包敖敦格日樂，姚力丹，曼則熱·朱爾丁，梁小鵬，張振良，決肯·阿尼瓦什

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】被毛顏色是毛皮動物的重要特征之一。中國綿羊的顏色是白色，黑色，紅棕色，黃棕色，藍灰色和斑點。它主要包括微觀多元素的調(diào)節(jié)和環(huán)境。[1]。不同毛色天然羊毛紡織原料減少化學染料對人體傷害和環(huán)境污染，降低紡織成本，利用現(xiàn)代分子遺傳技術(shù)來分析不同毛色的遺傳變異，對選育不同毛色的綿羊和提高綿羊羊毛的經(jīng)濟價值，對新疆養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】哺乳動物的表皮結(jié)構(gòu)主要由黑色素組成，黑色素是一種無定形的細顆粒，幾乎不溶于所有機溶劑和水。由于基因調(diào)節(jié)，黑素細胞在不同的發(fā)育水平上發(fā)生變化。 不同的基因在不同的發(fā)育階段會產(chǎn)生不同的影響[2]。哺乳動物的毛色由幾種基因介導，對基因的最終表達具有不同的影響。據(jù)報道，鼠灰信號蛋白基因(Agouti - signalling Protein,ASIP)基因和酪氨酸酶相關(guān)蛋白家族基因(TYR，TYRP1和TYRP2)基因與羊毛的顏色有關(guān)[3,4]。Agouti基因編碼的、脂肪組織及腦組織內(nèi)表達[5]。Agouti在小鼠皮膚中表達并調(diào)節(jié)毛色，抑制黑素細胞中的MC1R信號而達到所表達的有所不同[6]。TYR基因是黑色素合成的限速酶，氨基酸在TYR的催化下，通過DOPA、多巴洛衍生物等形式生成黑色素，含有真黑素和褐黑素，真黑素通過誘導TYRP1、TYRP2、SILV酶和G蛋白而產(chǎn)生較深顏色的色素。研究表明酪氨酸酶活性可以影響黑色素的合成。TYR的濃度和活性過低時，所表達的是褐色素；相反TYR的濃度和活性過高時，會表達真黑色素的產(chǎn)生和表達[7-9]。【本研究切入點】前人在不同品種的綿羊研究過有關(guān)毛色調(diào)控的基因，但在巴什拜羊上有關(guān)毛色的研究報道較少。研究分析新疆巴什拜羊毛色與有關(guān)基因多態(tài)性分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對巴士拜羊羊四個基因的多態(tài)性分析，篩選出與不同毛色相關(guān)的遺傳變異，為選育彩色綿羊，綜合提高新疆綿羊經(jīng)濟性能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣本選擇

采集塔城托里縣的3種不同被毛顏色(紅棕色73只，黑色53只，青灰色40只)的巴什拜羊。試驗采用櫞酸鈉抗凝血樣，儲存與-20℃冰箱內(nèi)用于提取DNA，試驗采用酚仿抽提法提取基因組DNA。圖1

1.1.2 主要試劑和藥品

Tris平衡酚，氯仿異戊醇，冰無水乙醇，70%無水乙醇，2×TaqPCR MasterMix，6×Loading Buffer，DL2000，D2000，ddH2O，蒸餾水，甲醛，Tris堿，EDTA-Na2，AgNO3，NaCl，SDS，NaOH，溴化乙錠，尿素，鹽酸，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，過硫酸銨，95%去離子甲酰胺，二甲苯青，溴酚藍，瓊脂糖。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計

參照GenBank中綿羊ASIP基因(登錄號：NC_019470)、TYR基因(登錄號：NC_019478)、TYRP1基因(登錄號：EU760771.1)和TYRP2基因(登錄號：EU760773)序列，用Primer Premier 5軟件設(shè)計引物，由上海生物生物工程有限公司合成，引物序列見。將ASIP基因、TYR基因和TYRP1基因的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測序。表1

