趙園園，劉議蔚，張正海，曹亞從，于海龍，張寶璽，高 杰，王立浩

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

0 引 言

【研究意義】辣椒(Capsicumspecies.)屬于茄科(Solanaceae)辣椒屬(Capsicum)，起源于南美洲的秘魯至中美洲墨西哥地區(qū)。辣椒易受到諸多病蟲害侵害、如細(xì)菌性病害、真菌性病害、卵菌類病害、病毒病、根結(jié)線蟲病[1]。辣椒炭疽病是一種真菌性病害。炭疽病原菌危害辣椒葉、莖及果實(shí),引起落葉、莖枯及爛果,導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)[2]。炭疽菌不僅為害辣椒，也是為害茄子、番茄等作物的主要病害之一。【前人研究進(jìn)展】C.annuum是世界上種植最廣泛的辣椒種，這個(gè)種中極度缺乏抗炭疽病的材料。而亞洲蔬菜研究發(fā)展中心AVRDC和韓國(guó)鑒定表明C.chinense和C.baccatum中存在高抗炭疽病的基因[3]。實(shí)際育種過程中，因C.chinense比C.baccatum與C.annuum的親和力強(qiáng)，故通常用C.chinense和C.annuum種間雜交獲得抗病自交系[4]。不同研究者對(duì)辣椒炭疽病遺傳機(jī)制有不同的研究結(jié)果。Cheema等于1984年報(bào)道辣椒抗黑點(diǎn)炭疽菌(Colletotrichumcapacisi)是隱性遺傳[5]。2009年，Mahasuk等證實(shí)col1、col2、col3 3個(gè)具有加性效應(yīng)隱性基因控制辣椒黑點(diǎn)炭疽病的青熟果期、紅熟果期、以及苗期的抗性[6]。研究表明，辣椒尖孢炭疽菌抗性基因是顯性遺傳，由兩對(duì)互補(bǔ)的顯性基因控制。構(gòu)建含有381個(gè)分子標(biāo)記的長(zhǎng)度為1 310.2 cM的辣椒遺傳連鎖圖譜[7]，將辣椒抗炭疽病的主效基因被定位在了P5染色體上?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，在辣椒炭疽病研究方面，對(duì)黑點(diǎn)炭疽菌的研究較多，而對(duì)尖孢炭疽菌的研究較少。選用抗炭疽病品種‘PBC932’?！甈BC932’已經(jīng)被用于辣椒炭疽病抗性遺傳規(guī)律研究，但不同研究者的研究結(jié)果有所不同。相比其它種類炭疽菌，國(guó)內(nèi)分離得到的尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)具有更強(qiáng)的致病性與藥劑耐受力[8]，適用于辣椒炭疽病抗性研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過對(duì)C.chinense‘PBC932’ 和C.annuum‘77013’種間雜交群體進(jìn)行標(biāo)記分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。結(jié)合辣椒果實(shí)炭疽病的表型鑒定結(jié)果，進(jìn)行基因定位。研究與辣椒抗炭疽病主效基因緊密連鎖的標(biāo)記，為辣椒分子標(biāo)記輔助育種打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

抗炭疽病品種PBC932(Capsicum.chinenseJacq.)引種自AVRDC(亞洲蔬菜研究發(fā)展中心)，該品種果實(shí)較小，未成熟果色黃綠色，成熟果色紅色，長(zhǎng)勢(shì)中等，具有坐果能力強(qiáng)，對(duì)炭疽病抗性強(qiáng)的特點(diǎn)。高感炭疽病的中早熟材料77013(Capsicumannuum)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供。該品種果實(shí)較大，未成熟果色綠色，成熟果色紅色，具有坐果能力強(qiáng)，易感炭疽病的特點(diǎn)。選用PBC932為父本，77013為母本進(jìn)行雜交獲得F1代。由于F1花粉敗育，以77013為父本進(jìn)行連續(xù)回交再自交后獲得BC4S1群體。

炭疽菌為尖孢炭疽菌(菌株Coll-153)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所辣椒課題組于2009年從山西生產(chǎn)田采集的病果中分離得到。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌接種

