朱宗財,張王斌,2,李亞鵬,嚴海璘，儀子博

(1.塔里木大學植物科學學院，新疆阿拉爾 843300；2.塔里木大學南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】新疆果園主要是以蘋果和庫爾勒香梨為主。在我國中西部和西南省區(qū)，均將蘋果產(chǎn)業(yè)列為經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)[1]。新疆蘋果產(chǎn)量在全國蘋果產(chǎn)量所占比只有2%左右，但新疆蘋果具有明顯的產(chǎn)業(yè)發(fā)展優(yōu)勢，特別是阿克蘇地區(qū)的冰糖心蘋果[2]。庫爾勒香梨作為新疆的特色果業(yè)，在我國的梨產(chǎn)業(yè)中占有重要地位，庫爾勒香梨的收入已占到農(nóng)民人均收入的1/3[3]。腐爛病是普遍存在的一類重要病害，造成許多木質(zhì)宿主死亡[4]。腐爛病在新疆的發(fā)生逐年加重嚴重影響了該地區(qū)林果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，造成了巨大的經(jīng)濟損失[5-6]?！厩叭搜芯窟M展】蘋果樹腐爛病(ValsamaliMiyabeetYamada)在新疆阿克蘇局部地區(qū)發(fā)生嚴重，主要原因是當年冬季干旱少雪，發(fā)生凍害，導致了腐爛病嚴重發(fā)生[7]。D.E.Brown-Rytlewski 和 P.S.McManus在美國威斯康星州首次發(fā)現(xiàn)蘋果腐爛病，并確定為Leucostoma(Cytospora)引起的[8]。Alan R.Biggs等[9]的研究結果表明,蘋果腐爛病病原菌的無性型為蘋果干腐爛殼囊孢菌(CytosporamandshuricaMiura)，屬無性孢子類殼囊泡屬，有性型為蘋果黑腐皮殼菌(ValsamaliMiyabeetYamada)，屬子囊菌門黑腐皮殼屬。王衛(wèi)雄[10]利用多基因聯(lián)合分析甘肅省蘋果樹腐爛病菌的類群。庫爾勒香梨樹腐爛病菌為梨幹腐爛殼蕉孢菌 (C.carphospermaFr.)屬于半知菌亞門殼囊孢屬[11-12]。新疆楊樹腐爛病病原有性型為子囊菌亞門的污黑腐皮殼屬(ValsasordidaNit)，其無性型為金黃殼囊孢菌(Cytosporachrysosperm)。病原菌交互侵染主要發(fā)生于人與動物之間，而在植物間也發(fā)現(xiàn)病原菌的交互侵染。呂蕊花等[13]發(fā)現(xiàn)油菜(BrassicanapusL.)和桑葚(FructusMori)的菌核病菌存在交互侵染。朱婕[14]發(fā)現(xiàn)新疆庫爾勒香梨和楊樹腐爛病的癥狀十分相似，進行室內(nèi)枝條接種試驗發(fā)現(xiàn)兩種腐爛病存在交互侵染。交互侵染還存在于禾本科作物之間，研究發(fā)現(xiàn)稻瘟病在雜交稻和糯稻(OryzasativaL.var.GlutinosaMatsum)之間可以進行交互侵染[15]。黃萎病作為一種棉花(Gossypiumspp.)的主要病害，研究發(fā)現(xiàn)黃萎病可以在棉花、向日葵(HelianthusannuusL.)、苘麻(AbutilontheophrastiMedicus)、綠豆(Vignaradiata(Linn.)Wilczek)、榆樹(UlmuspumilaL.)、白菜(Brassicarapavar.glabra)和茄子(SolanummelongenaL.)之間交互侵染，所以在棉區(qū)要避免這幾種作物的混種[16]。在瓜類上也存在交互侵染的情況，例如瓜類白粉菌(Erysiphecucurbi-tacearumZhengetchen)可以在甜瓜(Cucumismelo)、黃瓜(CucumissativusL.)、西葫蘆(CucurbitapepoL.)和南瓜(Cucurbitamoschata)上交互侵染[17]。B.K.M.Lakshmi[18]研究了熱帶水果的重要病害炭疽病(ColletotrichumgloeosporioidesPenz)，他將不同寄主來源的炭疽病(Bacillusanthracis)分別在芒果(MangiferaindicaL.)、酸橙(CitrusaurantiumL.)、番荔枝(AnnonasquamosaLinn)、石榴(PunicagranatumL.)、木瓜(Chaenomelessinensis(Thouin)Koehne)、腰果(AnacardiumoccidentalieLinn)和番石榴(PsidiumguajavaLinn)發(fā)現(xiàn)這七種水果之間存在交互侵染?！颈狙芯壳腥朦c】以新疆果園為微生態(tài)環(huán)境，研究不同寄主間腐爛病菌是否存在交互侵染。【擬解決的關鍵問題】采集新疆阿克蘇地區(qū)五團果園蘋果、庫爾勒香梨和新疆楊的腐爛病病樣，分離純化，通過科赫氏法則驗證后進行交互接種。將菌株的β-tubulin和EF-1α基因序列在GenBank查找并下載同源序列，采用鄰結法(Neighbor-joining，NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行序列分析。分析新疆果園微生態(tài)環(huán)境下不同寄主間腐爛病菌是否存在交互侵染情況。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