表1ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因的引物序列、片段大小及退火溫度
Table 1 Primer sequences, fragment sizes and annealing temperatures ofASIP,TYR,TYRP1 andTYRP2 genes

基因Gene引物序列(5’→3’)Primer sequence (5'→3')片段大小Fragment size退火溫度TmAnnealing temperature Tm位置PositionASIPF:TACCTTGCTGGTCTGCCTGTR:CAACCCTAGCTGAGACTTCC252bp61.1℃Exon 2TYRF:CAAGCACGTCGAATCTGGR:CCGGGGACTTCAACATC257bp61℃Exon 6TYRP1F:TCCTTCTTTCTCCCTCCCR:TTCCAAGGATTCGCAGAC160bp55℃Exon 3TYRP2F:CTACAACCGCCGAGTCACR: GAACGGAGGACTGTCAAACTT145bp60℃Exon 5

1.2.2 PCR擴增體系及反應(yīng)條件

PCR擴增反應(yīng)總體積20 μL：DNA模板(50 ng/uL)1 μL，引物(10 pmol/uL)1 μL，2×TaqPCR MasterMix10 μL，再加入8 μL的ddH2O使總體積為20 μL。PCR程序。表2

1.2.3 PCR-SSCP檢測

用變性后的產(chǎn)物在8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠的膠槽中點樣，點好樣后預跑10 min，電流180 V，電壓50 mA，電泳8到12 h。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗運用軟件PIC-CALC和POPGENE32計算巴什拜羊ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因的基因型頻率、等位基因頻率、純合度、雜合度、多態(tài)信息含量和有效等位基因數(shù)，并對該位點基因型的分布進行Hardy-Weinberg平衡的卡方適合性檢驗。

表2 PCR反應(yīng)程序
Table 2 PCR reaction procedure

溫度Temperature時間Time循環(huán)次數(shù)Cycles94℃預變性5 min1 Cycle94℃變性30 s退火溫度30 s72℃延伸30 min }35 Cycles72℃延伸5 min1 Cycle4℃保存Pause1 Cycle

2 結(jié)果與分析

2.1 巴什拜羊基因組DNA的檢測

用濃度為1.5%瓊脂糖凝膠對提取的巴什拜羊基因組DNA進行檢測，凝膠上的基因組DNA條帶大于2 000 bp，且DNA的OD值在1.7～1.8，表明基因組DNA的完整性和純度比較好，可作為后續(xù)的試驗模板。圖1

圖1 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測
Fig.1 DNA agarose gel electrophoresis detection chart

2.2 巴什拜羊4種基因的PCR檢測

PCR產(chǎn)物利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，擴增長度分別為:ASIP基因252 bp,TYR基因257 bp,TYRP1基因160 bp，TYRP2基因145 bp，都與目的片段長度一致，可用于后續(xù)試驗。圖2

2.3 基因的PCR-SSCP檢測

用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結(jié)果表明,ASIP基因的PCR-SSCP檢測結(jié)果圖中有兩種基因型，分別命名為AA型和AB型。TYR基因的PCR-SSCP檢測結(jié)果圖中可以看出有三種基因型，分別定義為AA型、AG和GG型。TYRP1基因的PCR-SSCP檢測結(jié)果圖中可以看出有兩種基因型，分別定義為AA型和GG型。TYRP2基因的PCR-SSCP檢測結(jié)果圖中可以看出條帶一致，沒有多態(tài)。圖3

2.4ASIP基因測序

研究表明，在巴什拜羊群體中發(fā)現(xiàn)此序列在第二外顯子處發(fā)生突變。

在ASIP基因中堿基C缺失，是錯義突變，導致絲氨酸突變?yōu)楦彼?，由AA基因型突變?yōu)锳B基因型。圖4

圖2ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因PCR擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果
Fig.2 Detection results of PCR amplification products ofASIP,TYR,TYRP1 andTYRP2 genes

圖3ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因SSCP凝膠檢測結(jié)果
Fig.3 Results of SSCP gel detection ofASIP,TYR,TYRP1 andTYRP2 genes