利用尖孢炭疽菌對(duì)PBC932、77013、F1、BC4S2-1、BC4S2-2群體進(jìn)行抗性離體接種鑒定。辣椒在綠熟期時(shí)，果實(shí)和種子充分膨大，形態(tài)發(fā)育已經(jīng)完成，果實(shí)顏色為暗綠色，果皮硬度增加，果重達(dá)到最大，果實(shí)品質(zhì)較好。根據(jù)不同單株的生長(zhǎng)狀況、結(jié)果率，采收每一單株上的綠熟果(花后30～40 d)2～6個(gè)。在每一個(gè)果實(shí)上貼上標(biāo)簽，標(biāo)明單株株號(hào)，用自來水進(jìn)行沖洗，去掉果實(shí)表面雜物。將果實(shí)浸入70%的酒精中，30 s 后取出，殺滅細(xì)菌。果實(shí)表面自然晾干后，用微注射器(Hamilton PB600-1,Repeating Dispens/er, Reno, NV, USA)在果實(shí)表面刺穿1 mm的傷口，注射1 μL分生孢子懸浮液。每個(gè)果實(shí)接種2～6個(gè)點(diǎn)，接種點(diǎn)根據(jù)果實(shí)大小而定。在用酒精滅菌的塑料箱(50×25×20)(cm)中鋪入4層濾紙，用蒸餾水(約80 mL)浸濕。把接種好的果實(shí)放于濾紙上，接種點(diǎn)朝上，果實(shí)間距2 cm。蓋好蓋子后，將塑料箱放于26℃的恒溫條件下，使?jié)穸缺３衷?5%左右，避光培養(yǎng)7 d。

1.2.2 抗病性鑒定

平均病斑直徑(O)為辣椒炭疽病表型鑒定標(biāo)準(zhǔn)，平均病斑直徑(O)=Σ所有病斑直徑的總和/接種點(diǎn)數(shù)?？共⌒詣澐謽?biāo)準(zhǔn)為：抗病(R)：0 mm ≤ O ≤ 12mm；感病(S)：O>12 mm[9]。

1.2.3 DNA提取

提取兩個(gè)親本PBC932、77013與F1的DNA，用作開發(fā)新的標(biāo)記以及群體標(biāo)記分型對(duì)照，提取BC4S1的DNA用于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。采取辣椒嫩葉，冷凍抽干后用于DNA提取。DNA提取方法參照CTAB法，并略有修改[10]。用微量分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA的濃度和質(zhì)量。

1.2.4 Kaspar 多態(tài)性標(biāo)記的篩選

根據(jù)劉議蔚報(bào)道得到炭疽病抗性連鎖圖譜，選擇2個(gè)Kaspar標(biāo)記UN32931_776和UN27353_1781作為錨定位點(diǎn)[9]。利用抗病親本PBC932(C.chinense)與感病親本77013(C.annuum)全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)比已公布的辣椒基因組信息，找到雙親中存在的SNP位點(diǎn)。用Primer 5軟件開發(fā)Kaspar標(biāo)記[11]。

Kaspar 標(biāo)記包含3條引物序列，Allele-1、Allele-2、Common。Allele-1、Allele-2為前引物，引物的最后一個(gè)堿基為存在差異的SNP位點(diǎn)。在兩個(gè)前引物的前端各加上21 bp的公共接頭序列：5’GAAGGTCGGAGTCAACGGATT3’為FAM熒光序列。5’GAAGGTGACCAAGTTCATGCT3’為HEX 熒光序列。