表1 供試腐爛病菌株信息
Table 1 Information of rot pathogen strains tested

分離株Lsolote寄主Host地點OriginWT-PG-1蘋果(Malus pumila)新疆阿克蘇地區(qū)WT-PG-2蘋果(Malus pumila)新疆阿克蘇地區(qū)WT-PG-3蘋果(Malus pumila)新疆阿克蘇地區(qū)WT-PG-4蘋果(Malus pumila)新疆阿克蘇地區(qū)WT-XJY-1新疆楊(Populus bolleana)新疆阿克蘇地區(qū)WT-XJY-2新疆楊(Populus bolleana)新疆阿克蘇地區(qū)WT-XL香梨(Pyrus sinkiangensis)新疆阿克蘇地區(qū)

1.2 方 法

1.2.1 室內(nèi)交叉接種

將經(jīng)過科赫氏法則驗證的菌株接種于PDA(Potato Dextrose Agar)平板25℃培養(yǎng)3 d，接種方法參考嚴海璘等[19]略有改進。在塔里木大學校內(nèi)分別采集蘋果、新疆楊和庫爾勒香梨1～2年生枝條，將采集來的枝條用枝剪成長度為10 cm的小枝條。先用純凈水清洗2～3次，再用蒸餾水清洗2～3次，待供試枝條水分干之后，用75%酒精擦拭消毒。將16×2(cm)消毒盤用處理枝條的方法進行處理后，在消毒盤上鋪上2層紗布，將其置于無菌操作臺用紫外燈滅菌5 min。將5 mm打孔器沾酒精置于酒精燈火焰上進行消毒，在處理過的枝條上進行燙傷打孔，將培養(yǎng)3 d的菌株用5 mm打孔器打成菌餅接種于枝條上，置于消毒盤，重復10次。向消毒盤加入適量的無菌水，用保鮮膜進行封口。將其置于25℃培養(yǎng)箱光照/黑暗(12 h/12 h)培養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況。

1.2.2 菌絲體的培養(yǎng)與收集

將暗培養(yǎng)3 d的菌株用打孔器取5～6個菌餅放置于含有50 mL PD的150 mL的錐形瓶中，置于25℃搖床160 r/min培養(yǎng)5 d。用無菌處理的紗布過濾菌塊，用無菌水沖洗3次，再用滅菌的濾紙吸干水分，經(jīng)冷凍干燥后，保存于-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2.3 菌絲體基因組總DNA的提取

采用改進的CTAB法提取菌株基因組總DNA[20-21]。將保存于-80℃超低溫冰箱的菌體拿出，加入液氮研磨成粉，加入提前65℃預熱的2×CTAB，迅速劇烈震蕩，65℃水浴30 min。加入500 μL氯仿(CHCl3)和500 μL的Tris飽和酚，劇烈震蕩混勻。將其置于4℃冷凍高速離心機12 000 r/10 min。取上清與新的離心管，加入1 mL氯仿(應等于上清體積)，劇烈震蕩混勻。將其置于4℃冷凍高速離心機12 000 r/10 min(中間白色層基本消失時可進行沉淀)。取上清至新的離心管中，加入1 mL異丙醇(沉淀DNA)和100 μL的乙酸鈉(輔助沉淀)，溫和顛倒混勻。置于-20℃沉淀2 h，之后置于室溫放置5 min，12 000 r/10 min，棄上清。加入1 mL 75%酒精并將沉淀從管底彈起，使其浮與酒精中。12 000 r/10 min，棄上清(超凈工作臺吹10 min)。加入適量Tris-EDTA緩沖液，-20℃保存。

1.2.4 EF-1α和β-tubulin基因的PCR擴增

采用EF-1α的通用引物728F(5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3')和986R(5'-ACTTGAA

