申 慧，魏冬梅，段魏魏，梁永增，王詠星

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊，830046)

0 引 言

【研究意義】水霉病是漁業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)中的常發(fā)疾病，發(fā)病范圍廣，一旦發(fā)病難以進(jìn)行有效治療，尤其在繁殖季節(jié)對(duì)魚(yú)類孵化造成較大危害。2002年傳統(tǒng)防治藥物孔雀石綠被列為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的禁用藥，科研人員雖致力于開(kāi)發(fā)新型安全的替代藥物，但截止目前產(chǎn)業(yè)中尚無(wú)廣譜、高效的水霉病防治藥物[1]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，研究人員在水霉病的生物防治研究中取得了一定的進(jìn)展，賀鳳[2]、雷翠霞[3]、劉俊[4]、宋增福[5]、Balcázar[6]等已篩選出對(duì)水霉生長(zhǎng)有較強(qiáng)抑制效果的拮抗菌，并對(duì)其拮抗物質(zhì)進(jìn)行了初步的分離鑒定。然而，由于魚(yú)類水霉病病原多樣，不同地區(qū)病原菌優(yōu)勢(shì)種群不盡相同，因而其拮抗菌的應(yīng)用具有一定的地域性限制。新疆由于其獨(dú)特的氣候和水域特點(diǎn)，是魚(yú)類水霉病的高發(fā)區(qū)，水霉病原菌優(yōu)勢(shì)種也有別于其他地區(qū)[7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于魚(yú)類水霉病病原多樣，不同地區(qū)病原菌優(yōu)勢(shì)種群不盡相同，因而其拮抗菌的應(yīng)用具有一定的地域性限制。新疆具有獨(dú)特的氣候和水域特點(diǎn)，研究分離獲得對(duì)魚(yú)類水霉病原菌有較強(qiáng)拮抗作用的拮抗菌，分析水霉拮抗菌的拮抗特性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究旨在以新疆本地分離純化的高致病性水霉病原菌為指示菌，從健康魚(yú)體表分離純化篩選具有較強(qiáng)拮抗性的細(xì)菌，并進(jìn)行鑒定和分析。為新疆魚(yú)類水霉病的防治提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 水霉病原指示菌及供試菌

LF04菌株由實(shí)驗(yàn)室前期分離獲得，并經(jīng)魚(yú)卵感染試驗(yàn)確定其為魚(yú)類水霉病原菌(科赫法則)，經(jīng)形態(tài)學(xué)及18S rDNA序列分析，鑒定其屬于水霉科，寄生水霉屬；暫命名為SaprolegniaparasiticaLF04菌株；拮抗譜供試菌LF01、HL01、HL04、JY06、JY07、JY10、LY04、HZ、HZ04均由實(shí)驗(yàn)室前期分離獲得，并經(jīng)科赫法則驗(yàn)證均為致病菌，且形態(tài)差異明顯[8]。

1.1.2 魚(yú)苗

鯉魚(yú)魚(yú)苗用于拮抗菌安全性分析，共300尾，平均體長(zhǎng)(2.5±0.3)cm；鯉魚(yú)成魚(yú)用于拮抗菌拮抗性分析，共120尾，平均體長(zhǎng)(15±1.7)cm(均由新疆兵團(tuán)水產(chǎn)技術(shù)推廣站苗種場(chǎng)提供)。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；LB培養(yǎng)基。

1.2 方 法

1.2.1 拮抗菌株的分離與純化

從健康鯉魚(yú)的體表隨機(jī)取下若干鱗片，置于錐形瓶中(無(wú)菌蒸餾水)搖床震蕩1 h。梯度稀釋菌溶液，將稀釋倍數(shù)為2、10、20、50、100及1 000倍的菌液分別涂布于無(wú)菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面，37℃下培養(yǎng)24 h。分別選取典型單一菌落平板劃線純化，對(duì)所得菌株進(jìn)行編號(hào)，4℃斜面保存，備用。

1.2.2 拮抗菌株的篩選

參照劉莉莉等[9]的方法進(jìn)行拮抗菌的篩選。運(yùn)用濾紙片對(duì)峙培養(yǎng)法，將初篩得到的菌株分別用水霉LF04為指示菌進(jìn)行抑菌活性的復(fù)篩，在PDA培養(yǎng)基的中心放置一塊直徑6 mm左右的水霉瓊脂塊，水霉菌絲面緊貼PDA培養(yǎng)基表面。在距離水霉塊25 mm處放置一片含有待測(cè)菌液的濾紙片。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d，觀察抑制效果；空白作為對(duì)照(無(wú)接種細(xì)菌)。根據(jù)抑菌譜的廣度及抑菌圈大小，選擇適宜菌株做進(jìn)一步研究。

