張萍，沈振原，錢佳，金程，徐冰，朱清，何小麗*

(1.上海奉賢園林綠化工程有限公司，上海 200232； 2.上海市園林科學規(guī)劃研究院，上海 200232； 3.上海城市困難立地綠化工程技術研究中心，上海 200232)

香樟(Cinnamomumcamphora)為樟科樟屬植物，是亞熱帶常綠闊葉林的主要組成樹種，著名的園林綠化樹種之一。其觀賞性好、抗逆性強、耐修剪，萌芽力強、較好的文化價值使得其成為園林綠化的優(yōu)勢樹種之一，廣泛應用到公園、綠地、行道樹、庭院綠化中，對于改善城市的生態(tài)環(huán)境發(fā)揮了重要作用。香樟體內含有特殊的化學物質，病蟲害較少，但由于不少地方重栽植、輕管理、種植頻率高、樹種單一，香樟黃化越來越嚴重[1-2]。香樟黃化一般表現(xiàn)：(1)植株葉片不同程度發(fā)黃，樹勢衰弱，嚴重者葉黃白色、質薄，葉尖與葉緣有焦枯斑，容易受凍害；(2)最初黃化的樹葉僅僅在樹冠上局部分布，以后數量逐漸增加，以致全冠黃化，嚴重時嫩梢枯死、枝葉稀疏，樹冠萎縮，逐漸衰竭死亡；(3)一般幼樹與新移植不久的香樟黃化比例較高，同一病株冬春兩季黃化較重，新葉黃化重于老葉。

一般認為引起黃化病病害的原因可分為生物因素和環(huán)境因素2大類[3-4]。生物因素是由于病原菌由葉部或他處侵入，干擾了植物的正常代謝，葉片黃化只是作為危害癥狀從外部顯示出來。環(huán)境因素黃化是由于土壤中缺乏鐵、鋅等微量元素或者由于某些元素過剩引起營養(yǎng)失調而導致葉片黃化，管理粗放和一些客觀的外在環(huán)境因素如光照、水分(包括土壤水和降水)、溫度、土壤養(yǎng)分(包括缺鐵或者氮、磷、鎂、錳等元素含量的比例失調等)、土壤pH、大氣污染等綜合因子都可以誘導黃化病的產生和發(fā)展。針對香樟黃化起因，生物防控一般采用針對地上部分的病蟲害農藥防治，環(huán)境因素控制常采用種植土壤改良處理、葉面噴施硫酸亞鐵溶液、根際施用酸性肥料等方法[5-7]。關于香樟黃化的起因研究，國內學者常圍繞生物防控和環(huán)境因子控制展開研究，對香樟地下部分土壤微生物群落研究較少。本研究采用細菌16S rDNA高通量測序分析方法對黃化香樟土壤中的微生物群落進行分析，探索可能導致香樟黃化的土壤微生物誘因，從而為治理香樟黃化提供科學的解決辦法。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與土壤相關指標的測定

土壤樣品分非黃化香樟土壤、黃化香樟土壤、行道樹土壤樣品，非黃化香樟土壤樣品采自小區(qū)休憩公園(編號H0-1/0～20 cm土樣、H0-2/20～40 cm土樣)，黃化香樟土壤樣品采集于上海市奉賢區(qū)奉柘公路(編號H1-1/0～20 cm土樣、H1-2/20～40 cm土樣)、小區(qū)休憩公園(編號H3-1/0～20 cm土樣、H3-2/20～40 cm土樣)，香樟行道樹土壤采自奉賢主城區(qū)行道樹樹穴(編號H6-1/0～20 cm土樣，因樹穴土層堅硬，20～40 cm土樣未取)。樣品采集后作2份處理，1份置于冰箱4 ℃保存供微生物分析用，另1份風干粉碎過篩用于理化指標測定用。