GGAACCCTTACC-3')擴增EF-1α基因片段[22-23]；采用通用引物Bt2a(5'-GGTAACCAAATCGG

TGCTGCTTTC-3')和Bt2b(5'-ACCCTCCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3')擴增β-tubulin基因片段。表2

EF-1α反應條件為94℃預變性4 min；94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，40個循環(huán)；最后，72℃延伸10 min，4℃保存；β-tubulin反應條件為94℃預變性3 min，94℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸 1 min，共38個循環(huán)，接著72℃延伸10 min，最后并于4℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖進行電泳檢測后，由上海生工科技股份有限公司進行測序。

表2 PCR擴增體系
Table 2 PCR amplification system

反應液Reaction Content體積Volume(μL)5'Primer1.03'Primer1.0Taq MasterMix5.0Template1.0ddH2OTotal volume17.025.0

1.2.5 EF-1α和β-tubulin基因的序列對比和系統(tǒng)發(fā)育樹構建

將各個菌株的EF-1α和β-tubulin基因的序列提交至NCBI中GenBank的BLAST程序與已知序列進行對比并下載同源序列。用DNAMAN中Sequence程序的multiple sequence Alignment進行對比，并用MEGA 7.0.26[24]中的Align DNA分析進行人工調(diào)整，刪除兩端不齊的堿基，采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，全面分析系統(tǒng)發(fā)育樹的各分支序列。

2 結果與分析

2.1 枝條交互侵染接種

研究表明，來源于蘋果、新疆楊和庫爾勒香梨的腐爛病病菌在進行交互侵染時，均能夠引起發(fā)病。其中寄主為庫爾勒香梨的腐爛病菌侵染新疆楊枝條發(fā)病最早，在接種第1 d出現(xiàn)病斑，侵染蘋果的在第2 d出現(xiàn)病斑。寄主為新疆楊的腐爛病菌的腐爛病侵染庫爾勒香梨和蘋果枝條發(fā)病次之，均在第3 d出現(xiàn)病斑。寄主為蘋果的腐爛病菌侵染庫爾勒香梨枝條發(fā)病較晚，在第4 d出現(xiàn)病斑，侵染新疆楊枝條在第3 d出現(xiàn)病斑。發(fā)病率100%的為蘋果腐爛病菌侵染庫爾勒香梨枝條(B)、楊樹腐爛病菌侵染庫爾勒香梨枝條(D)和庫爾勒香梨腐爛病菌侵染蘋果枝條(F)。發(fā)病率80%的為楊樹腐爛病菌侵染蘋果枝條(C)。發(fā)病率70%的為蘋果腐爛病菌侵染新疆楊枝條(A)。新疆楊枝條接種腐爛病菌后病斑為暗褐色。庫爾勒香梨枝條接種腐爛病菌后，病斑初期為暗黃色，后期在病斑周圍呈黑色。蘋果枝條接種腐爛病菌后病斑為暗黃色。圖1

注：A：蘋果腐爛病菌侵染新疆楊枝條；B：蘋果腐爛病菌侵染庫爾勒香梨枝條；C：楊樹腐爛病菌侵染蘋果枝條；D：庫爾勒香梨腐爛病侵染新疆楊枝條；E：楊樹腐爛病菌侵染庫爾勒香梨枝條；F：庫爾勒香梨腐爛病菌侵染蘋果枝條

Note: A: Xinjiang Poplar branch infected by Apple canker; B: Fragrant Pear branch infected by Apple canker; C: Apple infected branch by Xinjiang Poplar canker; D: Xinjiang Poplar branch infected by Fragrant Pear canker; E: Fragrant Pear branch infected by Xinjiang Poplar canker; F: Apple branch infected by Fragrant Pear canker

圖1 室內(nèi)交互侵染結果
Fig. 1 The result of the indoor interactive infection

2.2 菌株總DNA的提取及檢測

運用改良的CTAB法提取菌株的總DNA結果表明，經(jīng)1%瓊脂糖進行電泳檢測后，條帶清晰，所提DNA可用于下步實驗。圖2

圖2 DNA提取結果
Fig. 2 The result of the DNA

2.3 β-tubulin和EF-1α基因的PCR擴增

β-tubulin的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖進行電泳檢測后，結果顯示，條帶清楚，大小約為280 bp。圖3

圖3 供試菌株β-tubulin擴增結果
Fig. 3 The result of the PCR amplification products of β-tubulin sequences

2.4 EF-1α基因的PCR擴增

EF-1α的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖進行電泳檢測后，結果顯示，條帶清楚，大小約為500 bp。圖4

