王昭懿，張 鯤，周麗媛，程 嬌，溫 凱，于 梅

（山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250100）

枯草芽孢桿菌是一種典型的革蘭氏陽性好氧菌，具有很強(qiáng)的酶活性，并且對(duì)人畜安全，是一種環(huán)境友好型菌種且能形成芽孢[1]。芽孢作為一種休眠體，能經(jīng)受高溫、干燥、紫外線、多種化學(xué)物質(zhì)及電離輻射等逆境[2]，自由存在的芽孢作為一種隱藏的生命，一旦環(huán)境條件合適，芽孢便可以萌發(fā)成營養(yǎng)細(xì)胞。研究表明，枯草芽孢桿菌的芽孢進(jìn)入動(dòng)物腸道中，便能迅速萌發(fā)成具有新陳代謝作用的營養(yǎng)型細(xì)胞，這種營養(yǎng)型細(xì)胞能在動(dòng)物體內(nèi)分泌多種消化酶、維生素及氨基酸等物質(zhì)，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，改善動(dòng)物的健康水平和生產(chǎn)性能[3-6]。因此，添加枯草芽孢桿菌制成益生菌制劑，被廣泛應(yīng)用于畜禽飼料工業(yè)。而飼用益生菌制劑是以有效的活菌數(shù)作為重要指標(biāo)，產(chǎn)品中必須含有相當(dāng)數(shù)量的活菌才能發(fā)揮作用。但是，隨著保存時(shí)間的延長，活菌數(shù)量不斷減少，其有效活菌數(shù)降低，影響其使用效果[7]。但枯草芽孢桿菌所特有的芽孢擁有非常驚人的休眠能力，普通條件下可保存幾年至幾十年的活性，可有效延長貯存期。

然而枯草芽孢桿菌飼用益生菌制劑芽孢產(chǎn)率低的問題依舊存在。并且國內(nèi)枯草芽孢桿菌多采用固體發(fā)酵方式[8-10]進(jìn)行生產(chǎn)，原料成本高、靈活性差，不便于機(jī)械化生產(chǎn)，而且菌體存活率和芽孢產(chǎn)率相對(duì)較低[11]。相較而言，液體發(fā)酵技術(shù)所采用的培養(yǎng)基原料來源廣泛、價(jià)格低廉，生產(chǎn)效率高，更有利于大規(guī)模生產(chǎn)，開發(fā)潛力大[12-13]。

通過優(yōu)化枯草芽孢桿菌液體培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件，以期獲得較高芽孢產(chǎn)率保證菌體活性，為飼用益生菌制劑生產(chǎn)企業(yè)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和培養(yǎng)基

菌種：枯草芽孢桿菌，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)中韓食品研究中心提供。

菌種活化培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂（NA） 3.3 g，無水氯化鈣0.005 g，七水硫酸鎂0.01 g，四水氯化錳0.01 g，蒸餾水100 mL。

液體種子培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯（NB） 1.8 g， 無水氯化鈣0.007 5 g，七水硫酸鎂0.01 g，四水氯化錳0.02 g，蒸餾水100 mL。

1.1.2 儀器和試劑

YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器、HPX-9272MBE型電熱恒溫培養(yǎng)箱、JHT系列凈化工作臺(tái)、B203LED型生物顯微鏡、SHA-C型水浴恒溫振蕩器。試驗(yàn)所用試劑均為國產(chǎn)分析純，所用水均為二次蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

將放置在4℃冰箱內(nèi)保藏的枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)接至固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在45℃恒溫下培養(yǎng)24 h。

1.2.2 液體培養(yǎng)

沖洗固體平板，將活化后菌種轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基中，按照液體基礎(chǔ)培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。

液體基礎(chǔ)培養(yǎng)條件：轉(zhuǎn)速100 r/min，溫度45℃，初始pH值7，接種量2%，裝液量100 mL/250 mL，培養(yǎng)時(shí)間3 d。

