王如華 李勇華 龍 明 鄒 飛 肖明力

(重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校普外科，重慶404000)

機(jī)體創(chuàng)傷后處于應(yīng)激狀態(tài)，免疫反應(yīng)和代謝發(fā)生改變。腸道是應(yīng)激反應(yīng)的一個(gè)中心器官，人們對腸道黏膜免疫越來越重視[1]。腸內(nèi)營養(yǎng)對保護(hù)腸屏障功能發(fā)揮重要作用，普通腸內(nèi)營養(yǎng)可較好地治療單純的營養(yǎng)不良，但無法改善應(yīng)激狀態(tài)下腸黏膜免疫功能下降的情況。有研究者提出，通過在普通營養(yǎng)液中添加一些特殊的營養(yǎng)素能改善腸道黏膜功能，提高免疫反應(yīng)[2]。中醫(yī)藥在黏膜免疫系統(tǒng)中的應(yīng)用和開發(fā)是近年來的研究熱點(diǎn)。黃芪是我國傳統(tǒng)的中藥材之一，具有增強(qiáng)免疫、保肝、利尿、抗衰老、抗應(yīng)激、降壓和抗菌等作用[3-5]。黃芪勻漿膳是將黃芪水煎液加入勻漿膳中，所含營養(yǎng)成分與正常食物相似，因其已被粉碎，滲透濃度低，所以利于消化吸收且對腸道無刺激，為機(jī)體提供足夠能量和所需營養(yǎng)素之外，還能提高機(jī)體的免疫能力。前期，本課題組已研究發(fā)現(xiàn)，黃芪勻漿膳可提高創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠腸黏膜免疫功能[6]，但黃芪勻漿膳改善創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠腸黏膜免疫功能的作用機(jī)制還不清楚。NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體途徑是機(jī)體發(fā)揮免疫功能的重要途徑之一。NLRP3炎癥小體受到刺激后，可調(diào)控效應(yīng)蛋白caspase-1活化，分解成caspase-1片段，促進(jìn)IL-1β和IL-18的成熟與釋放，加劇炎癥反應(yīng)，參與炎癥和免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[7-9]。本研究通過構(gòu)建創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠模型，觀察黃芪勻漿膳對創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠腸黏膜淋巴細(xì)胞亞群、炎性細(xì)胞因子、NLRP3炎癥小體通路相關(guān)因子IL-1β和IL-18，以及NLRP3、蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(Apoptosis associated speck-like protein，ASC)、cleaved-caspase-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，初步探討黃芪勻漿膳提高機(jī)體腸黏膜免疫功能的可能機(jī)制，為黃芪勻漿膳在營養(yǎng)保健等領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康成年雄性SD大鼠72只，清潔級，體重180～250 g，由中南大學(xué)醫(yī)學(xué)動物部提供。本研究經(jīng)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑和儀器 NLRP3激活劑尿酸單鈉鹽(Monosodium urate，MSU)購自Abcam公司，使用時(shí)用PBS溶解。分泌型免疫球蛋白SIgA、IL-2、IL-4、IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、腫瘤壞死因子-γ(IFN-γ)、IL-1β和IL-18試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。大鼠抗小鼠CD3+、CD4+、CD8+和CD19+單克隆抗體購自美國Biolegend公司。β-actin單克隆抗體購自北京中杉金橋生物公司。NLRP3和cleaved-caspase-1抗體購自英國Abcam公司。ASC抗體購自美國CST公司。BCA蛋白測定試劑盒和Western blot相關(guān)試劑均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。流式細(xì)胞儀美國貝克曼公司。WB電泳儀、電泳槽和凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司。Mx3000p RT-PCR分析系統(tǒng)為美國安捷倫公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及創(chuàng)傷大鼠模型建立 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：空白組、模型組、黃芪勻漿膳組、NLRP3激活劑組、NLRP3激活劑+黃芪勻漿膳組，每組12只。禁食不禁水12 h，除空白組外，其他各組大鼠均用1%的氯胺酮麻醉后俯臥，備皮消毒，切開雙側(cè)下背部皮膚，行雙側(cè)股骨離斷術(shù)，縫合皮膚后將大鼠仰臥無菌剖腹，在胃前壁置入內(nèi)徑為 1.6 mm 帶有側(cè)孔的硅膠管，雙荷包固定縫合，經(jīng)皮下隧道穿出，固定輸液裝置固定于肩胛間皮膚處?？瞻讓φ战M：代謝籠內(nèi)正常進(jìn)食；模型組：創(chuàng)傷后3～5 h開始正常進(jìn)食；黃芪勻漿膳組：創(chuàng)傷后3～5 h 開始服用黃芪水煎液加勻漿膳，勻漿膳由牛奶、雞蛋、瘦肉、大豆、饅頭等食物組成，經(jīng)膠體磨加工，由韓國生產(chǎn)的中藥煎藥機(jī)蒸煮包裝(100 ml勻漿膳含熱量為418.4 kJ，蛋白質(zhì)5.0 g、碳水化合物13.0 g、脂肪 3.0 g)，黃芪水煎液分別相當(dāng)于原生藥20 g/kg的劑量，勻漿膳用量為837 kJ(200 kcal)/(kg· d)，4次/d；NLRP3激活劑組：尾靜脈注射尿酸單鈉鹽的PBS溶液；NLRP3激活劑+黃芪勻漿膳組：尾靜脈注射尿酸單鈉鹽的PBS溶液后，服用黃芪水煎液加勻漿膳，用法和用量同黃芪勻漿膳組。

