薛亞軍 杜雅彥 黃文華 耿 濤 魏育濤 胡建明

(新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，石河子832000)

食管癌居世界癌癥死亡病因的第6位，我國食管癌發(fā)病率和死亡病例均占全球的50%和發(fā)展中國家的60%，是居民的重要疾病負(fù)擔(dān)，侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者治療失敗和死亡的主要原因[1]。針對食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的途徑進(jìn)行研究，抑制食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移是提高食管癌生存期的關(guān)鍵[2]。微小RNA(miRNAs)是一類在生物體內(nèi)普遍存在的單鏈非編碼蛋白質(zhì)小分子RNA，主要功能是調(diào)控生物體生長、發(fā)育、分化和凋亡等生命過程中的相關(guān)基因表達(dá)，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]。miR-143-3p是高度保守的miRNA，位于人5號染色體33位，是腫瘤生長的潛在調(diào)控因子，異常表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、膀胱癌、大腸癌等多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但其在食管癌增殖、遷移和侵襲中的作用尚未見報(bào)道[4,5]。本研究通過采用將miRNA-143-3p擬似物和阻遏物轉(zhuǎn)染食管癌ECA109細(xì)胞，探討miRNA-143-3p對食管癌ECA109細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人食管癌ECA109細(xì)胞株由本院腫瘤研究中心提供，采用含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)液。SPF級BALB/c裸鼠36只，3～4周齡，體質(zhì)量14～17 g，購于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，恒溫、恒濕飼養(yǎng)，采用隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物分為4組即空白組、陰性組、擬似組和阻遏組。

1.1.2試劑與儀器 胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自北京義翹神州科技有限公司；Trizol購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司；MTT、Transwell小室購自上海子起生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自廣州科適特科學(xué)儀器有限公司；RT-PCR試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；分光光度計(jì)購自托摩根生物科技有限公司；酶標(biāo)儀購自香港伯齊科技有限公司；PCR儀購自杭州厚澤生物科技有限公司；miRNA-143-3p擬似物、阻遏物、陰性對照物的合成、測序均由大連寶公司進(jìn)行。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的ECA109細(xì)胞，胰酶消化后1 000 g離心2 min，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/ml，接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔添加2 ml細(xì)胞懸液，37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，共分為4組，即空白對照組(Blank control group，空白組)只轉(zhuǎn)染試劑，陰性組轉(zhuǎn)染miRNA-143-3p陰性對照物，miRNA-143-3p擬似組轉(zhuǎn)染miRNA-143-3p擬似物，miRNA-143-3p阻遏組轉(zhuǎn)染miRNA145阻遏物，轉(zhuǎn)染過程按照Lipofectamine 2000說明進(jìn)行。

1.2.2RT轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)miRNA-143-3p表達(dá)檢測 轉(zhuǎn)染12、24、48、72 h后取細(xì)胞樣本，采用6孔板接種密度2×105個(gè)/孔，酚氯仿法抽取RNA，取2 μg總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，取2 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)模板，熒光定量法檢測miRNA-145含量，反應(yīng)條件：95℃變性10 s，58℃退火10 s，72℃延伸10 s，循環(huán)數(shù)設(shè)置為40。miR-143-3p的上下游引物序列分別為5′-GGGGTGAGATGAAGCACTG-3′及5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。

1.2.3不同組別細(xì)胞裸鼠成瘤能力和免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，給相應(yīng)分組的裸鼠注射細(xì)胞，隔2 d檢測裸鼠成瘤情況，記錄腫瘤體積和質(zhì)量；14 d 后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用免疫組化法檢測腫瘤中MAPK7表達(dá)情況，鏡下觀察顯色情況并拍照記錄。

1.2.4ECA109細(xì)胞株增殖活性檢測 轉(zhuǎn)染后48 h，胰酶消化法制備ECA109細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至96孔板中，每孔含1×104個(gè)/ml，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，接種后24、48、72 h每孔加入20 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，加入100 μl二甲基亞砜(Dimethyl sulphoxide,DMSO)溶解沉淀，震動(dòng)混勻沉淀15 min，酶標(biāo)儀比色，記錄490 nm處吸光度值。