圖4 供試菌株EF-1α擴增結果
Fig. 4 The result of the PCR amplification products of EF-1α sequences

2.5 β-tubulin和EF-1α序列

將各個菌株的β-tubulin和EF-1α基因的序列提交至NCBI中GenBank的BLAST與已知序列進行對比并下載同源序列。

將下載的同源性較高的16個β-tubulin序列與分離的7個菌株的β-tubulin序列，利用MEGA 7.0.26軟件分析。β-tubulin序列分析顯示主要分為三大類并且三大類的延展度大于99。其中來源于蘋果、新疆楊和庫爾勒香梨的腐爛病β-tubulin序列與各自同源序列聚為一支。來源于蘋果和新疆楊的腐爛病菌的病原為Valsamalivar，其中來源于蘋果的腐爛病菌的病原為Valsamalivar.mail，來源于新疆楊的腐爛病菌的病原為Valsamalivar.pyil。來源于庫爾勒香梨的腐爛病菌的病原為valsasordida。蘋果樹腐爛病菌的8個同源序列寄主都為蘋果，而新疆楊腐爛病菌的5個同源序列中寄主有梨和蘋果。庫爾勒香梨腐爛病菌的3個同源序列寄主都為楊樹。表3，表4

將下載的同源性較高的10個EF-1α序列與分離的7個菌株的EF-1α序列，利用MEGA 7.0.26軟件分析。EF-1α序列分析顯示主要分為三大類并且三大類的延展度大于99。EF-1α序列分析結果顯示蘋果樹腐爛病菌的5個同源序列寄主都為蘋果，而新疆楊腐爛病菌的3個同源序列都為蘋果。庫爾勒香梨腐爛病菌的2個同源序列寄主都為楊樹。

表3 供試菌株β-tubulin序列的同源序列
Table 3 Homologous sequence of the β-tubulin sequence of tested strains

分離株Isolate同源序列Homologous sequence相似度SimilarityWT-PG-1,WT-PG-2, WT-PG-3,WT-PG-4JQ900342、JQ900344、JQ900348、JQ900349JQ900352、JQ900355、JQ900357、KT934371超過 98%WT-XJY-1,WT-XJY-2 JQ900358、JQ900364、JQ900366、KT934372、KT93436999%WT-XLKT590410、KT934375、KT934376超過 96%

表4 供試菌株EF-1α序列的同源序列
Table 4 Homologous sequence of the EF-1α sequence of each isolate

分離株Isolate同源序列Homologous sequence相似度SimilarityWT-PG-1,WT-PG-2, WT-PG-3,WT-PG-4JQ900314、JQ900317、JQ900319、JQ900320JQ900323超過97%WT-XJY-1,WT-XJY-2KX273798、KX273819、KX27381099%WT-XLJX438549、TX438550超過 96%

在基于β-tubulin序列和EF-1α序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，7株不同寄主來源的菌株主要分為兩大支分別是Valsamalivar和valsasordida，其中蘋果的腐爛病菌為Valsamalivar.mail，寄主為新疆楊的為Valsamalivar.pyil。其中寄主為蘋果和新疆楊的腐爛病菌同屬一大支，相較于寄主為庫爾勒香梨的腐爛病病菌親緣關系近。圖5，圖6

圖5 β-tubulin序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹 (NJ)
Fig. 5 Phylogram using β-tubulin equences data

圖6 EF-1α序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹 (NJ)
Fig. 6 Phylogram (NJ) constructed by EF-1 α sequence data