圖4ASIP基因突變位點的不同峰圖測序
Fig.4 Sequencing of different peak maps ofASIPgene mutation sites

2.4.1TYR基因測序結(jié)果

TYR基因由測序結(jié)果分析可知，在巴什拜羊群體中發(fā)現(xiàn)此序列在第六外顯子處發(fā)生突變。TYR基因編碼區(qū)堿基A→G發(fā)生突變，是錯義突變，導致氨基酸由組氨酸突變?yōu)榫彼?，由AA基因型突變?yōu)锳G基因型和GG基因型。圖5

圖5TYR基因突變位點的不同峰圖測序
Fig.5 Sequencing of different peak maps ofTYRgene mutation sites

2.4.2TYRP1基因測序

研究表明，在巴什拜羊群體中發(fā)現(xiàn)此序列在第三外顯子處發(fā)生突變。TYRP1基因編碼區(qū)堿基A→G發(fā)生突變，是同義突變，未導致氨基酸序列的變化。圖6

圖6TYRP1基因突變位點的不同峰圖測序
Fig.6 Sequencing of different peak maps of theTYRP1 gene mutation site

2.5 基因群體遺傳結(jié)構(gòu)

2.5.1ASIP基因群體遺傳結(jié)構(gòu)

2.5.1.1ASIP基因的基因頻率和基因型頻率

研究表明，在不同毛色的巴什拜羊群體中，ASIP基因存在兩種基因型：AA型和AB型。AB基因型在紅色被毛群體中是優(yōu)勢基因型，其基因型頻率為0.658。AA基因型在黑色被毛群體中是優(yōu)勢基因型，其基因型頻率為0.660。AA基因型在青灰色被毛群體中是優(yōu)勢基因型，其基因型頻率為0.875。等位基因B為紅色被毛群體中的優(yōu)勢等位基因；等位基因A為黑色和青灰色兩種被毛群體中的優(yōu)勢等位基因。ASIP基因在巴什拜羊群體中處于Hardy - Weinberg平衡狀態(tài)。可以看出AA基因型在黑色和青灰色群體中的個體數(shù)高于AB基因型的個體數(shù)；在紅色被毛群體中AB基因型個體數(shù)高于AA基因型的個體數(shù)。ASIP-1基因的兩種基因型個體數(shù)在三種不同毛色群體中差異不顯著(P>0.05)。表1

表1ASIP基因型頻率和等位基因頻率
Table 1ASIPgenotype frequency and allele frequency

品種Breed基因純合度(Ho)基因雜合度(He)有效等位基因數(shù)(Ne)多態(tài)信息(PIC)巴什拜紅羊0.5590.4411.7900.344巴什拜黑羊0.7180.2821.3920.242巴什拜青羊0.8820.1171.1330.110

2.5.1.2ASIP基因遺傳參數(shù)值

對巴什拜羊ASIP基因的純合度、雜合度、有效等位基因和多態(tài)信息含量進行分析。ASIP基因在不同毛色的巴什拜羊群體中的遺傳參數(shù)值有所不同。紅色被毛的巴什拜羊中純合度為0.559，雜合度為0.441，有效等位基因數(shù)為1.790，多態(tài)信息含量為0.343。黑色被毛的巴什拜羊中純合度為0.718，雜合度為0.282，有效等位基因數(shù)為1.392，多態(tài)信息含量為0.242。青灰色被毛的巴什拜羊中純合度為0.882，雜合度為0.117，有效等位基因數(shù)為1.133，多態(tài)信息含量為0.110。在此群體中，紅色被毛巴什拜羊的多態(tài)信息含量為0.344，屬于中度多態(tài)；黑色和青灰色被毛巴什拜羊的多態(tài)信息含量為0.242和0.110，低度多態(tài)。表2

