夏振宇 張衛(wèi)星 王紅芳 劉振國 王穎 胥保華

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018）

1 前言

在蜜蜂的生理代謝中，礦物質(zhì)的作用非常重要，不僅參與歧化反應(yīng)，也是調(diào)節(jié)血淋巴與組織液滲透壓的重要因素[1]。微量元素是蜜蜂機(jī)體組織中的重要營養(yǎng)物質(zhì)，微量元素占蜜蜂個(gè)體干物質(zhì)的6.2%~6.7%[2]。在糖飼糧中添加微量元素也能延長(zhǎng)蜜蜂工蜂16.5%~32.7%的壽命[3]。

錳是動(dòng)物體內(nèi)重要的礦物元素之一，錳能促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)的內(nèi)分泌活動(dòng)和提高動(dòng)物機(jī)體免疫功能，還參與動(dòng)物氧化還原過程[4]。錳不僅僅參與構(gòu)造動(dòng)物體內(nèi)的金屬酶，還是許多酶的激活劑[5]。前人研究表明，隨著蜜蜂日齡的增長(zhǎng)，其體內(nèi)的錳元素含量會(huì)逐漸增加，在蜜蜂飼糧中補(bǔ)充適量的錳會(huì)促進(jìn)蜜蜂的生長(zhǎng)發(fā)育[6]。因此，有必要按蜜蜂生長(zhǎng)發(fā)育的需求在人工飼糧中添加微量元素錳。

意大利蜜蜂的生長(zhǎng)發(fā)育中需要一定水平的錳來滿足其需要。為了進(jìn)一步探明錳對(duì)蜜蜂生長(zhǎng)發(fā)育和生理機(jī)能的影響，本研究以意大利蜜蜂為研究對(duì)象，通過在蜜蜂幼蟲飼糧中添加不同濃度的錳，開展室內(nèi)幼蟲飼養(yǎng)試驗(yàn)，對(duì)蜜蜂生長(zhǎng)發(fā)育、機(jī)體生理生化指標(biāo)以及相關(guān)基因表達(dá)等進(jìn)行測(cè)定和觀察，力求探明錳對(duì)蜜蜂的營養(yǎng)作用及機(jī)制。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)動(dòng)物

意大利蜜蜂。

2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

從姊妹蜂群中移取2日齡（2d）意大利蜜蜂工蜂幼蟲1200只，隨機(jī)分成5組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)48只幼蟲，并置于室內(nèi)恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為34℃，濕度為50%±5%。其中1組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)飼糧；其余4組為試驗(yàn)組，分別在基礎(chǔ)飼糧中添加不同水平的葡萄糖酸錳，添加水平分別為2.00mg/kg、3.00mg/kg、4.00mg/kg、5.00mg/kg，配方如表1所示。分別采集3d、5d、7d幼蟲樣本，測(cè)定生理生化指標(biāo)和相關(guān)基因表達(dá)水平；統(tǒng)計(jì)各組化蛹率、羽化率。

表1 幼蟲人工飼糧配方及錳水平

表2 基因引物序列

2.3 測(cè)定指標(biāo)及相關(guān)方法

2.3.1 蜜蜂幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)的測(cè)定

從每試驗(yàn)組中隨機(jī)選取發(fā)育正常的1日齡幼蟲120只，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)24只幼蟲。從1日齡飼養(yǎng)至7日齡，轉(zhuǎn)移幼蟲至化蛹板化蛹，化蛹率為成功化蛹的幼蟲數(shù)占用于測(cè)定幼蟲的化蛹率幼蟲總數(shù)的百分?jǐn)?shù)。繼續(xù)飼養(yǎng)，直到所有蛹羽化，羽化率為成功羽化的幼蟲數(shù)占成功化蛹的幼蟲數(shù)目的百分?jǐn)?shù)。

2.3.2 蜜蜂幼蟲體內(nèi)生理生化指標(biāo)的測(cè)定

用雙抗體一步夾心法試劑盒測(cè)定蜂體的蛋白質(zhì)濃度、總抗氧化能力（T-AOC）、含錳超氧化物歧化酶活性（MnSOD）、含錳過氧化氫酶活性（MnCAT）和精氨酸酶活性（Arginase）。4種抗氧化酶活性均用蜂體蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行校準(zhǔn)[7]。