1.2.3 拮抗菌株的形態(tài)及生化鑒定

參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]對(duì)拮抗菌株進(jìn)行形態(tài)特征觀察及生理生化等初步鑒定試驗(yàn)。包括革蘭氏染色、水解及發(fā)酵相關(guān)等18項(xiàng)試驗(yàn)。

1.2.4 拮抗菌株的分子生物學(xué)鑒定

用Ezup柱式細(xì)菌DNA提取試劑盒提取拮抗菌的DNA。以DNA為模板，使用細(xì)菌16S rDNA通用引物7F和1 540 R[11-12]，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，0.25 mmol/L dNTP 1 μL，5 U/μLTaqDNA 聚合酶(Takara)0.2 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，50 mg/μL模板DNA 0.5 μL，加超純水至總體積25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃ 4 min；94℃ 40 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。由上海生物工程有限公司檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA片段序列。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)后，運(yùn)用MEGA 7軟件，N-J法建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(自舉值Bootstrap分析采用1 000次重復(fù)抽樣)。

1.2.5 拮抗菌的安全性驗(yàn)證

試驗(yàn)前，將拮抗菌株接種到LB培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)并制備菌懸液。將購(gòu)買的魚(yú)苗置于魚(yú)缸中適應(yīng)性暫養(yǎng)2 d(25℃，充氣)。魚(yú)苗隨機(jī)分成兩組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50尾魚(yú)苗。第一組加入拮抗菌株發(fā)酵液，菌液終濃度為1×104cfu/mL；第二組為對(duì)照組，加入等體積的無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基。試驗(yàn)期間水溫控制在25℃左右，充氣。連續(xù)6 d觀察魚(yú)苗的存活情況；及時(shí)撈出死魚(yú)。

1.2.6 拮抗菌的拮抗性驗(yàn)證

選取體長(zhǎng)約為15 cm的鯉魚(yú)，在魚(yú)樣體表人工創(chuàng)傷大小相等的傷口(約面積0.5 cm2，深2～3 mm)。試驗(yàn)分成兩組，均加入終濃度為103cell/mL水霉孢子懸液。第一組加入終濃度為1×104cfu/mL的拮抗菌懸液；第二組為對(duì)照，加入等體積的無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基(每組設(shè)置三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20條鯉魚(yú))。試驗(yàn)期間水溫控制在25℃左右，充氣。連續(xù)7 d觀察魚(yú)體的感染情況(體表發(fā)現(xiàn)菌絲判定為感染)；及時(shí)撈出死魚(yú)。

1.2.7 拮抗菌拮抗穩(wěn)定性驗(yàn)證

將原代菌劃線于新的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行傳代，共傳10代。測(cè)定菌落邊緣至平板邊緣的距離(mm)，觀察拮抗菌的拮抗活性變化。

1.2.8 拮抗菌的抗菌譜測(cè)定

以實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的10株水霉菌進(jìn)行抗菌譜測(cè)定：將6 mm水霉菌瓊脂塊接種于無(wú)菌PDA培養(yǎng)基中央，活化后的拮抗菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，采用濾紙片法，在距離水霉瓊脂塊25 mm處，用移液槍吸取40 μL拮抗菌發(fā)酵液于滅菌濾紙片上，分別對(duì)10株上述活化處理的水霉病原菌株進(jìn)行拮抗譜試驗(yàn)，于25℃恒溫倒置培養(yǎng)72 h，觀察拮抗效果；空白作為對(duì)照(無(wú)接種細(xì)菌)。拮抗范圍測(cè)定所用指示菌均由實(shí)驗(yàn)室分離，經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子鑒定均為不同種屬。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22軟件One-way ANOVA法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異顯著；使用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌初篩及純化

從健康鯉體表獲得鱗片的菌懸液中共獲得50株細(xì)菌，經(jīng)濾紙片平板對(duì)峙試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其中1株細(xì)菌對(duì)水霉病原菌LF04菌株具有很強(qiáng)的抑制性，將此細(xì)菌菌株編號(hào)為JL50；對(duì)照組LF04菌株長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。圖1

圖1 拮抗菌JL50的拮抗效果
Fig.1 Antagonistic effect of antagonistic JL50

2.2 拮抗菌株的鑒定

2.2.1 JL50菌株形態(tài)觀察

JL50菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，其菌落表面相對(duì)光滑、半透明；在油鏡下觀察其革蘭氏染色為陽(yáng)性，呈細(xì)短桿狀。圖2