Kaspar 引物預(yù)混體系為，濃度10 M的位點(diǎn)特異性引物Allele-1、Allele-2各12 μL，共用引物30 μL，ddH2O 46 μL。預(yù)混體系總體積為100 μL。PCR擴(kuò)增體系為5 ng/μL的DNA模板2 μL，2×Kaspar master mixture 2 μL，引物預(yù)混液0.055 μL。 PCR擴(kuò)增程序：94℃條件下預(yù)擴(kuò)增15 min; 94℃預(yù)變性20s,61℃ 1 min,每循環(huán)降低0.6℃，共9個(gè)循環(huán)；94℃ 20s, 55℃ 1 min, 26個(gè)循環(huán)；94℃ 20s，57℃ 1 min，9個(gè)循環(huán)。選用Roche 480熒光定量?jī)x，以及384板ABI PCR儀，進(jìn)行KASPar標(biāo)記的基因型分析。

1.2.5 Kaspar 多態(tài)性標(biāo)記的篩選

多態(tài)性標(biāo)記分析BC4S1群體，將與抗病親本一致的標(biāo)記分型記位“a”,與感病親本一致的分型記為“b”,與F1標(biāo)記分型一致的記位“h”。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用Joinmap4.0軟件進(jìn)行分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Joinmap4.0軟件[12]對(duì)BC4S1群體的KASPar標(biāo)記分型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。參數(shù)設(shè)置為L(zhǎng)OD≥3，步長(zhǎng)0.5，所用函數(shù)為Kosambi函數(shù)[13]。利用MapQTL6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步處理，分析與辣椒炭疽病綠熟期抗性基因連鎖最緊密的標(biāo)記，并以遺傳連鎖圖譜上LOD值最高點(diǎn)為主效抗性基因QTL位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒炭疽病性狀的遺傳規(guī)律

PBC932、77013、F1、BC4S1、BC4S2群體鑒定株數(shù)分別為6、6、6、170、130株。抗病親本PBC932的平均病斑直徑為5.59 mm，感病親本77013的平均病斑直徑為24.6 mm，F(xiàn)1的平均病斑直徑為8.20 mm。抗病親本PBC932及F1全部表現(xiàn)為抗病，77013全部表現(xiàn)為感病，抗病性表現(xiàn)為顯性遺傳。BC4S1與BC4S2群體的病斑直徑分布直方圖顯示，病斑直徑呈連續(xù)的分布。經(jīng)K-S(Kolmogorov-Smirnov)檢驗(yàn)，P值都為0.2>0.05，病斑直徑分布符合正態(tài)分布規(guī)律。圖1

圖1 BC4S1群體與BC4S2群體的病斑直徑分布
Fig. 1 Diameter distribution of BC4S1population and BC4S2population

BC4S1群體抗性鑒定發(fā)現(xiàn)，抗病單株數(shù)：感病單株數(shù)為85∶74，2檢測(cè)值為0.478。BC4S1群體抗性鑒定發(fā)現(xiàn)，抗病單株數(shù)：感病單株數(shù)為63∶51，2檢測(cè)值為0.045。兩群體的2檢驗(yàn)都符合孟德爾分離比9∶7，顯示辣椒抗性由兩對(duì)互補(bǔ)的顯性基因控制。由于植株果實(shí)結(jié)果數(shù)目少，以及采后果實(shí)腐爛等，在BC4S1群體和BC4S2群體中有11和16株不能確定抗病性。表1

表1 BC4S1群體與BC4S2群體的表型病斑直徑卡方檢測(cè)
Table 1 Chi-square test results of phenotype lesions in BC4S1population and BC4S2population

2.2 篩選多態(tài)性標(biāo)記

根據(jù)報(bào)道得到2個(gè)Kaspar標(biāo)記。根據(jù)抗病親本PBC932(Capsicum.chinense)與感病親本77013(Capsicumannuum)的重測(cè)序結(jié)果，開發(fā)了106個(gè)Kaspar標(biāo)記。將108個(gè)Kaspar標(biāo)記在抗病親本、感病親本與F1之間篩選得到14個(gè)多態(tài)性的標(biāo)記，多態(tài)性的比率是13%。在這14個(gè)標(biāo)記中，標(biāo)記UN32931_776與UN27353_1781已有定位報(bào)道。這兩個(gè)標(biāo)記可以作為錨定位點(diǎn)，通過錨定位點(diǎn)，得到的遺傳連鎖圖可以與已經(jīng)報(bào)道的遺傳連鎖圖對(duì)應(yīng)。表2

