王昭懿,張 鯤,周麗媛,程 嬌,溫 凱,于 梅
(山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東濟(jì)南 250100)
枯草芽孢桿菌是一種典型的革蘭氏陽性好氧菌,具有很強(qiáng)的酶活性,并且對(duì)人畜安全,是一種環(huán)境友好型菌種且能形成芽孢[1]。芽孢作為一種休眠體,能經(jīng)受高溫、干燥、紫外線、多種化學(xué)物質(zhì)及電離輻射等逆境[2],自由存在的芽孢作為一種隱藏的生命,一旦環(huán)境條件合適,芽孢便可以萌發(fā)成營養(yǎng)細(xì)胞。研究表明,枯草芽孢桿菌的芽孢進(jìn)入動(dòng)物腸道中,便能迅速萌發(fā)成具有新陳代謝作用的營養(yǎng)型細(xì)胞,這種營養(yǎng)型細(xì)胞能在動(dòng)物體內(nèi)分泌多種消化酶、維生素及氨基酸等物質(zhì),進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道菌群平衡,改善動(dòng)物的健康水平和生產(chǎn)性能[3-6]。因此,添加枯草芽孢桿菌制成益生菌制劑,被廣泛應(yīng)用于畜禽飼料工業(yè)。而飼用益生菌制劑是以有效的活菌數(shù)作為重要指標(biāo),產(chǎn)品中必須含有相當(dāng)數(shù)量的活菌才能發(fā)揮作用。但是,隨著保存時(shí)間的延長,活菌數(shù)量不斷減少,其有效活菌數(shù)降低,影響其使用效果[7]。但枯草芽孢桿菌所特有的芽孢擁有非常驚人的休眠能力,普通條件下可保存幾年至幾十年的活性,可有效延長貯存期。
然而枯草芽孢桿菌飼用益生菌制劑芽孢產(chǎn)率低的問題依舊存在。并且國內(nèi)枯草芽孢桿菌多采用固體發(fā)酵方式[8-10]進(jìn)行生產(chǎn),原料成本高、靈活性差,不便于機(jī)械化生產(chǎn),而且菌體存活率和芽孢產(chǎn)率相對(duì)較低[11]。相較而言,液體發(fā)酵技術(shù)所采用的培養(yǎng)基原料來源廣泛、價(jià)格低廉,生產(chǎn)效率高,更有利于大規(guī)模生產(chǎn),開發(fā)潛力大[12-13]。
通過優(yōu)化枯草芽孢桿菌液體培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件,以期獲得較高芽孢產(chǎn)率保證菌體活性,為飼用益生菌制劑生產(chǎn)企業(yè)提供參考依據(jù)。
1.1.1 菌種和培養(yǎng)基
菌種:枯草芽孢桿菌,青島農(nóng)業(yè)大學(xué)中韓食品研究中心提供。
菌種活化培養(yǎng)基:營養(yǎng)瓊脂(NA) 3.3 g,無水氯化鈣0.005 g,七水硫酸鎂0.01 g,四水氯化錳0.01 g,蒸餾水100 mL。
液體種子培養(yǎng)基:營養(yǎng)肉湯(NB) 1.8 g, 無水氯化鈣0.007 5 g,七水硫酸鎂0.01 g,四水氯化錳0.02 g,蒸餾水100 mL。
1.1.2 儀器和試劑
YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器、HPX-9272MBE型電熱恒溫培養(yǎng)箱、JHT系列凈化工作臺(tái)、B203LED型生物顯微鏡、SHA-C型水浴恒溫振蕩器。試驗(yàn)所用試劑均為國產(chǎn)分析純,所用水均為二次蒸餾水。
1.2.1 菌種活化
將放置在4℃冰箱內(nèi)保藏的枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)接至固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,在45℃恒溫下培養(yǎng)24 h。
1.2.2 液體培養(yǎng)
沖洗固體平板,將活化后菌種轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基中,按照液體基礎(chǔ)培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。
液體基礎(chǔ)培養(yǎng)條件:轉(zhuǎn)速100 r/min,溫度45℃,初始pH值7,接種量2%,裝液量100 mL/250 mL,培養(yǎng)時(shí)間3 d。
1.2.3 鏡檢
固體培養(yǎng):利用五點(diǎn)取樣法從固體平板中取菌至無菌離心管內(nèi),制成菌懸液搖勻待用。
液體培養(yǎng):吸取200μL菌體至無菌離心管內(nèi),制成菌懸液搖勻待用。
蘸取菌懸液至載玻片上,火焰固定,滴適量孔雀石綠,染色5 min,沖洗,待干后滴入適量番紅染液染色5 min,沖洗晾干待用。
在100倍油鏡下記錄細(xì)菌數(shù)與芽孢數(shù),計(jì)算芽孢產(chǎn)率。
芽孢產(chǎn)率計(jì)算方法見公式(1)。
式中:A——芽孢產(chǎn)率,%;
a——芽孢個(gè)數(shù),106CFU/mL;
b——菌體個(gè)數(shù),106CFU/mL。
1.3.1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化單因素試驗(yàn)
(1) 不同MnCl2·4H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響。選取 5個(gè) MnCl2·4H2O 用量 0.30,0.35,0.40,0.45,0.50 g,置于100 mL培養(yǎng)基,按照基礎(chǔ)培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng),染色鏡檢,記錄芽孢數(shù)和菌體數(shù),計(jì)算芽孢產(chǎn)率。