3 討 論

研究以新疆蘋果園為微生態(tài)環(huán)境，研究不同寄主間腐爛病菌是否存在交互侵染。在新疆獨特的綠洲農(nóng)業(yè)中形成了多種林木共存的特點，在一定程度上增加了不同寄主間腐爛病交互侵染的頻率。在對采集來的蘋果、新疆楊和庫爾勒香梨樹腐爛病病樣進行分離純化后，經(jīng)過科赫氏法則驗證，進行交互接種，發(fā)現(xiàn)均可成功侵染。除了室內(nèi)接種分析外，還利用腐爛病菌株的β-tubulin基因和 EF-1α基因序列在NCBI下載同源序列，利用鄰結法進行建樹對腐爛病菌進行分析發(fā)現(xiàn)，寄主為蘋果的腐爛病菌的同源序列寄主為蘋果，但寄主為新疆楊的同源序列的寄主有蘋果和梨，寄主為庫爾勒香梨的同源序列寄主為楊樹，結合交互侵染實驗可以證明這腐爛病菌在蘋果、新疆楊和庫爾勒香梨之間可交互侵染。有研究表明不同寄主來源的腐爛病菌在不同的寄主之間存在交互侵染[25-26]。唐俊煜等[11]研究了棗園不同林木腐爛病之間的親緣關系，結果顯示不同寄主的腐爛病可能存在交互侵染。與研究結果一致。交互侵染不僅存在于林果腐爛病之間，在其他作物間也有發(fā)生。有研究表明，馬鈴薯和向日葵的大麗輪枝菌也存在交互侵染[27]。引起小麥、玉米、水稻、谷子和高粱等作物紋枯病這5種禾谷類作物均可交互侵染[28]。西瓜與棉花的枯萎病菌、小麥與水稻的霜霉病、玉米與高粱的絲黑穗菌之間存在交互侵染[29-31]。Phoulivong S W等[32]從辣椒、咖啡、龍眼、芒果、木瓜和辣椒的果實中分離出炭疽菌菌株，進行了交互侵染，結果發(fā)現(xiàn)均能夠進行交互感染。O.M.Olanya等[33]在馬鈴薯種植地的毛龍葵(Solanumsarrachoides)上發(fā)現(xiàn)了馬鈴薯晚疫病(Phytophthorainfestans(Mont.)deBary)，研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯晚疫病在毛龍葵與馬鈴薯上存在交互侵染。Mark L.Farman[34]研究發(fā)現(xiàn)馬唐、水稻或狗尾草的灰斑病分離株不會引起黑麥草(Loliumperenne)灰斑病流行，引起黑麥草灰斑病是由P.grisea種群引起的。

這些存在交互侵染的作物首先在地理位置上來說相鄰種植，而且在遺傳距離上來說也較近。進而造成這些作物在發(fā)生一些病害時會存在交互侵染。在新疆南疆地區(qū)果園栽培模式下，尤其在阿克蘇地區(qū)，蘋果果園、庫爾勒香梨園和紅棗園臨近種植的現(xiàn)象十分普遍，個別果園甚至存在多個樹種共存的現(xiàn)象，而楊樹作為行道樹和果園農(nóng)田防護林隨處可見。由于新疆楊耐旱成活率高的特點，進而果園大都以新疆楊為防護林。所以在一定程度上增加了林果樹木腐爛病的交互侵染。研究發(fā)現(xiàn)腐爛病菌在蘋果、新疆楊和庫爾勒香梨之間存在交互侵染，因此，發(fā)生腐爛病的果園可通過周邊防護林向未發(fā)生的腐爛病果園傳播。在進行果園腐爛病防治時，應該充分考慮存在交互侵染的現(xiàn)象，把果園周圍防護林也納入防治范圍。當周圍果園腐爛病嚴重時，要加強防范意識，提前做好預防措施。新建果園時應該更加關注病害之間的交互侵染的問題，使果園潛在病害發(fā)生率降到最低，以達到增產(chǎn)增收的目的。研究在室內(nèi)條件下，研究了林果樹腐爛病菌在蘋果、新疆楊和庫爾勒香梨可交互侵染，但是其在田間的侵染行為尚需驗證和其流行規(guī)律也需要進一步深入研究。

4 結 論

4.1 室內(nèi)利用枝條接種交互侵染發(fā)現(xiàn)來源于蘋果、庫爾勒香梨和新疆楊的腐爛病病菌均能夠互相侵染成功。其中寄主為庫爾勒香梨的腐爛病菌侵染新疆楊枝條發(fā)病最早、寄主為新疆楊的腐爛病菌的腐爛病侵染庫爾勒香梨和蘋果枝條發(fā)病次之、寄主為蘋果的腐爛病菌侵染庫爾勒香梨枝條發(fā)病較晚。進行室內(nèi)枝條接種還發(fā)現(xiàn)有4組發(fā)病率為100%，其余兩組均在70%以上。

4.2 寄主為蘋果的腐爛病菌的同源序列寄主為蘋果，但寄主為新疆楊的同源序列的寄主有蘋果和梨，寄主為庫爾勒香梨的同源序列寄主為楊樹。而且這7株不同寄主來源的菌株主要分為兩大支分別是Valsamalivar和valsasordida，其中寄主為蘋果和新疆楊的腐爛病菌同屬一大支，相較于寄主為庫爾勒香梨的腐爛病病菌親緣關系近。

4.3 室內(nèi)條件下林果樹木腐爛病菌在蘋果、新疆楊和庫爾勒香梨之間存在交互侵染。