1.2 樣品預處理與樣品總DNA提取

稱取200 mg的樣品，放入滅菌的2 mL離心管中，加入1 mL 70%乙醇，震蕩混勻，16 000g室溫離心3 min，棄置上層液體。加入1×PBS溶液，震蕩混勻，16 000g室溫離心3 min，棄上層液體。倒置2 mL離心管于吸水紙上1 min，直至沒有液體流出。將樣品管放入55 ℃烘箱10 min，使殘留乙醇完全揮發(fā)，保證后續(xù)實驗操作。具體提取步驟參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit使用說明書。瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性。

1.3 高通量測序

采用通用引物(341F/805R)對土樣細菌16S rDNA基因的V3～V4區(qū)擴增。PCR擴增體系為50 μL，其中含2×Taqmaster Mix 15 μL、Bar-PCR primer F(10 μmol·L-1) 1 μL、Primer R (10 μmol·L-1) 1 μL、Genomic DNA 10～20 ng，添加H2O至50 μL。PCR擴增的反應條件為：95 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量,以方便按照1∶1的等量混合后測序。PCR擴增產物利用生工生物工程(上海)股份有限公司的MiSeq PE300測定儀(Illumina Inc.San Diego.CA.USA)完成序列測定。

1.4 生物信息處理

利用Mothur(V.1.30.1)對原始DNA序列進行過濾處理，去除嵌合體，得到優(yōu)化序列；按照97%相似性將優(yōu)化序列劃分可操作分類單元(OTU)；基于OTU進行稀釋性曲線分析，并計算Chao1豐度指數、覆蓋度(Coverage)和Shannon多樣性指數。利用主成分分析法(PCA)分析各樣間OTU相似性。對比Silva(http://www.arb-silva.de/)16S rDNA、18S rDNA數據庫，采用RDP Classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并在各個分類水平上統(tǒng)計每個樣品的群落組成；利用冗余分析研究土壤化學指標與細菌群落的關系。

2 結果與分析

2.1 細菌群落多樣性差異

Shannon指數反映細菌群落alpha多樣性指數，Shannon值越大，說明細菌群落多樣性越高。由表1可知，非黃化香樟H0-1(0～20 cm)、H0-2(20～40 cm)的平均細菌群落多樣性高于H1-1(0～20 cm)、H1-2(20～40 cm)、H3-1(0～20 cm)、H3-2(20～40 cm)等黃化香樟土壤細菌多樣性平均值。H6-1(0～20 cm)由于為行道樹表層土壤，含有較高的外在添加有機質，促進土壤細菌多樣性較高。H6-1為香樟行道樹，長勢較弱。

表1 奉賢黃化香樟土壤細菌多樣性

2.2 黃化香樟土壤細菌屬水平分類

由圖1可以看出，不同樣點以及同一樣點不同深度土壤細菌群落結構組成均存在差異。非黃化香樟土壤H0-1、H0-2細菌群落結構組成相近，而黃化香樟(H1-1、H1-2與H3-1、H3-2)同一樣點不同深度土壤細菌群落結構差異性較大。微小桿菌屬在黃化香樟H3-2中分布最多。假單胞菌屬在表層H0-1中分布較多，深層H0-2中分布很少，跟黃化香樟土壤中的假單胞菌屬分布相反，表層土樣H1-1、H3-1中分布較少，深層土壤H1-2、H3-2中分布較多；假單胞菌屬中的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)為植物根際最普遍的微生物類群，作用機制主要有抗生素的作用、噬鐵素對鐵的營養(yǎng)競爭、有效的根際定殖等[8-10]；黃化香樟深層土壤假單胞菌屬相對數量高于表層土壤，表明深層土壤可能面臨病原真菌入侵、營養(yǎng)元素吸收困難等因素，從而激發(fā)假單胞菌屬的大量增殖。H1-1、H1-2、H3-2中存在一定數量的溶桿菌屬，H1-2、H3-2中存在鏈霉菌屬，鏈霉菌屬、溶桿菌屬對多種病原真菌、細菌和線蟲具有溶菌活性等典型特征[11-15]，表明黃化香樟土壤可能受到病原真菌、細菌或者線蟲的入侵，激發(fā)溶桿菌屬、鏈霉菌屬增加。檸檬酸桿菌屬、不動桿菌屬在H3-2中分布也較其他樣點多。貪銅菌屬在H1-2中分布最多，H1-2為奉柘公路兩側開放裸露土壤，車輛排放的重金屬滲入道路兩側深層土壤，從而可能促進土壤耐金屬貪銅菌屬數量的增加，貪銅菌屬具有轉化和耐受重金屬的功能[16-17]。同時H1-1、H1-2、H6-1中存在一定數量的鞘氨醇單胞菌屬，該菌具有降解多環(huán)芳烴的功能[18-20]，H1-1、H1-2為奉柘公路旁土壤，H6-1為行道樹土壤，兩者受石油烴和多環(huán)芳烴污染較重，促進了土壤鞘氨醇單胞菌屬的增殖，加速了有機污染物的降解。

