傅鴻妃

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

辣椒是我國重要的蔬菜作物，目前全國辣椒種植面積超過200萬hm2，占蔬菜種植面積的12%，產(chǎn)量4 000萬t，是全球辣椒生產(chǎn)第一國[1]。辣椒是常異花授粉蔬菜，雜交種子生產(chǎn)絕大部分通過人工去雄后再授粉得到，因此，在生產(chǎn)過程中容易產(chǎn)生因去雄不干凈而造成自花授粉，昆蟲傳播和機(jī)械混雜也是導(dǎo)致花粉混雜的原因。雜交種子純度鑒定是保證種子質(zhì)量和農(nóng)民效益的有效手段，對于提高生產(chǎn)效益和利用雜種優(yōu)勢具有非常重要的意義。

目前，我國雜交種子純度鑒定以田間栽培形態(tài)鑒定、實(shí)驗(yàn)室同工酶電泳鑒定和分子標(biāo)記鑒定為主。田間種植鑒定周期較長，需要花費(fèi)大量的勞動(dòng)力和土地資源，且易受到環(huán)境因素的影響。同工酶鑒定多態(tài)性信息相對較少，又具有組織器官特異性，隨著新品種數(shù)量的不斷增加和種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)越來越狹窄，這2種鑒定方法已經(jīng)難以滿足純度鑒定的精確性要求。分子標(biāo)記技術(shù)因快速、精確性高等原因被越來越多地應(yīng)用在雜交種子純度鑒定上，SSR分子標(biāo)記具有操作方法簡單、標(biāo)記數(shù)量豐富、多態(tài)性穩(wěn)定性和重復(fù)性好、條帶分布均勻等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)利用該技術(shù)對杭椒雜交種子進(jìn)行快速鑒定，以期可以有效加快種子鑒定速度，節(jié)約時(shí)間和成本。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用材料是課題組自留的自交提純辣椒品種H12母本、H12父本和雜交種H12。3份材料在當(dāng)年11月份播種，于次年3月中下旬定植于杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜基地。

1.2 DNA的提取與檢測

采用改良的CTAB法提取樣品心葉基因組DNA，用分光光度計(jì)NanoDrop2000檢測DNA質(zhì)量和濃度，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序

PCR擴(kuò)增體系為總體積25 mL，其中10×PCR緩沖液2.5 mL，2.5 mmol·L-1dNTP 2.0 mL，SSR左右引物(10 mmol·L-1)各2.0 mL，Taq酶(5 U·mL-1)0.5 mL，模板DNA(25 ng·mL-1)2.0 mL，ddH2O 14.0 mL。

SSR-PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性60 s；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸3 min。擴(kuò)增產(chǎn)物30%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，快速銀染法染色。

1.4 引物的合成與篩選

參照發(fā)表的文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫查找得到辣椒的SSR引物，經(jīng)辣椒SSR遺傳多樣性研究選出多態(tài)性較好引物31對[2]，用于區(qū)分杭椒父母親本和雜交種，引物由上海生物生工公司合成。

1.5 雜交種SSR純度鑒定

將選出的能區(qū)分父母親本和雜交種的引物，用于雜交種的純度鑒定，雜交種純度(%)=同時(shí)具備父母親本特征條帶的植株數(shù)量/檢測的植株總數(shù)量×100%。

1.6 雜交種田間純度鑒定

定植后的雜交種植株進(jìn)行常規(guī)田間管理，統(tǒng)計(jì)之前不去雜、不間苗。盛花期統(tǒng)計(jì)總株數(shù)和雜株數(shù)，統(tǒng)計(jì)雜交種田間純度，雜交種純度(%)=(總株數(shù)-雜株數(shù))/總株數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取的DNA質(zhì)量分析

SSR標(biāo)記的質(zhì)量與DNA的質(zhì)量息息相關(guān)，DNA純度用D260/D280值估算，D260/D280值為1.8的DNA質(zhì)量很好，是純品。分光光度計(jì)NanoDrop2000測量得到H12母本辣椒、H12父本辣椒和雜交種H12辣椒的DNAD260/D280值分別為1.99、1.87和1.75，滿足SSR分子標(biāo)記的需要。