1.2.3 鏡檢

固體培養(yǎng)：利用五點(diǎn)取樣法從固體平板中取菌至無菌離心管內(nèi)，制成菌懸液搖勻待用。

液體培養(yǎng)：吸取200μL菌體至無菌離心管內(nèi)，制成菌懸液搖勻待用。

蘸取菌懸液至載玻片上，火焰固定，滴適量孔雀石綠，染色5 min，沖洗，待干后滴入適量番紅染液染色5 min，沖洗晾干待用。

在100倍油鏡下記錄細(xì)菌數(shù)與芽孢數(shù)，計(jì)算芽孢產(chǎn)率。

芽孢產(chǎn)率計(jì)算方法見公式（1）。

式中：A——芽孢產(chǎn)率，%；

a——芽孢個(gè)數(shù)，106CFU/mL；

b——菌體個(gè)數(shù)，106CFU/mL。

1.3 設(shè)計(jì)

1.3.1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化單因素試驗(yàn)

（1） 不同MnCl2·4H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響。選取 5個(gè) MnCl2·4H2O 用量 0.30，0.35，0.40，0.45，0.50 g，置于100 mL培養(yǎng)基，按照基礎(chǔ)培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，染色鏡檢，記錄芽孢數(shù)和菌體數(shù)，計(jì)算芽孢產(chǎn)率。

（2） 不同MgSO4·7H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響。選取 5 個(gè) MgSO4·7H2O用量 0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 g，置于100 mL培養(yǎng)基，按照基礎(chǔ)培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，染色鏡檢，記錄芽孢數(shù)和菌體數(shù)，計(jì)算芽孢產(chǎn)率。

（3） 不同CaCl2用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響。選取6個(gè)不同 CaCl2用量 0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 g置于100 mL培養(yǎng)基，按照基礎(chǔ)培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，染色鏡檢，記錄芽孢數(shù)和菌體數(shù)，計(jì)算芽孢產(chǎn)率。

（4） 不同K2HPO4·3H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響。選取 6 個(gè) K2HPO4·3H2O 用量 0，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 g，置于100 mL培養(yǎng)基，按照基礎(chǔ)培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，染色鏡檢，記錄芽孢數(shù)和菌體數(shù)，計(jì)算芽孢產(chǎn)率。

1.3.2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果以芽孢產(chǎn)率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，確定最適培養(yǎng)基配方。

1.3.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

（1） 不同初始pH值對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響。選取4，5，6，7，8，9為初始pH值。使用1.3.2所得最佳培養(yǎng)基配方，按照基礎(chǔ)培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，染色鏡檢，記錄芽孢數(shù)和菌體數(shù)，計(jì)算芽孢產(chǎn)率。

（2）不同裝液量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響。選取50，75，100，125，150，250 mL 6種裝液量。使用1.3.2所得最佳培養(yǎng)基配方，按照液體培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，染色鏡檢，記錄芽孢數(shù)和菌體數(shù)，計(jì)算芽孢產(chǎn)率。

（3）不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響。選取1，2，3，4，5 d 5種培養(yǎng)時(shí)間。使用1.3.2所得最佳培養(yǎng)基配方，按照液體培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，染色鏡檢，記錄芽孢數(shù)和菌體數(shù)，計(jì)算芽孢產(chǎn)率。

（4） 不同接種量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響。選取1%，2%，4%，6%，8%，10%6種接種量。使用1.3.2所得最佳培養(yǎng)基配方，按照液體培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，染色鏡檢，記錄芽孢數(shù)和菌體數(shù)，計(jì)算芽孢產(chǎn)率。

1.3.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果以芽孢產(chǎn)率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，確定最適液體培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同MnCl2·4H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

錳離子是細(xì)胞中許多酶的激活劑，有利于枯草芽孢桿菌芽孢的生成[13]。

不同MnCl2·4H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響見圖1。

由圖1可知，隨著MnCl2·4H2O用量的增加，枯草芽孢桿菌芽孢產(chǎn)率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。MnCl2·4H2O用量達(dá)到0.45 g時(shí)，芽孢產(chǎn)率達(dá)到48.1%，對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢的生長顯現(xiàn)促進(jìn)作用。因此，選取MnCl2·4H2O最佳用量為0.45 g。