表2 14個(gè)Kaspar標(biāo)記序列
Table 2 The sequences of 14 Kaspar markers

標(biāo)記名稱Number of marker引物序列Primer sequenceP5L-3Allele-1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAGTCGATATATGGCTTATCCAllele-2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAGTCGATATATGGCTTATCTCommonGCCAATGTGCATTTTCAP5L-117Allele-1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAAAACCAGCAAGACCAGAAGAGAllele-2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAAAACCAGCAAGACCAGAAGAACommonAGAAAGAACTCTATCATGGGAACAGP5L-175Allele-1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTCAACCTTCCACACAGCAAAAllele-2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTCAACCTTCCACACAGCAAGCommonATCCTTTGTGTTCTAACP5L-199Allele-1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGACCAGTCCAACCACCTCCACCGAllele-2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACCAGTCCAACCACCTCCACCACommonGCCCGGGCCCATATCCATACGAATAP5L-204Allele-1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTGTTCCAAGTTATCGATGTGTCCAllele-2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAACTGTTCCAAGTTATCGATGTGTCTCommonTGCTGAAAACCTCTGAGACATTGTGP5L-221Allele-1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCCAGATATTAAATCGCAAAAAllele-2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGCCAGATATTAAATCGCAAAGCommonTTTGAGCTTAGAACTCCTCAAAACAP5L-224Allele-1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTCCTAACAAAGGCGACTCGATATATATTTAAllele-2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCTAACAAAGGCGACTCGATATATATTTGCommonTGCAGAAACAAAGAAAGGTGGATGTP5L-249Allele-1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGCTATGGATTCTGAGGAGGGTAAAAAAllele-2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGCTATGGATTCTGAGGAGGGTAAAAGCommonTGCTCATGTTCAACCTCTGAATCAGAP5L-257Allele-1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAACCAGGGGTCGTTGACAAllele-2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAACCAGGGGTCGTTGACGCommonCCATCTGGCTTGTCACCACTAGP5L-295Allele-1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAAGAACTTGGCAGCAGTCCATTCGAllele-2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAAGAACTTGGCAGCAGTCCATTCACommonACAAGCTGCTTTCTATGGTATCATTGTGTP5L-541Allele-1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTTGGCAGTTCACACATGTCACGTAAAllele-2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTTGGCAGTTCACACATGTCACGTATCommonGCACCTACTATCAGATGCAAACGCG

續(xù)表2 14個(gè)Kaspar標(biāo)記序列
Table 2 The sequences of 14 Kaspar markers

標(biāo)記名稱Number of marker引物序列Primer sequenceP5L-866Allele-1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATGACTTCTGGAGAACATTTAGCATTCATTTAllele-2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGACTTCTGGAGAACATTTAGCATTCATTCCommonGCTGCTAGCATGAAACTGGTTATGCUN27353_1781[]Allele-1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTCGGTTCTTCCATCCAAGATAAAGCGTAllele-2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCGGTTCTTCCATCCAAGATAAAGCGCCommonTCACCGGCGTGTTGAAAGACTTCAGUN32931_776 A1[]Allele-1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAACAGCCTGCTTGGTGATTTYTCCAACCAllele-2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAACAGCCTGCTTGGTGATTTYTCCAACTCommonGCAAGGTCATCTTTTCGCACGAACG

2.3 遺傳連鎖圖的構(gòu)建標(biāo)記開發(fā)

利用獲得多態(tài)性的14個(gè)標(biāo)記檢測(cè)BC4S1的170個(gè)單株，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。根據(jù)表型數(shù)據(jù)，利用MapQTL6.0軟件進(jìn)行QTL分析，將辣椒抗炭疽病主效基因AnRGO5定位在標(biāo)記P5L-866與標(biāo)記P5L-259之間，遺傳距離2.9 cM。其中P5L-117 與基因連鎖最為緊密。圖2