2.2.2 JL50菌株生理生化特性

JL50菌株經(jīng)生化實(shí)驗(yàn)觀察為需氧型細(xì)菌，可利用乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖發(fā)酵生長(zhǎng)，油脂及淀粉水解試驗(yàn)結(jié)果為陰性，菌株部分生理生化特征見(jiàn)表1。對(duì)照細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)，初步鑒定該菌株為芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬，短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)。表1

圖2 拮抗菌JL50革蘭氏染色(×1 000)
Fig.2 Gram stain of antagonistic JL50(×1,000)

表1 拮抗菌JL50的生理生化性質(zhì)
Table 1 Physiological and biochemical properties of antagonistic JL50

生化實(shí)驗(yàn) Biochemical experiment試驗(yàn)結(jié)果 Result生化實(shí)驗(yàn) Biochemical experiment試驗(yàn)結(jié)果 Result油脂分解試驗(yàn)Oil decomposition-吲哚試驗(yàn) Indole test+明膠水解試驗(yàn)Gelatin hydrolysis+甲基紅試驗(yàn) Methyl red test+尿素水解試驗(yàn)Urea hydrolysis+伏-普試驗(yàn) Volt-general test+淀粉分解試驗(yàn)Starch decomposition-H2S試驗(yàn) H2S test-乳糖發(fā)酵Lactose fermentation+檸檬酸鹽試驗(yàn) Citrate test+麥芽糖發(fā)酵Maltose fermentation+穿刺培養(yǎng)試驗(yàn) Puncture culture+蔗糖發(fā)酵Sucrose fermentation+好氧性試驗(yàn) Aerobic test需氧葡萄糖發(fā)酵Glucose fermentation+適宜pH試驗(yàn) Optimal pH5～8適宜溫度試驗(yàn) Optimal temperature10～45℃試管液體靜止培養(yǎng) Static culture+

注: “+”表示陽(yáng)性，“-”表示陰性

Note: "+" is positive, and "-" is negative

2.2.3 JL50菌株基因同源性鑒定

根據(jù)測(cè)序結(jié)果可知，JL50菌株16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 455 bp，通過(guò)與NCBI中8模式菌株的16S rDNA 序列比對(duì)分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建， JL50菌株與短小芽孢桿菌Bacilluspumilusstrain ATCC 7 061 (GenBank 登錄號(hào)NR 043242) 同源性最近，相似性為100%。綜合菌株的培養(yǎng)特征、形態(tài)和生理生化特征及16S rDNA序列分析結(jié)果，判定該菌株為短小芽孢桿菌Bacilluspumilus。圖3

圖3 鄰接法構(gòu)建JL50菌株 16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
Fig.3 Phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences by neighbor-joining method

2.3 JL50菌株拮抗特性

2.3.1 JL50菌株對(duì)魚(yú)苗的安全性

研究表明，隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組存活率均呈下降趨勢(shì)。試驗(yàn)組與對(duì)照組魚(yú)苗的存活率在第1 d和第2 d無(wú)顯著差異(P>0.05)，但隨著試驗(yàn)天數(shù)的增加。試驗(yàn)6 d后，實(shí)驗(yàn)組存活率為73%，而對(duì)照組存活率僅為61%，差異顯著(P<0.05)。圖4

圖4 魚(yú)苗的存活率
Fig.4 The survival rate of the fry

2.3.2 JL50菌株拮抗活性

研究表明，試驗(yàn)第1 d，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均未出現(xiàn)水霉感染；試驗(yàn)第2 d，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組開(kāi)始出現(xiàn)水霉感染現(xiàn)象，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組感染率分別為8.3%和1.7%；試驗(yàn)第4 d，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組感染率分別為36.7%和13.3%；試驗(yàn)7 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組累積感染率為53.3%，對(duì)照組累積感染率為95%，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。圖5

圖5 鯉魚(yú)7 d感染率
Fig.5 The 7 d infection rate of carp

2.3.3 JL50菌株拮抗穩(wěn)定性

為了獲得JL50菌株的拮抗穩(wěn)定性，將JL50菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，共傳代10代。原代菌對(duì)水霉的抑制率為61.3%，經(jīng)過(guò)10次傳代以后，其抑制率為63.6%。JL50菌株在傳代過(guò)程中，其拮抗活性比較穩(wěn)定，無(wú)較大波動(dòng)，拮抗活性在62%上下變動(dòng)。圖6

圖6 傳代次數(shù)與菌絲抑制率關(guān)系
Fig.6 Relationship between the number of passages and the inhibition rate of mycelium

2.3.4 JL50菌株拮抗范圍

研究表明，拮抗菌JL50對(duì)水霉LF01和水霉LF04拮抗作用明顯，其拮抗譜較窄，僅對(duì)特定的水霉病原菌有拮抗性。圖7

注：供試水霉菌株編號(hào)：A:LF01 B:LF04 C:HL01 D:HL04 E:JY06 F:JY07 G:JY10 H:LY04 I:HZ J:HZ04 培養(yǎng)皿中心為供試水霉瓊脂塊，蘸有拮抗菌發(fā)酵液的濾紙片置于距瓊脂塊25 mm處