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+和CD19+創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠營養(yǎng)支持14 d后，禁食12 h，脫頸椎處死。參考文獻(xiàn)[10]分離小腸黏膜固有層淋巴細(xì)胞。取5×105個(gè)分離獲得的淋巴細(xì)胞，分別與大鼠抗小鼠CD3+、CD4+、CD8+和CD19+單克隆抗體孵育(4℃，50 min)，4%大鼠血清封閉非特異抗原，離心洗脫2遍后，與APC二抗孵育10 min，離心漂洗后流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3ELISA法檢測小腸黏膜淋巴細(xì)胞因子表達(dá)和SIgA含量測定 參照文獻(xiàn)方法[11]，用鑷子與剪刀小心取出靠近十二指腸段空腸約3 cm，稱重，刮取腸黏膜組織。將腸黏膜組織制成勻漿，離心(3 500 g，25 min)，收集上清液-20℃保存。采用ELISA法按照試劑盒說明檢測上清液中SIgA、IL-2、IL-4、IL-6、TGF-β、IFN-γ、IL-1β、IL-18的濃度。

1.2.4RT-PCR檢測腸黏膜組織NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1 mRNA表達(dá) 用Trizol裂解腸黏膜組織，經(jīng)氯仿抽提、異丙醇沉淀、75%乙醇洗滌后使用DEPC水溶解，分光光度計(jì)測定總RNA含量和純度。然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照熒光定量試劑盒說明操作，置于定量PCR儀檢測。反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 1 min，72℃ 30 s，總共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)水平。內(nèi)參、NLRP3、ASC和cleaved-caspase-1引物序列如表1所示。

1.2.5Western blot檢測腸黏膜組織NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1蛋白表達(dá) 分別取0.1 g各實(shí)驗(yàn)組腸黏膜組織，加入RIPA組織裂解液(含0.01 mmol/L PMSF)，在冰上充分裂解30 min。然后離心(4℃、12 000 g，5 min)，收集上清，BCA法測定蛋白濃度。取一定量蛋白樣品加入上樣緩沖液，100℃煮沸 5 min，離心(5 000 g，5 min)。進(jìn)行SDS-PAGE，待溴酚藍(lán)至膠底，Marker完全分開電泳結(jié)束。采用半干轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行恒壓轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后，用適當(dāng)TBST沖洗PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。TBST清洗后加入一抗，4℃孵育過夜。TBST清洗后加入二抗，室溫下放置2 h。TBST洗滌后加入ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，拍照。以β-actin為內(nèi)參，用Image pro plus 7.0軟件分析各蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1淋巴細(xì)胞亞群比較 與空白對照組相比，模型組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+和CD19+顯著降低(P<0.05)，CD8+無明顯變化(P>0.05)。與模型組相比，黃芪勻漿膳組、NLRP3激活劑+黃芪勻漿膳組

CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均顯著升高(P<0.05)，CD8+無明顯變化(P>0.05)；NLRP3激活劑組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+顯著降低(P<0.05)，CD8+無明顯變化(P>0.05)。與NLRP3激活劑組相比，NLRP3激活劑+黃芪勻漿膳組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+和CD19+均顯著升高(P<0.05)，CD8+無明顯變化(P>0.05)。結(jié)果如表2所示。

2.2小腸黏膜淋巴細(xì)胞因子和SIgA含量比較 與空白對照組相比，模型組SIgA、IL-2、IL-4、IFN-γ和TGF-β顯著降低(P<0.05)，IL-6、IL-1β和IL-18顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，黃芪勻漿膳組、NLRP3激活劑+黃芪勻漿膳組SIgA、IL-2、IL-4、IFN-γ、TGF-β均顯著升高(P<0.05)，IL-6、IL-1β和IL-18均顯著降低(P<0.05)；NLRP3激活劑組SIgA、IL-2、IL-4、IFN-γ和TGF-β顯著降低(P<0.05)，IL-6、IL-1β和IL-18顯著升高(P<0.05)。與NLRP3激活劑組比，NLRP3激活劑+黃芪勻漿膳組SIgA、IL-2、IL-4、IFN-γ、TGF-β均顯著升高(P<0.05)，IL-6、IL-1β和IL-18均顯著降低(P<0.05)。結(jié)果如表3所示。

表1 β-actin、NLRP3、ASC和cleaved-caspase-1引物序列

Tab.1 β-actin，NLRP3,ASC and cleaved-caspase-1 primer sequence

GenePrimersβ-actinUpsteams 5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′Downstreams 5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′NLRP3Upsteams 5′-TCTGTTCATTGGCTGCGGA-3′Downstreams 5′-GCCTTTTTCGAACTTGCCGT-3′ASCUpsteams 5′-GCTGCAGATGGACCCCATAG-3′Downstreams 5′-ACATTGTGAGCTCCAAGCCA-3′cleaved-caspase-1Upsteams 5′-CACGAGACCTGTGCGATCAT-3′Downstreams 5′-CTTGAGGGAACCACTCGTC-3′

表2 淋巴細(xì)胞亞群比較

Tab.2 Comparison of lymphocyte subsets

Groups CD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+CD19+(%)Blank control group57.69±1.0647.93±2.3622.26±2.042.15±0.1211.36±1.06Model group49.35±0.961)35.25±2.711)21.06±1.531.67±0.111)9.11±1.051)Homogenate diet group56.91±0.952)46.39±2.612)22.61±1.912.05±0.082)11.35±0.962)NLRP3 activator group45.02±0.812)30.34±2.512)21.04±1.481.44±0.122)8.03±0.97NLRP3 activator+Astragalushomogenate diet group53.35±0.822)3)40.89±2.512)3)22.02±1.611.86±0.052)3)10.94±1.112)3)

Note：Compared with blank control group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05；compared with NLRP3 activator group,3)P<0.05.

