少，其具體機(jī)制仍需深入研究.因此，深入研究伊曲康唑在血液系統(tǒng)惡性腫瘤、血管瘤及繼發(fā)實(shí)體瘤中的治療機(jī)制顯得十分重要.本實(shí)驗(yàn)室將在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上，深入蛋白水平和動(dòng)物水平展開(kāi)后續(xù)研究，為進(jìn)一步探究伊曲康唑抗腫瘤作用機(jī)制提供新思路.