(2) 不同MgSO4·7H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響。選取 5 個(gè) MgSO4·7H2O用量 0.3,0.4,0.5,0.6,0.7 g,置于100 mL培養(yǎng)基,按照基礎(chǔ)培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng),染色鏡檢,記錄芽孢數(shù)和菌體數(shù),計(jì)算芽孢產(chǎn)率。
(3) 不同CaCl2用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響。選取6個(gè)不同 CaCl2用量 0,0.05,0.10,0.15,0.20,0.25 g置于100 mL培養(yǎng)基,按照基礎(chǔ)培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng),染色鏡檢,記錄芽孢數(shù)和菌體數(shù),計(jì)算芽孢產(chǎn)率。
(4) 不同K2HPO4·3H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響。選取 6 個(gè) K2HPO4·3H2O 用量 0,0.10,0.20,0.30,0.40,0.50 g,置于100 mL培養(yǎng)基,按照基礎(chǔ)培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng),染色鏡檢,記錄芽孢數(shù)和菌體數(shù),計(jì)算芽孢產(chǎn)率。
1.3.2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化的正交試驗(yàn)
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果以芽孢產(chǎn)率為指標(biāo),設(shè)計(jì)四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn),確定最適培養(yǎng)基配方。
1.3.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)
(1) 不同初始pH值對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響。選取4,5,6,7,8,9為初始pH值。使用1.3.2所得最佳培養(yǎng)基配方,按照基礎(chǔ)培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng),染色鏡檢,記錄芽孢數(shù)和菌體數(shù),計(jì)算芽孢產(chǎn)率。
(2)不同裝液量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響。選取50,75,100,125,150,250 mL 6種裝液量。使用1.3.2所得最佳培養(yǎng)基配方,按照液體培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng),染色鏡檢,記錄芽孢數(shù)和菌體數(shù),計(jì)算芽孢產(chǎn)率。
(3)不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響。選取1,2,3,4,5 d 5種培養(yǎng)時(shí)間。使用1.3.2所得最佳培養(yǎng)基配方,按照液體培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng),染色鏡檢,記錄芽孢數(shù)和菌體數(shù),計(jì)算芽孢產(chǎn)率。
(4) 不同接種量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響。選取1%,2%,4%,6%,8%,10%6種接種量。使用1.3.2所得最佳培養(yǎng)基配方,按照液體培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng),染色鏡檢,記錄芽孢數(shù)和菌體數(shù),計(jì)算芽孢產(chǎn)率。
1.3.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果以芽孢產(chǎn)率為指標(biāo),設(shè)計(jì)四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn),確定最適液體培養(yǎng)條件。
2.1.1 不同MnCl2·4H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響
錳離子是細(xì)胞中許多酶的激活劑,有利于枯草芽孢桿菌芽孢的生成[13]。
不同MnCl2·4H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響見圖1。
由圖1可知,隨著MnCl2·4H2O用量的增加,枯草芽孢桿菌芽孢產(chǎn)率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。MnCl2·4H2O用量達(dá)到0.45 g時(shí),芽孢產(chǎn)率達(dá)到48.1%,對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢的生長顯現(xiàn)促進(jìn)作用。因此,選取MnCl2·4H2O最佳用量為0.45 g。
圖1 不同MnCl2·4H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響