圖1 不同MnCl2·4H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

2.1.2 不同MgSO4·7H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

鎂離子和硫離子，作為細(xì)胞中重要的酶激活劑，隨著添加量的變化會(huì)對(duì)菌體及芽孢的生長會(huì)產(chǎn)生不同的影響，根據(jù)結(jié)果分析枯草芽孢桿菌產(chǎn)率變化。

不同MgSO4·7H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響見圖2。

圖2 不同MgSO4·7H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

由圖2可知，當(dāng)MgSO4·7H2O用量為0.5 g時(shí)，芽孢產(chǎn)率達(dá)到55.2%，使芽孢產(chǎn)率得到顯著提升。但超過此用量，芽孢產(chǎn)率便開始降低，對(duì)芽孢生長產(chǎn)生不利影響。因此，選取MgSO4·7H2O最佳用量為0.5 g。

2.1.3 不同CaCl2用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

鈣離子是某些胞外酶的穩(wěn)定劑、蛋白酶等的輔因子，也是細(xì)菌形成芽孢和某些真菌形成孢子所需要的重要元素[14]，分析枯草芽孢產(chǎn)率的變化。

不同CaCl2用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響見圖3。

圖3 不同CaCl2用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，隨著CaCl2用量升高，菌種產(chǎn)芽孢數(shù)量越多，芽孢產(chǎn)率也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。用量升至0.15g時(shí)，芽孢產(chǎn)率高達(dá)57.7%，對(duì)芽孢生長具有明顯促進(jìn)作用；當(dāng)繼續(xù)增加用量，該無機(jī)鹽對(duì)芽孢生長開始出現(xiàn)抑制作用，不利于芽孢產(chǎn)率的提升。因此，CaCl2最佳添加量為0.15 g。

2.1.4 不同K2HPO4·3H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

不同K2HPO4·3H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響見圖4。

圖4 不同K2HPO4·3H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

由圖4可知，最適K2HPO4·3H2O用量為0.2 g，此時(shí)芽孢產(chǎn)率為59.3%，對(duì)芽孢生長起到顯著促進(jìn)作用，用量過高或過低都不利于芽孢的生長，所以選擇K2HPO4·3H2O最佳用量為0.2 g。

2.2 最適生長培養(yǎng)基確定

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，以芽孢產(chǎn)率為指標(biāo)考查錳離子、鎂離子、鈣離子、鉀離子的不同用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響，設(shè)計(jì)四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，確定最適培養(yǎng)基條件。

L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 L（934）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)/g

L9（34）正交設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，SPSS方差分析結(jié)果見表3。

表2 L9（34）正交設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2可知，極差R值的大小為D＞B＞C＞A，即影響枯草芽孢桿菌芽孢產(chǎn)率的主次順序?yàn)殁涬x子＞鎂離子＞鈣離子＞錳離子；正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果（表3） 顯示，各因素各水平差異極顯著（p＜0.01），得出A1B1C2D3為最優(yōu)水平。

表3 SPSS方差分析結(jié)果

對(duì)最優(yōu)水平A1B1C2D3與試驗(yàn)結(jié)果最優(yōu)A2B1C2D3進(jìn)行驗(yàn)證對(duì)比試驗(yàn)，A1B1C2D3的芽孢產(chǎn)率為64.8%，A2B1C2D3的芽孢產(chǎn)率為64.59%，表明A1B1C2D3的液體培養(yǎng)基更佳，最佳培養(yǎng)基組合為每100 mL培養(yǎng)基中錳離子0.4 g，鎂離子0.4 g，鈣離子0.15 g，鉀離子0.3 g。

2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 不同初始pH值對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

不同初始pH值對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響見圖5。

圖5 不同初始pH值對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

由圖5可知，隨著培養(yǎng)基初始pH值的增加，產(chǎn)孢率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，pH值為7時(shí)芽孢產(chǎn)率最大達(dá)64%，pH值過高或過低培養(yǎng)條件下芽孢產(chǎn)率均偏低，得出液體培養(yǎng)最優(yōu)pH值為7。