1.2.5Transwell小室法檢測ECA109細(xì)胞株侵襲 取轉(zhuǎn)染后ECA109細(xì)胞株1×105ml-1，接種于Transwell板上室，每孔160 μl，加入20%五味子多糖(Alkaline S.chinensis polysaccharides,ASPS)血清40 μl，800 μl RPMI1640培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)基底膜下室細(xì)胞數(shù)，采用在400×顯微鏡下隨機(jī)選取中央和上下左右5個(gè)視野的穿越基底膜細(xì)胞數(shù)，取均值。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)miRNA-143-3p表達(dá) 12、24、48、72 h時(shí)空白組和陰性組細(xì)胞內(nèi)miRNA-143-3p表達(dá)相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均低于阻遏組，高于擬似組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2miRNA-143-3p轉(zhuǎn)染對ECA109細(xì)胞增殖的影響 空白組和陰性組24、48、72 h時(shí)ECA109細(xì)胞增殖水平相比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均高于擬似組，低于阻遏組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白組和陰性組ECA109細(xì)胞侵襲能力相比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均高于擬似組，低于阻遏組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 轉(zhuǎn)染后ECA109細(xì)胞內(nèi)miRNA-143-3p表達(dá)Fig.1 Expression of miRNA-143-3p in ECA109 cells after transfectionNote: *.P<0.05.

圖2 miRNA-143-3p轉(zhuǎn)染對ECA109細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

Fig.2 Effect of miRNA-143-3p transfection on prolife-ration and invasion of ECA109 cells

Note: *.P<0.05.

圖3 4組裸鼠瘤體大小變化情況

Fig.3 Changes of tumor size in 4 groups of nude mice

Note: *.P<0.05.

圖4 4組裸鼠瘤組織MAPK7蛋白表達(dá)情況Fig.4 Expression of MAPK7 protein in 4 groups of nude miceNote: *.P<0.05.

2.34組裸鼠瘤體大小變化情況 空白組和陰性組裸鼠瘤重量均高于擬似組，低于阻遏組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，空白組和陰性組裸鼠瘤重量相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

2.44組裸鼠瘤組織MAPK7蛋白表達(dá)情況 空白組和陰性組裸鼠瘤組織MAPK7蛋白表達(dá)水平相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均高于擬似組，低于阻遏組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

miRNA為非編碼的長約23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性微小RNA，可通過與靶信使RNA(messenger RNA，mRNA)的序列互補(bǔ)降低mRNA的穩(wěn)定性和抑制其翻譯，調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)。研究顯示，miRNA僅占人體基因組的1%～3%，但可調(diào)節(jié)30%的人類蛋白質(zhì)編碼[6,7]。miRNA對編碼蛋白質(zhì)基因的表達(dá)具有廣泛影響，并主要通過靶向mRNA 3′非翻譯端，負(fù)性調(diào)控靶mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，發(fā)揮類似于癌基因或抑癌基因的作用，在腎癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌等腫瘤中均存在miRNA表達(dá)[8-11]。