2.3.3 蜜蜂幼蟲體內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定

用qRT-PCR法檢測(cè)抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)量、精氨酸酶基因表達(dá)量。目的基因引物設(shè)計(jì)參考序列來自于NCBI數(shù)據(jù)庫，以β-actin為內(nèi)參，委托上海生工生物科技有限公司完成，引物序列如表2所示。

2.3.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P<0.05表示差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 錳對(duì)蜜蜂幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，幼蟲人工飼糧中錳的添加水平對(duì)蜜蜂化蛹率和羽化出房率的影響不顯著（P>0.05），但與對(duì)照組相比，幼蟲飼糧中錳添加水平為4.00mg/kg時(shí)，錳能夠提高意大利蜜蜂幼蟲化蛹率和羽化出房率。

3.2 錳對(duì)蜜蜂幼蟲體內(nèi)生理生化指標(biāo)的影響

圖1 錳對(duì)蜜蜂幼蟲化蛹率的影響

圖2 錳對(duì)蜜蜂幼蟲羽化率的影響

由圖3可以看出，隨著飼糧中錳添加水平的升高，幼蟲體內(nèi)的MnSOD活性顯著升高（P<0.05）。

由圖4可以看出，隨著飼糧中錳添加水平的升高，幼蟲體內(nèi)的MnCAT活性顯著升高（P<0.05）。

由圖5可以看出，隨著飼糧中錳添加水平的升高，幼蟲體內(nèi)的T-AOC活性顯著升高（P<0.05）。

3.3 錳對(duì)蜜蜂幼蟲體內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)量的影響

與對(duì)照組相比，當(dāng)幼蟲飼糧中錳添加4.00mg/kg時(shí)，幼蟲體內(nèi)的MnSOD基因表達(dá)量顯著升高（P<0.05）。

錳顯著影響不同日齡蜜蜂幼蟲MnCAT基因的相對(duì)表達(dá)量，3日齡幼蟲3mg/kg處理組MnCAT基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和其他處理組（P<0.05）。5日齡幼蟲3mg/kg、4mg/kg處理組MnCAT基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和其他處理組（P<0.05）。

綜合以上結(jié)果，以室內(nèi)飼養(yǎng)5日齡幼蟲MnSOD活性做擬合曲線，得到室內(nèi)飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲人工飼糧中錳的適宜添加水平為2.96mg/kg。

4 討論

4.1 蜜蜂飼糧中補(bǔ)充Mn可促進(jìn)蜜蜂生長(zhǎng)發(fā)育

圖3 不同錳添加水平的糖漿飼料對(duì)各日齡成年工蜂MnSOD酶活性的影響

圖4 不同錳添加水平的糖漿飼料對(duì)各日齡成年工蜂MnCAT酶活性的影響

圖5 不同錳添加水平的糖漿飼料對(duì)各日齡成年工蜂T-AOC活性的影響

圖6 不同錳添加水平的糖漿飼料對(duì)各日齡成年工蜂體內(nèi)MnSOD基因表達(dá)量的影響

圖7 不同錳添加水平的糖漿飼料對(duì)各日齡成年工蜂體內(nèi)MnCAT基因表達(dá)量的影響

在蜜蜂飼糧中補(bǔ)充適量的Mn會(huì)促進(jìn)蜜蜂的生長(zhǎng)發(fā)育。對(duì)其他動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)，團(tuán)頭魴獲得最大增重率和特定生長(zhǎng)率的飼料錳含量為12.9mg/kg，在飼料中添加適量的錳能促進(jìn)團(tuán)頭魴的生長(zhǎng)，當(dāng)飼料中錳含量大于23.16mg/kg時(shí)，會(huì)造成團(tuán)頭魴生長(zhǎng)受阻[8]。本試驗(yàn)結(jié)果基本與上述研究結(jié)果類似，意大利蜜蜂幼蟲獲得最大化蛹率和羽化率的飼料錳含量為4mg/kg。證明飼糧中添加適量的錳能促進(jìn)意大利蜜蜂幼蟲的生長(zhǎng)，提高蜜蜂幼蟲的存活能力和抵抗外界不良應(yīng)激的能力。當(dāng)錳含量由2mg/kg上升至4mg/kg時(shí)，化蛹率和羽化率都持續(xù)升高。所以，當(dāng)人工飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲時(shí)，可以考慮適當(dāng)添加錳，促進(jìn)蜜蜂幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育。