表2 巴什拜羊ASIP基因遺傳參數(shù)
Table 2 Genetic parameters ofASIPgene in Bashbai sheep

毛色Coat基因型和基因型頻率Genotype and genotype frequency等位基因頻率Allele frequencyAAABABX2紅色0.342(25)0.658(48)0.671(121)0.329(48)2.853黑色0.660(35)0.340(18)0.830(88)0.170(18)0.136青灰色0.875(35)0.125(5)0.938(75)0.062(5)0.673

2.5.2TYR基因群體遺傳結(jié)構(gòu)

2.5.2.1TYR基因的基因頻率和基因型頻率

研究表明，在不同毛色的巴什拜羊群體中，TYR基因存在兩種基因型：AA型AG型和GG型。GG基因型在此群體中是優(yōu)勢基因型，在紅色被毛群體中的基因型頻率為0.849；在黑色被毛群體中的基因型頻率為0.698；在青色被毛群體中的基因型頻率為0.475。AG基因型在紅色被毛群體中基因型頻率為0.110；AG基因型在紅色被毛群體中基因型頻率為0.226；AG基因型在紅色被毛群體中基因型頻率為0.4。AA基因型在紅色被毛群體中，其基因型頻率為0.041；在黑色被毛群體中的基因型頻率為0.075；在青色被毛群體中的基因型頻率為0.125。在此群體中等位基因G為3種毛色的優(yōu)勢等位基因。TYR基因在巴什拜羊黑色和青色被毛群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，而紅色被毛群體中處于不平衡狀態(tài)。AA和AG基因型在此群體中的個體數(shù)低于GG基因型的個體數(shù)。在紅色被毛群體中GG基因型個體數(shù)顯著高于AA和AG基因型個體數(shù)(P<0.05)；而黑色和青灰色被毛群體中AA、AG和GG基因個體數(shù)差異不顯著(P>0.05)。表3

表3TYR基因型頻率和等位基因頻率
Table 3TYRgenotype frequency and allele frequency chart

毛色基因型和基因型頻率Genotype and genotype frequency等位基因頻率Allele frequencyAAAGGGAGX2紅色0.041(3)0.110(8)0.849(62)0.096(14)0.904(132)9.884黑色0.075(4)0.226(12)0.698(37)0.189(20)0.811(86)3.596青灰色0.125(5)0.4(16)0.475(19)0.325(26)0.675(54)0.312

2.5.2.2TYR基因遺傳參數(shù)值

對巴什拜羊TYR基因的純合度、雜合度、有效等位基因和多態(tài)信息含量進行分析。TYR基因在不同毛色的巴什拜羊群體中的遺傳參數(shù)值有所不同。紅色被毛的巴什拜羊中純合度為0.827，雜合度為0.173，有效等位基因數(shù)為1.210，多態(tài)信息含量為0.158。黑色被毛的巴什拜羊中純合度為0.306，雜合度為0.694，有效等位基因數(shù)為1.441，多態(tài)信息含量為0.259。青灰色被毛的巴什拜羊中純合度為0.561，雜合度為0.439，有效等位基因數(shù)為0.561，多態(tài)信息含量為0.342。TYR基因在此群體中，紅色被毛多態(tài)信息含量處于低度多態(tài)，黑色和青灰色被毛多態(tài)信息含量處于中度多態(tài)。表4

表4 巴什拜羊TYR基因遺傳參數(shù)
Table 4 Genetic parameters ofTYRgene in Bashbai sheep

品種 Breed基因純合度(Ho)基因雜合度(He)有效等位基因數(shù)(Ne)多態(tài)信息(PIC)巴什拜紅羊0.8270.1731.2100.158巴什拜黑羊0.3060.6941.4410.259巴什拜青羊0.5610.4390.5610.342

2.5.2.3TYRP1基因群體遺傳結(jié)構(gòu)