2.3.2 不同裝液量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

不同裝液量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響見圖6。

圖6 不同裝液量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

由圖6可知，隨著裝液量的增加，產(chǎn)孢率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；最適液體培養(yǎng)枯草芽孢桿菌芽孢生長的裝液量為100 mL/250 mL，此時(shí)枯草芽孢桿菌芽孢產(chǎn)率最大，為65%。

2.3.3 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響見圖7。

圖7 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

由圖7可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，產(chǎn)孢率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，最適液體培養(yǎng)枯草芽孢桿菌芽孢生長的培養(yǎng)時(shí)間為3 d，此時(shí)枯草芽孢桿菌芽孢產(chǎn)率最大，為67.7%。

2.3.4 不同接種量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

不同接種量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響見圖8。

圖8 不同接種量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

由圖8可知，隨著接種量的增加，產(chǎn)孢產(chǎn)率出現(xiàn)2個(gè)峰值，即接種量為2%時(shí)芽孢產(chǎn)率為68.6%，接種量為8%時(shí)芽孢產(chǎn)率為66.7%，考慮節(jié)省成本，選取2%為最佳接種量。

2.4 最適培養(yǎng)條件確定

設(shè)計(jì)四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，確定最適培養(yǎng)條件。

L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表4。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5，SPSS方差分析結(jié)果見表6。

由表 5 可知，極差 R'值大小為 B'＞D'＞C'＞A'，即影響枯草芽孢桿菌芽孢產(chǎn)率的主次順序?yàn)榻臃N量＞培養(yǎng)時(shí)間＞初始pH值＞裝液量；正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果顯示，除裝液量外，各因素各水平差異極顯著（p＜0.01），得出 A'3B'3C'2D'2為最優(yōu)水平。

表5 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 SPSS方差分析結(jié)果

對(duì)最優(yōu)水平A'3B'3C'2D'2與試驗(yàn)結(jié)果最優(yōu)A'3B'3C'2D'1進(jìn)行驗(yàn)證對(duì)比試驗(yàn)，A'3B'3C'2D'2的芽孢產(chǎn)率為72.10%，A'3B'3C'2D'1的芽孢產(chǎn)率為70.50%，表明A'3B'3C'2D'2的液體培養(yǎng)條件更佳，即最優(yōu)培養(yǎng)條件組合為裝液量125 mL/250 mL，接種量4%，初始pH值7，培養(yǎng)時(shí)間3 d。

3 結(jié)論

枯草芽孢桿菌芽孢生長的培養(yǎng)基配方為營養(yǎng)肉湯1.8 g，無水氯化鈣0.15 g，七水硫酸鎂0.40 g，四水氯化錳0.40 g，硫酸氫二鉀0.30 g每100 mL培養(yǎng)基；最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)條件為初始pH值7，裝液量125 mL/250 mL，培養(yǎng)時(shí)間3 d，接種量4%，使液體培養(yǎng)枯草芽孢桿菌芽孢產(chǎn)率最終能達(dá)到72.1%。

結(jié)果表明，在培養(yǎng)基優(yōu)化方面鉀元素對(duì)芽孢產(chǎn)率影響最為顯著，添加適當(dāng)?shù)腒2HPO4·3H2O有助于維持和調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓的，對(duì)于芽孢的生長可能產(chǎn)生不同程度的促進(jìn)作用，在培養(yǎng)條件方面接種量對(duì)芽孢產(chǎn)率影響最為顯著，接種量會(huì)直接影響發(fā)酵情況，過大會(huì)引起溶氧不足，最佳接種量會(huì)有利促進(jìn)芽孢產(chǎn)率的提升。

數(shù)據(jù)可作為工業(yè)生產(chǎn)的參考，部分培養(yǎng)基配方與培養(yǎng)條件還可進(jìn)行進(jìn)一步的探索研究，若應(yīng)用于生產(chǎn)中，將會(huì)為飼料生產(chǎn)企業(yè)節(jié)約成本，增加收益。