圖2 BC4S1群體的遺傳連鎖
Fig. 2 Linkage map in BC4S1population

2.4 分子標(biāo)記準(zhǔn)確度的驗(yàn)證及應(yīng)用

利用P5L-117標(biāo)記對(duì)BC4S2群體130株進(jìn)行篩選，共得到標(biāo)記型為抗病的單株34株。34株單株的表型鑒定結(jié)果顯示，26株抗病，標(biāo)記的準(zhǔn)確度為93.5%。圖 3

注：綠三角為抗病親本分型，紅三角為F1分型，藍(lán)三角為感病親本分型，褐色點(diǎn)為水

Note: The green triangle is the type of disease-resistant parent, the red triangle is F1, the blue triangle is the susceptible parent, and the brown point is water

圖3 標(biāo)記(P5L-117)在BC4S2群體中分型
Fig. 3 Classification of the marker (P5L-117) in the BC4S2population

3 討 論

研究表明，辣椒炭疽病基因是由顯性基因控制的。2008年，Kim等對(duì)黑點(diǎn)炭疽病的研究結(jié)果表明，"AR"(一個(gè)來源于品種PBC932的炭疽病抗病株系)對(duì)炭疽病的抗性是由單隱性基因控制的[14]。研究表明,辣椒炭疽病基因是由顯性基因控制的，這一結(jié)果與Kim研究結(jié)果不同。試驗(yàn)用菌為尖孢炭疽菌，而Kim試驗(yàn)用菌為黑點(diǎn)炭疽菌，推測(cè)辣椒對(duì)不同種類的炭疽菌有不同的抗病機(jī)制。Lee研究了抗病品種‘PBC81’對(duì)尖孢炭疽菌和黑點(diǎn)炭疽菌的抗性遺傳，結(jié)果顯示，二者的主效數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)在不同位置[15]。辣椒炭疽病抗病機(jī)制較為復(fù)雜。研究表明，辣椒炭疽病抗性基因是由兩對(duì)互補(bǔ)的顯性基因控制的，這與Lin對(duì)辣椒材料0038-9155的抗病機(jī)制研究結(jié)果一致。

2016年，Mahasuk通過種間雜交群體 C.annuum‘Bangchang’ × C.chinense ‘PBC932’構(gòu)建了一個(gè)遺傳連鎖圖。此遺傳連速圖包含12個(gè)連鎖群，214個(gè)SNP標(biāo)記，圖譜總長(zhǎng)842 cM。根據(jù)綠果期的抗性鑒定結(jié)果，在LG2連鎖群上定位了2個(gè)QTL位點(diǎn)[16]。而研究結(jié)果將辣椒炭疽病抗性基因定位在了5號(hào)染色體上，定位結(jié)果與Mahasuk研究結(jié)果不同，這可能是由于試驗(yàn)材料、致病菌種類、試驗(yàn)方法的不同引起的。

目前，與辣椒炭疽病基因連鎖的分子標(biāo)記已有報(bào)道，但數(shù)目不多。試驗(yàn)獲得的標(biāo)記P5L-117與辣椒抗尖孢炭疽菌基因緊密連鎖，可用于分子標(biāo)記輔助育種。Kaspar標(biāo)記具有成本低、靈敏度高、DNA用量少等特點(diǎn)，有助于加快抗炭疽病育種進(jìn)程。

4 結(jié) 論

4.1 在抗炭疽病品種PBC932(C.chinense)與感炭疽病品種77013(C.annuum)的雜交群體中，辣椒炭疽病病狀為數(shù)量性狀。辣椒對(duì)尖孢炭疽菌的抗性由兩對(duì)互補(bǔ)的顯性基因控制，受微效多基因以及環(huán)境因素的影響。

4.2 在BC4S1群體中，將辣椒抗炭疽病主效基因AnRGO5定位在標(biāo)記P5L-866與標(biāo)記P5L-259之間，與AnRGO5連鎖最緊密的標(biāo)記為P5L-117，遺傳距離2.9 cM。用P5L-117標(biāo)記對(duì)在BC4S2群體的抗病植株進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)記準(zhǔn)確率93.5%。