表3 小腸黏膜淋巴細(xì)胞因子和SIgA含量比較

Tab.3 Intestinal mucosal lymphocyte factor and SIgA content

GroupsSIgA(mg/g)IL-2(ng/g)IL-4(ng/g)IL-6(ng/g)Blank control group1.95±0.2139.25±4.7517.62±1.8510.54±1.39Model group1.26±0.131)24.31±2.651)14.29±1.081)16.17±1.581)Homogenate diet group1.86±0.172)37.62±4.532)16.93±1.742)11.89±1.422)NLRP3 activator group1.01±0.0920.05±2.3711.08±1.0019.01±1.72NLRP3 activator+Astragalus homogenate diet group1.64±0.142)3)32.13±4.212)3)15.29±1.372)3)14.92±1.352)3)Groups TGF-β(ng/g)IFN-γ(ng/g)IL-1β(pg/ml)IL-18(pg/ml)Blank control group90.37±8.29105.26±6.342.62±0.86101.31±10.25Model group36.19±5.911)85.83±4.241)7.51±1.211)190.26±21.311)Homogenate diet group86.49±7.922)101.17±5.192)3.15±0.812)129.14±11.952)NLRP3 activator group31.15±5.8980.87±4.267.06±1.19201.76±21.03NLRP3 activator+Astragalus homogenate diet group70.74±7.082)3)92.58±4.872)3)5.69±0.912)3)162.24±14.592)3)

Note：Compared with blank control group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05；compared with NLRP3 activator group,3)P<0.05.

圖1 腸黏膜組織NLRP3、ASC和cleaved-caspase-1 mRNA表達(dá)比較Fig.1 Comparison of expression of NLRP3,ASC and cleaved-caspase-1 in intestinal mucosaNote: A,B,C,D,E and F were respectively expressed as blank control group,Model group,homogenate diet group,NLRP3 activator group,NLRP3 activator+Astragalus homogenate diet group.Compared with blank control group,*.P<0.05；compared with model group,#.P<0.05；compared with NLRP3 activator group,▲.P<0.05.

2.3腸黏膜組織NLRP3、ASC和cleaved-caspase-1 mRNA表達(dá) 與空白對照組相比，模型組NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1 mRNA均顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，黃芪勻漿膳組、NLRP3激活劑+黃芪勻漿膳組NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1 mRNA均顯著降低(P<0.05)；NLRP3激活劑組NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1 mRNA顯著升高(P<0.05)。與NLRP3激活劑組相比，NLRP3激活劑+黃芪勻漿膳組NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1 mRNA均顯著降低(P<0.05)。結(jié)果如圖1所示。

圖2 NLRP3、ASC和cleaved-caspase-1蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of NLRP3,ASC and cleaved-caspase-1Note: A,B,C,D,E and F were respectively expressed as blank control group,Model group,homogenate diet group,NLRP3 activator group,NLRP3 activator+Astragalus blenderized diet group.Compared with blank control group,*.P<0.05；compared with model group,#.P<0.05；compared with NLRP3 activator group,▲.P<0.05.

2.4腸黏膜組織NLRP3、ASC和cleaved-caspase-1蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1 蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，黃芪勻漿膳組、NLRP3激活劑+黃芪勻漿膳組NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1 蛋白均顯著降低(P<0.05)；NLRP3激活劑組NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1 蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與NLRP3激活劑組比，NLRP3激活劑+黃芪勻漿膳組NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1 蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。結(jié)果如圖2所示。

3 討論

手術(shù)和創(chuàng)傷后機(jī)體常處于應(yīng)激狀態(tài)，腸道是應(yīng)激反應(yīng)的中心器官之一，腸黏膜免疫在現(xiàn)代免疫預(yù)防中處于中心地位。近年來，研究者們對中醫(yī)藥在黏膜免疫系統(tǒng)中的應(yīng)用和開發(fā)越來越關(guān)注。黃芪是我國常用的傳統(tǒng)中藥材。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪可改善免疫功能低下大鼠的肝損傷，提高大鼠免疫力[12]。腸內(nèi)營養(yǎng)添加黃芪可改善燒傷早期免疫功能低下[13]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，黃芪勻漿膳可改善創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠腸黏膜免疫功能，但其發(fā)揮作用的機(jī)制還未知。本研究基于NLRP3炎癥小體通路初步探討了黃芪勻漿膳提高創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠腸黏膜免疫功能的作用途徑。