4.2 蜜蜂飼糧中補(bǔ)充Mn可提高蜜蜂的抗氧化能力

SOD活性的高低反映機(jī)體清除O2—的能力，即SOD活性越高，機(jī)體清除O2—的能力越強(qiáng)。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)SOD有3種。其中MnSOD的主要功能是將細(xì)胞代謝產(chǎn)生的O2—歧化成H2O2，從而維持線粒體等亞細(xì)胞器膜的完整性和正常功能[9]。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物飼糧中錳的添加水平直接影響MnSOD活性[10]。

在飼料中錳含量對(duì)方格星蟲稚蟲抗氧化酶活性的影響研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中錳含量對(duì)方格星蟲稚蟲體腔液中MnSOD活性有顯著影響，當(dāng)飼料中錳的添加水平為28.67mg/kg時(shí)，方格星蟲稚蟲體內(nèi)的MnSOD活性最高，但添加濃度過高時(shí)，方格星蟲稚蟲體內(nèi)的MnSOD活性就會(huì)減弱[11]。本研究與上述研究結(jié)果相似，飼料中補(bǔ)充錳元素對(duì)意大利蜜蜂幼蟲體中MnSOD活性有顯著影響。隨著飼糧中錳添加水平的升高，幼蟲體內(nèi)的MnSOD活性顯著升高（P<0.05）。錳添加水平為3mg/kg時(shí)，幼蟲體內(nèi)的MnSOD活性達(dá)到最高，7日齡幼蟲體中的MnSOD活性隨著飼料中錳含量的升高出現(xiàn)上升趨勢(shì)。分析其原因可能是，意大利蜜蜂幼蟲從對(duì)照組飼糧中吸收較少，錳的減少會(huì)使MnSOD結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，Mn作為MnSOD的活性中心的作用減弱，降低MnSOD的活性。當(dāng)蜜蜂幼蟲攝入適量的錳時(shí)，會(huì)加強(qiáng)蜜蜂幼蟲體內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用，這一代謝的產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量升高，機(jī)體的內(nèi)自穩(wěn)機(jī)制使蜜蜂幼蟲體內(nèi)抗氧化作用代償性加強(qiáng)，蜜蜂幼蟲體內(nèi)MnSOD活性增高，且錳充分發(fā)揮作為MnSOD的活性中心作用。而7日齡幼蟲對(duì)錳的需求量大于3、5日齡，因此隨本實(shí)驗(yàn)人工飼糧所添加的錳濃度梯度升高，MnSOD的活性會(huì)持續(xù)增高。

生物體內(nèi)存在的過氧化氫酶，CAT可分解蜜蜂體內(nèi)歧化反應(yīng)所積存的過氧化氫（2H2O2→O2+2H2O），減少體內(nèi)H2O2與O2反應(yīng)所生成的有害物質(zhì)。目前已知的過氧化氫酶有兩類：一類含血紅素基（heme）；另一類不含血紅素基（nonheme），但含有錳，稱為錳過氧化氫酶（MnCat）[12]。人工飼料育蠶比桑葉育蠶的CAT活力高2%~10%，說明不同飼料對(duì)CAT有一定的影響[13]。本研究結(jié)果表明，飼料中錳含量對(duì)蜜蜂幼蟲體中MnCAT活性有顯著影響，隨著飼糧中錳添加水平的升高，幼蟲體內(nèi)的MnCAT活性顯著升高（P<0.05）。7日齡幼蟲體中的MnCAT活性隨著飼料中錳含量的升高呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，可能是意大利蜜蜂從飼料中吸收微量的錳，錳的減少使得MnCAT結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，Mn作為MnCAT活性中心的作用不能發(fā)揮，造成MnCAT的活性下降。隨著人工飼糧中錳含量的增加，蜜蜂幼蟲機(jī)體的內(nèi)自穩(wěn)機(jī)制會(huì)使蜜蜂體內(nèi)抗氧化作用出現(xiàn)代償性強(qiáng)化，體內(nèi)MnCAT活性代償性增高，產(chǎn)生高濃度的H2O2，因此MnCAT活性增高。在7日齡時(shí)，幼蟲對(duì)錳的需要量大于3、5日齡，所以MnCAT活性隨著飼料中錳含量的升高而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