2.1.2 不同MgSO4·7H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響
鎂離子和硫離子,作為細(xì)胞中重要的酶激活劑,隨著添加量的變化會(huì)對(duì)菌體及芽孢的生長會(huì)產(chǎn)生不同的影響,根據(jù)結(jié)果分析枯草芽孢桿菌產(chǎn)率變化。
不同MgSO4·7H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響見圖2。
圖2 不同MgSO4·7H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響
由圖2可知,當(dāng)MgSO4·7H2O用量為0.5 g時(shí),芽孢產(chǎn)率達(dá)到55.2%,使芽孢產(chǎn)率得到顯著提升。但超過此用量,芽孢產(chǎn)率便開始降低,對(duì)芽孢生長產(chǎn)生不利影響。因此,選取MgSO4·7H2O最佳用量為0.5 g。
2.1.3 不同CaCl2用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響
鈣離子是某些胞外酶的穩(wěn)定劑、蛋白酶等的輔因子,也是細(xì)菌形成芽孢和某些真菌形成孢子所需要的重要元素[14],分析枯草芽孢產(chǎn)率的變化。
不同CaCl2用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響見圖3。
圖3 不同CaCl2用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響
由圖3可知,在一定范圍內(nèi),隨著CaCl2用量升高,菌種產(chǎn)芽孢數(shù)量越多,芽孢產(chǎn)率也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。用量升至0.15g時(shí),芽孢產(chǎn)率高達(dá)57.7%,對(duì)芽孢生長具有明顯促進(jìn)作用;當(dāng)繼續(xù)增加用量,該無機(jī)鹽對(duì)芽孢生長開始出現(xiàn)抑制作用,不利于芽孢產(chǎn)率的提升。因此,CaCl2最佳添加量為0.15 g。
2.1.4 不同K2HPO4·3H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響
不同K2HPO4·3H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響見圖4。
圖4 不同K2HPO4·3H2O用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響
由圖4可知,最適K2HPO4·3H2O用量為0.2 g,此時(shí)芽孢產(chǎn)率為59.3%,對(duì)芽孢生長起到顯著促進(jìn)作用,用量過高或過低都不利于芽孢的生長,所以選擇K2HPO4·3H2O最佳用量為0.2 g。
根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果,以芽孢產(chǎn)率為指標(biāo)考查錳離子、鎂離子、鈣離子、鉀離子的不同用量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響,設(shè)計(jì)四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn),確定最適培養(yǎng)基條件。
L9(34)正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。
表1 L(934)正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)/g
L9(34)正交設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2,SPSS方差分析結(jié)果見表3。
表2 L9(34)正交設(shè)計(jì)及結(jié)果
由表2可知,極差R值的大小為D>B>C>A,即影響枯草芽孢桿菌芽孢產(chǎn)率的主次順序?yàn)殁涬x子>鎂離子>鈣離子>錳離子;正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果(表3) 顯示,各因素各水平差異極顯著(p<0.01),得出A1B1C2D3為最優(yōu)水平。
表3 SPSS方差分析結(jié)果
對(duì)最優(yōu)水平A1B1C2D3與試驗(yàn)結(jié)果最優(yōu)A2B1C2D3進(jìn)行驗(yàn)證對(duì)比試驗(yàn),A1B1C2D3的芽孢產(chǎn)率為64.8%,A2B1C2D3的芽孢產(chǎn)率為64.59%,表明A1B1C2D3的液體培養(yǎng)基更佳,最佳培養(yǎng)基組合為每100 mL培養(yǎng)基中錳離子0.4 g,鎂離子0.4 g,鈣離子0.15 g,鉀離子0.3 g。
2.3.1 不同初始pH值對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響
不同初始pH值對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響見圖5。
圖5 不同初始pH值對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響
由圖5可知,隨著培養(yǎng)基初始pH值的增加,產(chǎn)孢率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),pH值為7時(shí)芽孢產(chǎn)率最大達(dá)64%,pH值過高或過低培養(yǎng)條件下芽孢產(chǎn)率均偏低,得出液體培養(yǎng)最優(yōu)pH值為7。
