黎繼昕，賴炳佳，張 帆，梁碧玲，楊綺華

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院放射科，廣東 廣州 510120)

肝纖維化是肝硬化的前期階段，其主要病理改變?yōu)槎喾N大分子物質(zhì)沉積，形成新的纖維組織。目前病理活檢是診斷肝纖維化的金標準，但其為有創(chuàng)檢查，難以用于常規(guī)追蹤復(fù)查。自旋-晶格弛豫時間，也稱T1ρ或T1rho，對低頻運動及穩(wěn)態(tài)過程均較為敏感，可用于檢測大分子成分及組織內(nèi)質(zhì)子物質(zhì)交換，故可用于診斷肝纖維化。本研究采用T1rho技術(shù)檢測大鼠肝纖維化，旨在于動物模型層面觀察T1rho對肝纖維化的定量診斷價值。

1 材料與方法

1.1 建立肝纖維化動物模型 選取SPF級雄性SD大鼠60只(廣東省動物實驗中心提供)，體質(zhì)量180～220 g，平均(206.20±12.21)g，隨機分為實驗組45只，對照組12只，3只備用。

實驗組：大鼠檢疫期過后，將CCl4與橄欖油以2∶3配成40%CCl4油溶液，注入大鼠腹腔，劑量0.2 ml/100 g體質(zhì)量，每周2次，每次間隔3天以上，連續(xù)注射10周，建立肝纖維化模型。對照組：對大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉，注射劑量為0.2 ml/100 g體質(zhì)量，注射方法及注射時間同實驗組。

1.2 儀器與方法 采用Philips Achieva TX 3.0T雙源臨床用MR儀，5.0 cm動物線圈。掃描序列為常規(guī)軸位及冠狀位T2W、軸位T1W、軸位3D BLOCK T1rho，具體掃描參數(shù)見表1。實驗開始后第1、2、4、6、8、10周分別取實驗組5～6只大鼠以及對照組2只大鼠于給藥48 h后進行MR掃描，以避免給藥后急性損傷的影響。

1.3 圖像分析 由2名具有5年以上MR閱片經(jīng)驗的醫(yī)師分析并測量數(shù)據(jù)，并以平均值作為最終測量值。采用Philips IDL軟件，生成T1rho map，然后以Image J(NIH, Bethesda, MD)軟件進行量化分析。參考Wang等[1]方法測量T1rho值，于T1rho map上手動畫取5個橢圓形ROI，5層圖像共25個ROI，取其均值。

1.4 病理檢查 結(jié)束MR掃描后，取大鼠肝臟進行Western Blot檢查，檢測α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)表達水平，并行病理學檢查，常規(guī)HE染色及天狼星紅染色。采用嚙齒類動物的肝纖維化分級標準[2]，將大鼠肝纖維化等級分為F0～F6級。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料以±s表示。采用單因素方差分析比較不同級別肝纖維化大鼠T1rho測量值，組間兩兩比較采用LSD法。對肝纖維化分級與α-SMA表達水平、T1rho測量值的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析；α-SMA表達水平與T1rho測量值的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。對2名醫(yī)師的T1rho測量值采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(intraclass correlation coefficient， ICC)進行一致性分析，ICC>0.8為一致性好。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同肝纖維化大鼠T1rho測量值的比較 實驗組造模過程中共13只大鼠死亡，余32只大鼠成模情況為F0級2只、F1～F6級各5只；對照組12只均為F0級。2名醫(yī)師T1rho測量值的ICC為0.99，一致性好。將對照組與實驗組F0級大鼠合并為F0組，F(xiàn)0～F6級肝纖維化大鼠的T1rho值分別為(40.68±1.60)ms、(42.80±1.08)ms、(44.98±1.04)ms、(46.47±3.47)ms、(47.73±3.84)ms、(55.38±7.46)ms、(57.08±5.11)ms(圖1)，總體差異有統(tǒng)計學意義(F=30.72,P<0.01)；除F0與F1級、F1與F2級、F2與F3～F4級、F3與F4級、F5與F6級差異均無統(tǒng)計學意義外，余兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

2.2 大鼠肝臟T1rho測量值與肝纖維化分級的相關(guān)性 大鼠肝臟T1rho測量值與肝纖維化分級呈正相關(guān)(r=0.88,P<0.01)，見圖2。

2.3 α-SMA表達水平與肝纖維化、T1rho測量值的相關(guān)性 α-SMA表達水平與肝纖維化分級呈正相關(guān)(r=0.74,P<0.01),與T1rho值呈正相關(guān)(r=0.57,P<0.01)，見圖3～5。