近年來，越來越多的研究顯示miRNA表達(dá)異常參與了EC的發(fā)生發(fā)展。Guo等[12]在研究食管鱗癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)中miRNA表達(dá)譜時(shí)發(fā)現(xiàn) miR-25、miR-424、miR-151表達(dá)上調(diào)，miR-100、miR-99a、miR-29c、miR-140表達(dá)下調(diào)，這些表達(dá)異常的miRNA能夠準(zhǔn)確區(qū)分ESCC和正常組織，進(jìn)一步對miRNA表達(dá)譜與EC臨床病理資料進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-25、miR-130b與EC的高中低分化有關(guān)。趙曉鴻等[13]利用miRNA芯片技術(shù)檢測了ESCC組織中miRNA表達(dá)譜的變化，顯示has-miR-25、has-miR-424和has-miR-151在癌組織中上調(diào)，miR-133a、miR-143、miR-145與miR-375在癌組織中下調(diào)，可能與食管黏膜上皮的癌變相關(guān)，且其改變是ESCC發(fā)生的早期事件。Liu等[14]研究顯示miR-143和miR-145可調(diào)節(jié)FSCN1而致癌，并參與轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)，可能為EC早期診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。Wu 等[15]檢測 86 例ESCC標(biāo)本中miRNAs 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-143和miR-145的表達(dá)水平顯著下調(diào)，并與腫瘤的浸潤深度有關(guān)，轉(zhuǎn)染miR-145、miR-133a和miR-133b抑制EC細(xì)胞增殖和浸潤。Akagi等[16]的研究證明了 miR-145 和 miR-143 的高表達(dá)與ESCC的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Kano等[17]的報(bào)告則證明了miR-145 的表達(dá)與ESCC的復(fù)發(fā)相關(guān)，并與患者的生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。本研究將miRNA-143-3p擬似物和阻遏物轉(zhuǎn)染至食管癌ECA109細(xì)胞株，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-143-3p擬似物的細(xì)胞株增殖、侵襲能力均顯著降低，轉(zhuǎn)染miRNA-143-3p阻遏組細(xì)胞株增殖、侵襲能力均顯著增高，因此miRNA的表達(dá)特征對于研究能夠識別EC的存在、侵襲和預(yù)后的腫瘤標(biāo)記物具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，miR-143下調(diào)與食管癌的增殖、侵襲和預(yù)后密切相關(guān)，但其作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究探討。

信號傳導(dǎo)通路異常貫穿于惡性腫瘤的增殖、分化、凋亡等各個(gè)階段，絲裂酶原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)是細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，包括5條并行MAPK信號通路，分別為ERK1/ERK2、JNK/SAPK、p38、ERK3/ERK4和ERK5，ERK5又稱為MAPK7，在腫瘤細(xì)胞的存活和生長過程中發(fā)揮重要作用[18]。MAPK7是非典型的MAPK通路，人類MAPK7是由816個(gè)氨基酸構(gòu)成的120 kU蛋白，可通過磷酸化和C端的物理性結(jié)合作用激活轉(zhuǎn)錄因子肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A(Myameba enhancement factor2A，MEF2A)、肌細(xì)胞特異性增強(qiáng)因子2D(Myocyte enhancement factor 2D,MEF2D)和肌細(xì)胞特異性增強(qiáng)因子2C(Myocyte enhancement factor 2C,MEF2C)，引起c-jun、BMK1等基因表達(dá)增加,在細(xì)胞分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)及多種疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[19]。研究顯示，MAPK7介導(dǎo)的信號對前列腺癌轉(zhuǎn)移癌模型具有明顯促進(jìn)作用[20-22]。在乳腺癌模型中，MAPK7可介導(dǎo)乳腺腫瘤激酶激活，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；肝癌中MAPK7的過度表達(dá)可促進(jìn)有絲分裂和肝癌細(xì)胞生長。李進(jìn)科等[23]對64例食管鱗狀細(xì)胞癌組織采用免疫組化方法檢測食管癌和癌旁組織中MAPK7表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MPAK7在食管癌組織中表達(dá)顯著升高，且表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miRNA-143-3p擬似物的瘤體積顯著降低，MAPK7表達(dá)升高，轉(zhuǎn)染miRNA-143-3p阻遏物的瘤質(zhì)量體積則顯著降低，MAPK7表達(dá)降低，提示miRNA-143-3p可能通過MAPK7途徑影響食管癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miRNA-143-3p表達(dá)異常是影響食管癌增殖侵襲的重要因素，MAPK7信號通路可能是其發(fā)揮作用的重要途徑，詳細(xì)機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究探討。