研究表明，在不同毛色的巴什拜羊群體中，TYRP1基因存在兩種基因型：AA型和GG型。AA基因型在紅色被毛群體中是優(yōu)勢基因型，其基因型頻率為0.658。GG基因型在黑色被毛群體中是優(yōu)勢基因型，其基因型頻率為0.849。AA基因型在青灰色被毛群體中是優(yōu)勢基因型，其基因型頻率為0.950。在此群體中，紅色和青灰色兩種毛色中等位基因A為優(yōu)勢等位基因；黑色被毛群體中等位基因G為優(yōu)勢等位基因。巴什拜羊群體中TYRP1基因處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。在巴什拜羊紅色和青灰色被毛群體中AA基因型的個體數(shù)高于GG基因型的個體數(shù)；在巴什拜羊黑色被毛群體中GG基因型的個體數(shù)低于AA基因型的個體數(shù)。TYRP1基因的兩種基因型個體數(shù)在三種不同毛色的群體中差異不顯著(P>0.05)。表5

表5TYRP1基因型頻率和等位基因頻率圖表
Table 5TYRP1 genotype frequency and allele frequency chart

毛色基因型和基因型頻率Genotype and genotype frequency等位基因頻率Allele frequencyAAGGABX2紅色0.658(48)0.342(25)0.658(96)0.342(50)3.11黑色0.151(8)0.849(45)0.151(16)0.849(90)28.84青灰色0.950(38)0.050(2)0.950(76)0.050(4)0.02

2.5.2.4TYRP1基因遺傳參數(shù)值

對巴什拜羊TYRP1基因的純合度、雜合度、有效等位基因和多態(tài)信息含量進行分析。紅色被毛的巴什拜羊中純合度為0.550，雜合度為0.450，有效等位基因數(shù)為1.819，多態(tài)信息含量為1.297。黑色被毛的巴什拜羊中純合度為0.744，雜合度為0.256，有效等位基因數(shù)為1.345，多態(tài)信息含量為0.223。青灰色被毛的巴什拜羊中純合度為0.905，雜合度為0.095，有效等位基因數(shù)為1.105，多態(tài)信息含量為0.090。從表6可知TYRP1基因在此群體中，紅色被毛多態(tài)信息含量處于高度多態(tài)，黑色和青灰色被毛多態(tài)信息含量處于低度多態(tài)。表6

表6 巴什拜羊TYRP1基因遺傳參數(shù)
Table 6 Genetic parameters of TYRP1 gene in Bashbai sheep

品種Breed基因純合度(Ho)基因雜合度(He)有效等位基因數(shù)(Ne)多態(tài)信息(PIC)巴什拜紅羊0.5500.4501.8191.297巴什拜黑羊0.7440.2561.3450.223巴什拜青羊0.9050.0951.1050.090

3 討 論

基因調(diào)控系統(tǒng)對色素的形成有重要作用，以及導致色素沉著的基因，決定色素顆粒的顏色基因，不作用于色素，影響毛發(fā)的顏色強度的顏色基因，基因決定羊毛的色素分布[10]。黑色素和棕色黑色素是由毛囊的黑色素細胞產(chǎn)生的，它們的比例決定了哺乳動物毛發(fā)的顏色[11]。

棕色黑色素和黑色的出現(xiàn)表明真黑色素的沉積量大，紅色頭發(fā)的外觀表明棕色色素的沉積很大，它是灰色或白色，黑色素中的黑色素細胞黑色素越來越少[12]。目前，在性染色體中未發(fā)現(xiàn)控制毛發(fā)顏色的基因，可以說羊毛顏色的遺傳與性別無關(guān)[13]。與黑素細胞相鄰的真皮乳頭細胞分泌Agouti，一種作用于毛囊培養(yǎng)基的旁分泌信號分子，因此,α-黑素細胞刺激激素(α-MSH)不與受體結(jié)合，從而抵消黑色素的產(chǎn)生[14]。李洪濤等[15]研究了哈薩克羊的不同毛色，發(fā)現(xiàn)Agouti基因的第二外顯子和第四外顯子具有缺失和突變，但與哈薩克羊的顏色無顯著相關(guān)。韓吉龍等[16]發(fā)現(xiàn)藏羊的Agouti基因中只有兩個SNP是缺失和突變。 白色覆蓋組織的mRNA表達在同一個體中最低，但基因的兩個突變和拷貝數(shù)與毛色無關(guān)。