色塊高度表示該細菌種類的相對含量，從下而上不同色塊依次表示為未分類細菌(unclassified bacteria)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、未命名(GP6)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、GP4、不動桿菌屬(Acinetobacter)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、溶桿菌屬(Lysobacter)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Latescibacteria、Kofleria、聚乙烯醇桿菌屬(Povalibacter)、Verrucomicrobia、馬賽菌屬(Massilia)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、沙單胞菌屬(Arenimonas)、Lacibacterium屬、Gp17、Gp7、硝化螺旋菌屬(Nitrospira)、GP16、小梨形菌屬(Pirellula)、Sulfuritalea屬等。圖1 土壤細菌屬水平分類

2.3 細菌群落與土壤化學指標的關系

由于鹽堿地植被受土壤pH、電導率、有機質影響較大，因此，在調查黃化香樟土壤性質時，選取pH、電導率、有機質3個化學指標。表2為采樣點土壤的化學指標：上海土壤偏鹽堿，奉賢區(qū)離海岸線較近，距離海岸線較近的為H1-1、H1-2，較遠的為H0-1、H0-2、H3-1、H3-2、H6-1；7個土壤樣品土壤pH均高于8，電導率介于0.05～0.20，土壤表層有機質含量介于6.26～23.45 g·kg-1。

表2 采樣點土壤的化學指標

由圖2可以看出，有機質對土壤細菌群落結構影響最大，電導率、pH次之。其中細菌群落結構與有機質、電導率多數呈正相關關系，與pH多數呈負相關關系。

圖2 基于OTU的細菌群落與土壤化學指標的冗余分析

3 小結與討論

物種多樣性是維持生態(tài)系統(tǒng)正常功能的前提條件，細菌群落的豐富性和多樣性在保證營養(yǎng)元素循環(huán)、有機物降解、重金屬形態(tài)轉化、土傳病害預防等方面具有重要的生態(tài)功能。本研究3種香樟土壤類型(非黃化、黃化、行道樹)中，土壤細菌群落多樣性為行道樹香樟>非黃化香樟>黃化香樟；黃化香樟的表層土壤細菌群落多樣性高于深層土壤。有機質含量對香樟土壤細菌群落結構影響最大，電導率、pH次之。不同類型香樟土壤細菌種類差異性顯著，與每種類型的土壤特性相關。黃化香樟深層土壤中含有一定豐度的假單胞菌屬、貪銅菌屬、鏈霉菌屬、溶桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬細菌，該些細菌種類與土壤有機污染物的降解、重金屬轉化和土傳病害預防緊密相關。同時，也表明香樟黃化或長勢不好除了與已研究表明的鐵元素缺乏有關外，可能與土壤中的污染物積累、土壤致病菌有關。通過冗余分析表明，有機質可以改變土壤細菌群落結構，因此，可以通過向土壤添加有機質，或者生物有機肥(不同功能菌群，如芳香烴降解菌、重金屬耐受菌、生防菌等)來改變土壤細菌群落結構，從微生物群落角度為香樟黃化治理提供一個可行的生物學方法。