2.3.2 不同裝液量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響
不同裝液量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響見圖6。
圖6 不同裝液量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響
由圖6可知,隨著裝液量的增加,產(chǎn)孢率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì);最適液體培養(yǎng)枯草芽孢桿菌芽孢生長的裝液量為100 mL/250 mL,此時(shí)枯草芽孢桿菌芽孢產(chǎn)率最大,為65%。
2.3.3 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響
不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響見圖7。
圖7 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響
由圖7可知,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,產(chǎn)孢率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),最適液體培養(yǎng)枯草芽孢桿菌芽孢生長的培養(yǎng)時(shí)間為3 d,此時(shí)枯草芽孢桿菌芽孢產(chǎn)率最大,為67.7%。
2.3.4 不同接種量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響
不同接種量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響見圖8。
圖8 不同接種量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響
由圖8可知,隨著接種量的增加,產(chǎn)孢產(chǎn)率出現(xiàn)2個(gè)峰值,即接種量為2%時(shí)芽孢產(chǎn)率為68.6%,接種量為8%時(shí)芽孢產(chǎn)率為66.7%,考慮節(jié)省成本,選取2%為最佳接種量。
設(shè)計(jì)四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn),確定最適培養(yǎng)條件。
L9(34)正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表4。
表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)
L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5,SPSS方差分析結(jié)果見表6。
由表 5 可知,極差 R'值大小為 B'>D'>C'>A',即影響枯草芽孢桿菌芽孢產(chǎn)率的主次順序?yàn)榻臃N量>培養(yǎng)時(shí)間>初始pH值>裝液量;正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果顯示,除裝液量外,各因素各水平差異極顯著(p<0.01),得出 A'3B'3C'2D'2為最優(yōu)水平。
表5 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
表6 SPSS方差分析結(jié)果
對(duì)最優(yōu)水平A'3B'3C'2D'2與試驗(yàn)結(jié)果最優(yōu)A'3B'3C'2D'1進(jìn)行驗(yàn)證對(duì)比試驗(yàn),A'3B'3C'2D'2的芽孢產(chǎn)率為72.10%,A'3B'3C'2D'1的芽孢產(chǎn)率為70.50%,表明A'3B'3C'2D'2的液體培養(yǎng)條件更佳,即最優(yōu)培養(yǎng)條件組合為裝液量125 mL/250 mL,接種量4%,初始pH值7,培養(yǎng)時(shí)間3 d。
枯草芽孢桿菌芽孢生長的培養(yǎng)基配方為營養(yǎng)肉湯1.8 g,無水氯化鈣0.15 g,七水硫酸鎂0.40 g,四水氯化錳0.40 g,硫酸氫二鉀0.30 g每100 mL培養(yǎng)基;最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)條件為初始pH值7,裝液量125 mL/250 mL,培養(yǎng)時(shí)間3 d,接種量4%,使液體培養(yǎng)枯草芽孢桿菌芽孢產(chǎn)率最終能達(dá)到72.1%。
結(jié)果表明,在培養(yǎng)基優(yōu)化方面鉀元素對(duì)芽孢產(chǎn)率影響最為顯著,添加適當(dāng)?shù)腒2HPO4·3H2O有助于維持和調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓的,對(duì)于芽孢的生長可能產(chǎn)生不同程度的促進(jìn)作用,在培養(yǎng)條件方面接種量對(duì)芽孢產(chǎn)率影響最為顯著,接種量會(huì)直接影響發(fā)酵情況,過大會(huì)引起溶氧不足,最佳接種量會(huì)有利促進(jìn)芽孢產(chǎn)率的提升。
數(shù)據(jù)可作為工業(yè)生產(chǎn)的參考,部分培養(yǎng)基配方與培養(yǎng)條件還可進(jìn)行進(jìn)一步的探索研究,若應(yīng)用于生產(chǎn)中,將會(huì)為飼料生產(chǎn)企業(yè)節(jié)約成本,增加收益。