在烏骨羊的TYR基因的研究中發(fā)現(xiàn)有兩處同義處變在第一外顯子中?；蛐虶G和GC與綿羊黑骨血液中酪氨酸的活性成分有關(guān)。研究表明，CC基因型個體具有較高的酪氨酸活性[17]。李世軍等[18]實時定量PCR用于研究TYR基因與白羽和黑鴨羽毛之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)TYR基因在黑色羽毛中的表達比白色羽毛高100倍。研究認為TYR的表達水平在黑鴨的羽毛中很高。姜俊兵等[19]采用半定量PCR方法檢測了TYR基因在不同羊駝皮膚組織中的表達，發(fā)現(xiàn)白色被毛羊駝中TYR基因的表達水平低于有色被毛羊駝的表達水平，表明在羊駝TYR基因?qū)Ρ幻伾哂姓{(diào)節(jié)作用。

參與不同被毛顏色調(diào)控的基因中也有TYRP1基因。在一對非洲裔美國人的雙卵雙胞胎中(一個有白化病，一個有正常的膚色)，發(fā)現(xiàn)TYRP1基因的第六個外顯子缺少堿基，導致編碼氨基酸密碼子的變化，這導致多肽的形成。黑色素合成過程中酪氨酸酶 (TYR)是關(guān)鍵酶，酪氨酸酶相關(guān)蛋白1 (TYRP1)，酪氨酸酶相關(guān)蛋白2 (TYRP2)各自催化特異的反應(yīng)[20]。王秋楓等(2003)[21]研究發(fā)現(xiàn)，鼠TYRP1與人的TYRP1同源性為93%，鼠TYRP2與人TYRP2同源性為84%。

酪氨酸酶、TYRP1和TYRP2三者之間的同源性人約為40%。黑色素合成途徑中TYRP1和TYRP2是具有調(diào)控作用。這三種蛋白編碼不同，在染色體上定位不同，在黑色素合成過程中起的作用不同，但在序列上有一些同源性，共同構(gòu)成了“酪氨酸酶蛋白家族”[20]。

研究分析了ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因由測序結(jié)果分析表明，氨基酸序列中的堿基缺失會導致基因的多態(tài)性。木合依扎·熱很別克等[23]在哈薩克羊上的研究結(jié)果與研究結(jié)果一致。在巴什拜羊群體中由于基因突變而出現(xiàn)了毛色的表現(xiàn)型有所不同。不同顏色的被毛出現(xiàn)是由于機體內(nèi)黑色素和褐黑素的表達量不同而不同。ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因?qū)谏睾秃趾谒鼐哂姓{(diào)控作用。具體調(diào)控機制有待進一步研究。

4 結(jié) 論

4.1ASIP基因和TYRP1基因都有兩種基因型；分別有純合子AA、雜合子AB和純合子AA、GG兩種基因型。TYR基因有三種基因型為AA型、AG型和GG型。

4.2ASIP基因和TYRP1基因在巴什拜羊群體中都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；TYR基因在巴什拜羊紅色被毛群體中處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)；TYR基因在巴什拜羊黑色和青色被毛群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

4.3ASIP基因此群體中，紅色被毛多態(tài)信息含量為中度多態(tài)；黑色和青灰色被毛多態(tài)信息含量為低度多態(tài)。TYR基因在此群體中，紅色被毛多態(tài)信息含量處于低度多態(tài)，黑色和青灰色被毛多態(tài)信息含量處于中度多態(tài)。TYRP1基因在此群體中，紅色被毛多態(tài)信息含量處于高度多態(tài)，黑色和青灰色被毛多態(tài)信息含量處于低度多態(tài)。

4.4TYRP2基因PCR-SSCP檢測結(jié)果沒有顯示多態(tài)。

4.5ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因多態(tài)性與巴什拜羊的毛色性狀有相關(guān)性。