2.2 SSR引物篩選

利用H12母本辣椒、H12父本辣椒和雜交種H12辣椒，以31對引物進(jìn)行多態(tài)性挑選，31對引物均擴(kuò)增出了清晰條帶，但大部分不能區(qū)分父母本辣椒和F1代雜交種，不適合用于父母親本與F1代雜交種的純度鑒定，只有Cams885和GP20036兩對引物在父母親本和雜交種之間擴(kuò)增出典型的父母本互補(bǔ)條帶，可用于鑒定父母親本和F1代雜交種。圖1、圖2是在引物Cams885和GP20036下擴(kuò)增出的區(qū)分H12和父母親本的圖譜。

a—母本；b—父本；c—H12。圖2同。圖1 引物Cams885區(qū)分H12和父母親本的圖譜

圖2 引物GP20036區(qū)分H12和父母親本的圖譜

2.3 雜交種SSR純度鑒定

分別取96株H12植株的心葉，利用引物Cams885和GP20036進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)96個(gè)H12植株中引物Cams885擴(kuò)增出92個(gè)植株條帶清晰一致，引物GP20036擴(kuò)增出86個(gè)植株條帶清晰一致，利用這2個(gè)引物檢測雜交種H12種子的純度分別是95.8%和89.6%。圖3、圖4分別是雜交種H12在引物Cams885和GP20036下擴(kuò)增出的部分圖譜。

2.4 雜交種田間純度鑒定

辣椒盛花期時(shí)對定植的雜交種H12進(jìn)行田間純度鑒定，對種植的每個(gè)單株進(jìn)行植株、葉、花、果等性狀的逐一辨別和分析，記錄數(shù)據(jù)并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。結(jié)果表明，田間種植的150株H12中，4株定植后死亡，剩余146株中有138株是雜交種H12，田間鑒定的純度是94.5%。

3 討論

3.1 SSR分子標(biāo)記和田間表型性狀2種純度鑒定結(jié)果的一致性

本研究選出的引物Cams885能區(qū)分H12母本辣椒、H12父本辣椒和雜交種H12辣椒，這與張曼[3]的結(jié)果一致。選出的引物GP20036能夠區(qū)分H12母本辣椒、H12父本辣椒和雜交種H12辣椒國內(nèi)還沒有人用于辣椒純度鑒定，這是國內(nèi)首次利用該引物區(qū)分辣椒父母親本和其雜交種子。

圖3 引物Cams885檢測H12擴(kuò)增部分的圖譜

利用引物Cams885和GP20036對雜交種H12的種子進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，96個(gè)H12植株中引物Cams885擴(kuò)增出92個(gè)植株條帶清晰一致，引物GP20036擴(kuò)增出86個(gè)植株條帶清晰一致，純度分別是95.8%和89.6%。利用田間表型性狀檢測雜交種H12種子的純度，146株中有138株是雜交種H12，純度為94.5%。利用SSR分子標(biāo)記檢測和田間表型性狀觀察雜交種H12種子的純度結(jié)果相近，說明實(shí)驗(yàn)室利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)檢測雜交種子和利用田間性狀觀察杭椒雜交種子純度結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)室SSR分子標(biāo)記技術(shù)檢測杭椒雜交種子可以大大縮短純度鑒定的周期，節(jié)約時(shí)間和精力。

3.2 影響杭椒雜交品種種子純度的主要因素及解決方法

利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)存在個(gè)別植株條帶缺失或條帶不一樣的情況，田間表型性狀觀察發(fā)現(xiàn)存在不一樣的表型性狀的植株，主要是非本雜交品種種子所致，存在雜株的主要原因是其他辣椒種子不經(jīng)意的混雜，或者是母本沒有授粉結(jié)果所致，亦或是隔離不嚴(yán)密存在個(gè)別植株或果實(shí)被非父本雜交所致。解決這些問題的方法是嚴(yán)格隔離，不讓其他花粉混雜進(jìn)來；仔細(xì)授粉，不漏下不授粉的母本；采收和烘曬種子盡量不讓別的種子混雜進(jìn)來。