3 討論

3.1 T1rho值用于鑒別不同肝纖維化級別的意義及相關(guān)性分析 T1rho序列一直被用于探測大分子物質(zhì)水平，其診斷病變主要依賴于對大分子物質(zhì)水平變化的敏感度，因T1rho為量化指標，故較單純形態(tài)學觀察更為客觀、可信。肝纖維化的主要病理改變是膠原、蛋白聚糖類以及其他大分子物質(zhì)在肝組織細胞外基質(zhì)內(nèi)過度沉積，形成新的纖維組織。隨著肝纖維化程度加重，細胞外基質(zhì)內(nèi)大分子物質(zhì)相應(yīng)增多。根據(jù)T1rho檢測大分子物質(zhì)水平的成像原理，肝纖維化程度越重，肝臟T1rho值就越高，故理論上可以通過肝臟T1rho值的變化而無創(chuàng)評估肝纖維化程度，并動態(tài)觀察、評估肝纖維化的變化。

表1 大鼠MR掃描參數(shù)

圖1 F0～F6級肝纖維化的MR T1rho及病理圖 A.T2WI； B.T1rho map圖； C.天狼星紅染色圖(×40)

T1rho技術(shù)目前已廣泛用于全身多個部位的臨床研究[3]，在肝臟的應(yīng)用研究起步較晚。2003年，Halavaara等[4]率先嘗試將0.1T MR T1rho用于人類肝臟成像。2011年，Wang等[1]提出了T1rho技術(shù)用于診斷肝纖維化的可行性，并在大鼠膽總管結(jié)扎(bile duct ligation, BDL)肝纖維化模型上得到證實。隨后，Zhang等[5]進一步證實了T1rho可用于診斷大鼠肝纖維化；Xie等[6]則證實T1rho測量不受脂肪肝的影響，可用于診斷脂肪肝背景下的肝纖維化。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠不同肝纖維化級別的T1rho測量值差異有統(tǒng)計學意義，說明通過T1rho檢測大分子物質(zhì)水平，可以反映出肝纖維化程度的變化，與Wang等[1,7]的研究結(jié)果基本一致。但Wang等[1]所用大鼠模型為BDL模型，本研究與之不同；BDL術(shù)后15天開始大鼠肝纖維化達到F3水平，術(shù)后24天達到F4以上水平，其所形成的纖維間隔較厚，而這可能是其術(shù)后38天T1rho測量值高于本研究結(jié)果的主要原因。Zhao等[7]所用模型與本研究一致，但研究期限比本研究短，未觀察到晚期肝硬化(F5～F6)的T1rho測量值及病理變化。上述2項研究均未對大鼠肝纖維化作出病理分級，僅初步觀察了其變化趨勢。本研究進一步證實T1rho測量值可將無纖維化的F0級大鼠肝臟與有纖維化的F2～F6級大鼠肝臟區(qū)分開來，并能區(qū)分輕微肝纖維化的F1級與F3～F6級、早期肝硬化F4級或以下與中晚期肝硬化F5～F6級；雖然T1rho在鑒別輕度F2肝纖維化與中重度肝纖維化到早期肝硬化即F3～F4級時價值較有限，但整體趨勢仍是隨著肝纖維化級別增高，T1rho測量值呈上升趨勢，證明T1rho可診斷用于大鼠模型肝纖維化。

圖3 不同肝纖維化分級α-SMA表達水平圖

圖4 不同肝纖維化分級與α-SMA 水平相關(guān)關(guān)系的散點圖 圖5 α-SMA表達水平與肝臟T1rho測量值相關(guān)關(guān)系的散點圖

3.2 α-SMA表達與肝纖維化級別、T1rho值的相關(guān)性 α-SMA是肌動蛋白的一個亞型，為平滑肌細胞分化的一個特異性標記。在損傷的肝組織中，肝星形細胞(hepatic stellate cells, HSCs)膠原纖維生成增多(包括Ⅰ類和Ⅲ類膠原)，形成細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)，會引起HSCs的細胞胞漿中α-SMA的強烈免疫反應(yīng)，因此，α-SMA表達可用于識別表現(xiàn)為肌動蛋白成纖維細胞表型的HSCs[8]。在體實驗[9-10]證實，α-SMA陽性的HSCs與人類慢性肝病的纖維組織累積相關(guān)，與肝纖維化級別相關(guān)，α-SMA表達水平與肝纖維化相關(guān)[11-12]。

本研究中T1rho測量值的變化趨勢與α-SMA表達水平的相關(guān)趨勢也較為一致，隨α-SMA升高，T1rho測量值也有增高趨勢，從一個側(cè)面反映出HSCs活化、纖維組織形成，細胞外基質(zhì)大分子物質(zhì)增多，形成膠原纖維間隔的數(shù)量及密度增加，而這正是T1rho測量值增高的原因之一。相對于肝纖維化病理分級而言，α-SMA為量化指標，能從另一側(cè)面比較客觀地評估肝纖維化與T1rho測量值的關(guān)系。

總之，在大鼠肝纖維化過程中，隨著HSCs激活，α-SMA的表達水平上升，ECM大分子物質(zhì)增加，使得肝臟T1rho測量值上升。α-SMA表達水平與肝纖維化級別、T1rho測量值均呈正相關(guān)，大鼠肝纖維化級別與T1rho測量值呈正相關(guān)；MR T1rho可用于定量、無創(chuàng)性評估大鼠肝纖維化程度。