圖8 5日齡幼蟲Mn-SOD活性擬合曲線

總抗氧化能力（T-AOC）反映蜜蜂的總抗氧化系統(tǒng)功能，可清除蜜蜂體內(nèi)自由基，減少氧化損傷。錳元素主要以離子狀態(tài)作為酶活化因子或組成部分在昆蟲體內(nèi)抗氧化機(jī)制中發(fā)揮其作用[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中錳添加濃度的變化能夠影響蜜蜂幼蟲總抗氧化能力的變化，隨著飼糧中錳添加水平的升高，幼蟲體內(nèi)的T-AOC活性顯著升高（P<0.05）。當(dāng)添加量在3mg/kg時(shí)，幼蟲抗氧化能力達(dá)到最高，當(dāng)高于3mg/kg添加量時(shí)抗氧化能力較低，可能是因?yàn)檫^量的錳會(huì)與其他礦物質(zhì)發(fā)生拮抗作用，影響蜜蜂對(duì)其他礦物質(zhì)的吸收，將會(huì)造成蜜蜂幼蟲內(nèi)環(huán)境紊亂，也會(huì)使一些酶活性降低。

4.3 Mn影響蜜蜂錳相關(guān)基因表達(dá)

酶相關(guān)基因的表達(dá)量和翻譯后的剪切修飾影響酶活性的高低，錳能通過調(diào)節(jié)錳依賴性酶來調(diào)節(jié)DNA和RNA的合成與分解影響基因的表達(dá)量和翻譯后的剪切修飾[15]，從而影響該酶的活性。MnSOD活性與MnSOD基因相對(duì)表達(dá)量密切相關(guān)，意大利蜜蜂幼蟲MnSOD活性與蜜蜂MnSOD基因相對(duì)表達(dá)量受到飼糧中錳水平的影響，較高的酶基因表達(dá)量與較高的酶活性有正相關(guān)關(guān)系，3、5日齡幼蟲4mg/kg處理組MnSOD酶活性顯著高于對(duì)照組和其他試驗(yàn)組，且MnSOD基因的相對(duì)表達(dá)量也顯著高于對(duì)照組和其他組。這可能是因?yàn)檫m宜的錳含量使MnSOD表達(dá)量較高，造成MnSOD酶活性增高，最終表現(xiàn)出其基因表達(dá)量與酶活性一致的效果。錳對(duì)于蜜蜂MnSOD酶基因表達(dá)量的影響與錳對(duì)MnSOD酶活性的影響有一致的作用。同樣，飼糧中適宜的錳含量也會(huì)使意大利蜜蜂MnCAT基因相對(duì)表達(dá)量升高。3、5日齡幼蟲4mg/kg處理組MnCAT酶活性顯著高于對(duì)照組和其他試驗(yàn)組，MnCAT基因的相對(duì)表達(dá)量也顯著高于對(duì)照組和其他試驗(yàn)組，可能是因?yàn)檫m宜的錳含量使MnCAT基因表達(dá)量較高，造成MnSOD酶活性增高。

5 結(jié)論

本研究首次探明了錳對(duì)幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育和生理機(jī)能的影響，對(duì)室內(nèi)飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲人工飼糧中適宜錳的添加水平進(jìn)行了研究。錳對(duì)蜜蜂生長(zhǎng)發(fā)育有促進(jìn)作用。在意大利蜜蜂幼蟲飼料中補(bǔ)充適量的錳時(shí)，且錳的添加水平大約在2.96mg/kg時(shí)，能夠提高幼蟲的抗氧化能力。