Note: the number of the tested Saprolegnia strains. A:LF01 B:LF04 C:HL01 D:HL04 E:JY06 F:JY07 G:JY10 H:LY04 I:HZ J:HZ04 The center of the culture dish is to test the Saprolegnia strains agar block, and the filter paper dipped in the fermentation liquid of antagonistic bacteria is placed at 25 mm away from the agar block

圖7 JL50菌株抑制效果實(shí)驗(yàn)
Fig.7 The inhibitory effect of strain JL50

3 討 論

水霉病是養(yǎng)殖業(yè)中危害較大的真菌性疾病之一，新疆由于其水域的特殊性，水溫常年較低，有利于水霉菌的爆發(fā)與傳播；且部分地區(qū)水質(zhì)鹽堿度較高，對(duì)于潑灑氯化鈉等防治方法較耐受，故尋找更為有效的水霉病防治方法需求急迫[7]。利用生物間的拮抗作用，進(jìn)行疾病防止已被廣泛應(yīng)用。其中利用拮抗菌對(duì)水霉菌進(jìn)行的研究也有相關(guān)報(bào)道，Lategan等[13-14]發(fā)現(xiàn)中間氣單孢菌(Aeromonasmedia)A199菌株可以用于治療人工感染水霉的澳洲鰻鱺(AnguillaaustralisRichardon)及自發(fā)感染水霉的銀鋸鯻(Bidyanusbidyanus)，并取得了一定效果；Kentaro Takada[15]發(fā)現(xiàn)鏈霉菌KS84中含有可以抗寄生水霉(Saprolegniaparasitica)的物質(zhì)，并解析了其結(jié)構(gòu)。張書(shū)俊等[16]發(fā)現(xiàn)從水霉病害水體中分離的黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，其對(duì)水霉菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)具有明顯的抑制作用；呂利群等[17]從養(yǎng)殖水體附近的土壤中分離得到的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)Sh1菌株，能明顯抑制水霉菌菌絲的生長(zhǎng)，并驗(yàn)證了其活性成分非蛋白質(zhì)且熱穩(wěn)定性好；劉莉莉等[9]從枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)TCCC11201菌株的發(fā)酵液中分離的粗蛋白，對(duì)水霉病原菌具有很強(qiáng)抑制作用；趙春暉等[18]發(fā)現(xiàn)在功能性拮抗菌芽孢桿菌(Bacillusspp)TCCC11322菌株的培養(yǎng)上清液中，存在有明顯抑制水霉生長(zhǎng)的分泌性蛋白成分；陳飄等[19]從健康的養(yǎng)殖水體底泥中分離得到了鏈霉菌屬(Streptomycetesp.)的3株拮抗放線菌，均能抑制對(duì)水霉菌絲的生長(zhǎng)，且對(duì)抑制水霉生長(zhǎng)具有協(xié)同作用。以上研究均證明，利用拮抗菌防治魚(yú)類水霉病具有可能性。

短小芽孢桿菌對(duì)水產(chǎn)弧菌有一定拮抗作用[20-21]，作為復(fù)合型益生菌中的一員在魚(yú)類養(yǎng)殖中已經(jīng)有廣泛的應(yīng)用[22]，具有促進(jìn)飼料利用效率[23]，提高魚(yú)類抗病力，減少魚(yú)類疾病發(fā)生[24-26]，改善養(yǎng)殖環(huán)境，調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水質(zhì)，維護(hù)微生態(tài)平衡[27]等特點(diǎn)，但國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)短小芽孢桿菌對(duì)水霉病原菌拮抗的報(bào)道，試驗(yàn)結(jié)果不僅為魚(yú)類水霉病的生物防治提供了依據(jù)，還為短小芽孢桿菌作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的益生菌的作用進(jìn)行了拓展，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍；為益生菌可作為拮抗菌的應(yīng)用探索提供了思路。

4 結(jié) 論

研究從健康鯉魚(yú)體表分離得到1株對(duì)水霉病原菌有顯著抑制作用的拮抗菌JL50，經(jīng)鑒定該拮抗菌為短小芽孢桿菌，該菌株可顯著抑制特定水霉病原菌的生長(zhǎng)(P<0.05)，并能顯著提高鯉魚(yú)苗的成活率(P<0.05)，且該菌株傳代穩(wěn)定性好，對(duì)水霉病原菌的拮抗譜較窄，針對(duì)性較強(qiáng)。