黏膜免疫功能主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞水平、細(xì)胞因子水平和以SIgA為主的腸道水平黏膜3種免疫機(jī)制發(fā)揮免疫作用。CD3+是成熟T淋巴細(xì)胞的標(biāo)志，能反映細(xì)胞免疫功能水平[14]。CD4+T細(xì)胞通過識別抗原表位并被活化，產(chǎn)生細(xì)胞因子，增殖和分化成效應(yīng)細(xì)胞促進(jìn)、抑制和調(diào)節(jié)對蛋白抗原的免疫反應(yīng)，以及通過接觸靶細(xì)胞釋放信號，使靶細(xì)胞和細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。CD8+細(xì)胞是細(xì)胞毒T細(xì)胞，通過與靶細(xì)胞的接觸，對靶細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。機(jī)體在創(chuàng)傷、焦慮、應(yīng)激后細(xì)胞免疫功能降低，CD3+和CD4+減少，CD4+/CD8+比率下降[16]。CD19+是B細(xì)胞表面Ⅰ型跨膜蛋白，屬免疫球蛋白超家族成員，CD19+B細(xì)胞減少時(shí)血清免疫球蛋白水平降低，體液免疫反應(yīng)低下[17]。本研究結(jié)果顯示，模型組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+和CD19+較空白對照組顯著降低，黃芪勻漿膳組較模型組CD3+、CD4+、CD19+水平以及CD4+/CD8+值顯著提高，說明黃芪勻漿膳可有效提高創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠淋巴細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。

分泌型免疫球蛋白SIgA是腸黏膜免疫的主要效應(yīng)因子，能有效抑制病原體等有害物質(zhì)的入侵，發(fā)揮調(diào)節(jié)吞噬和溶解作用[18]。SIgA介導(dǎo)的免疫應(yīng)答依賴于T細(xì)胞的輔助，T細(xì)胞分泌的Th1細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ、TGF-β)與Th2細(xì)胞因子(IL-4、IL-6)可相互調(diào)節(jié)，維持黏膜SIgA Th1/Th2系統(tǒng)平衡[19,20]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠SIgA、IL-2、IL-4、IFN-γ和TGF-β較空白對照組顯著降低，IL-6顯著升高，說明大鼠創(chuàng)傷后機(jī)體促炎和抗炎細(xì)胞因子不平衡，免疫功能低下。與模型組相比，黃芪勻漿膳組SIgA、IL-2、IL-4、IFN-γ、TGF-β均顯著升高，IL-6顯著降低，說明創(chuàng)傷后給予大鼠黃芪勻漿膳可促進(jìn)促炎和抗炎細(xì)胞因子平衡，提高機(jī)體腸黏膜免疫功能。

NLRP3炎癥小體是由NLRP3、ASC和caspase-1組成的大分子蛋白復(fù)合物，在人體T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮核心作用[21]。NLRP3炎癥小體在受到刺激后，可活化效應(yīng)蛋白caspase-1，進(jìn)而促進(jìn)IL-1β和IL-18的成熟與釋放，加劇炎癥反應(yīng)，參與免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[22，23]。本研究結(jié)果顯示，模型組NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1 mRNA和蛋白表達(dá)較空白對照組顯著增加，黃芪勻漿膳組NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1 mRNA和蛋白表達(dá)較模型組顯著降低；加入NLRP3抑制劑后，黃芪勻漿膳抑制NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1 mRNA和蛋白表達(dá)的作用降低，提示黃芪勻漿膳可能通過抑制NLRP3炎癥小體通路改善創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠的腸黏膜免疫功能。各實(shí)驗(yàn)組IL-1β和IL-18表達(dá)變化情況與NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1 mRNA和蛋白變化情況一致，進(jìn)一步說明黃芪勻漿膳可能通過NLRP3炎癥小體通路減輕創(chuàng)傷大鼠腸黏膜免疫損傷，改善免疫功能。

綜上所述，黃芪勻漿膳可調(diào)節(jié)創(chuàng)傷大鼠腸黏膜淋巴細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子，降低NLRP3炎癥小體通路NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1 mRNA和蛋白表達(dá)，提示其可能通過抑制NLRP3炎癥小體通路激活提高創(chuàng)傷應(yīng)激大鼠的腸黏膜免疫功能，且其作用要強(qiáng)于腸內(nèi)營養(yǎng)多聚合劑，具有開發(fā)成中醫(yī)藥特色的腸內(nèi)營養(yǎng)制劑的巨大潛力。