劉栓栓，王 波，宗興風(fēng)，王 嬌，王新奇，姚正培，任燕萍，張 樺,2

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)干旱區(qū)荒漠研究所,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】14-3-3蛋白是高度保守的調(diào)節(jié)蛋白，參與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等代謝調(diào)節(jié)過程[1]，在植物響應(yīng)干旱、高鹽、高溫等非生物脅迫以及生物脅迫[2]中發(fā)揮重要作用。梭梭(Haloxylon ammodendron)為藜科梭梭屬多年生灌木或小喬木，主要分布于我國西北荒漠和半荒漠地區(qū)，具有較強(qiáng)的抗旱、抗寒、耐鹽堿、耐高溫、耐瘠薄等能力[3]，是荒漠地區(qū)主要的建群種，在荒漠地區(qū)防風(fēng)固沙、保護(hù)生態(tài)環(huán)境、改善小氣候等多方面具有重要作用[4]。研究梭梭14-3-3蛋白功能，不僅有助于從調(diào)節(jié)蛋白這個(gè)側(cè)面理解梭梭抗逆適應(yīng)性的分子機(jī)制，為作物抗逆基因工程提供新的基因來源，同時(shí)對(duì)選育和篩選抗逆梭梭植株，加快生態(tài)治理進(jìn)程具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】14-3-3蛋白最早在牛腦組織中被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)其在DEAE層析后所分離組分的片段數(shù)及在淀粉凝膠電泳中的遷移率而得名[5, 6]，該蛋白在植物體內(nèi)主要以同源或異源二聚體的形式形成特殊的槽狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而結(jié)合相應(yīng)的磷酸化靶蛋白[7]，序列由較高變異性的N端和C端，以及保守的核心區(qū)域組成，其中N端是決定它能否形成二聚體的關(guān)鍵區(qū)域[8,9]。它能夠以序列特異性和磷酸化依賴的方式與眾多的靶蛋白結(jié)合并通過改變靶蛋白的活性、穩(wěn)定性、構(gòu)象、亞細(xì)胞定位或者與其他蛋白的親和力來調(diào)控靶標(biāo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]，參與代謝調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄、應(yīng)激反應(yīng)等一系列生物過程[10]。研究表明,過表達(dá)小麥與擬南芥14-3-3基因，可以提高植株對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受能力，減弱植株的萎蔫程度[11, 12]。植株可在逆境條件下，利用14-3-3蛋白降低質(zhì)膜H+-ATPase復(fù)合物的活性，從而降低質(zhì)子泵活性，并關(guān)閉氣孔進(jìn)而來提高植物的抗旱性[13]，同時(shí)擬南芥還可通過兩種不同結(jié)構(gòu)的14-3-3蛋白與SOS2的相互作用抑制SOS2的活性，進(jìn)而抑制正常生長條件下植物的SOS通路，而鈉離子可以通過降低14-3-3蛋白與SOS2的相互作用來激活SOS通路，提高植株耐鹽能力[14]。14-3-3蛋白還可參與激素信號(hào)通路的調(diào)控，該蛋白通過與OsBZR 1相互作用改變OsBZR 1的催化活性，從而導(dǎo)致BR敏感性降低、BR應(yīng)答基因表達(dá)改變[15]。水稻14-3-3蛋白基因OsGF14e被鈣依賴蛋白激酶OsCPK 21磷酸化后促進(jìn)水稻幼苗對(duì)ABA和鹽脅迫的響應(yīng)[16]。前期對(duì)梭梭進(jìn)行干旱和高溫的轉(zhuǎn)錄組測序，在差異表達(dá)的unigene中通過序列比對(duì)篩選了9個(gè)14-3-3蛋白基因，命名為HaFT-1～9，已克隆了與干旱和鹽脅迫相關(guān)的HaFT-1、HaFT-2[17]，HaFT-5和HaFT-6[18]基因?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對(duì)梭梭抗逆性的研究主要集中在生理[19]和抗旱[20]機(jī)制方面，對(duì)梭梭耐高溫的研究少有報(bào)道。研究前期對(duì)梭梭幼苗模擬地表高溫脅迫后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，14-3-3蛋白基因HaFT-9在高溫脅迫后表達(dá)上調(diào)，推測該基因可能與梭梭響應(yīng)高溫脅迫有關(guān)，因此，以研究梭梭14-3-3蛋白基因功能為切入點(diǎn)，探討其表達(dá)特性和結(jié)合活性，進(jìn)而理解其調(diào)控功能，有助于解析梭梭耐高溫的分子機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究梭梭14-3-3蛋白基因HaFT-9在非生物脅迫和激素處理后的表達(dá)模式，特別是對(duì)高溫脅迫適應(yīng)的響應(yīng)模式，分析HaFT-9蛋白的結(jié)合特性。

1 材料與方法

1.1 材 料

梭梭種子采集于新疆吉木薩爾育苗場，自然環(huán)境干燥后在-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 梭梭幼苗處理

1.2.1.1 干旱脅迫、鹽脅迫以及激素處理試驗(yàn)

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，梭梭種子經(jīng)75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗3次，再用1%次氯酸鈉消毒15 min，無菌水沖洗6次后，將種子點(diǎn)播于1/2 MS固體培養(yǎng)基上。種子置于26℃恒溫箱中培養(yǎng)30 d，光照強(qiáng)度為900～1 260 μmol/(m2·s)，晝夜光照周期16 h/8 h。將生長30 d的梭梭幼苗轉(zhuǎn)移至具有20% PEG6000、200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和20 μmol/L IAA的溶液中(ddH2O配置)，在脅迫不同時(shí)間段(0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h)對(duì)幼苗同化枝取樣，樣品迅速置于液氮速凍，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 模擬地表高溫脅迫試驗(yàn)

俞闐[21]通過模擬地表高溫脅迫發(fā)現(xiàn)地表高溫是引起梭梭幼苗死亡的主要原因之一，同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩年生幼苗對(duì)高溫的耐受性明顯強(qiáng)于一年生幼苗。試驗(yàn)利用電熱線恒溫加熱梭梭苗與地表接觸位置，對(duì)一年生和兩年生梭梭幼苗進(jìn)行模擬地表高溫脅迫。1年生梭梭幼苗經(jīng)40和55℃連續(xù)處理24 h后，停止高溫脅迫并置于30℃復(fù)原，同時(shí)對(duì)梭梭同化枝在不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、2 h、12 h、24 h、3 d、6 d、15 d)取樣；2年生梭梭幼苗經(jīng)55和65℃連續(xù)處理48 h后，停止高溫脅迫置于30℃復(fù)原，同時(shí)對(duì)梭梭同化枝在不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、2 h、24 h、48 h、7 d、10 d、19 d)取樣。

1.2.1.3 高溫脅迫適應(yīng)性試驗(yàn)

將26℃恒溫下生長30 d的梭梭幼苗，進(jìn)行以下兩種生長脅迫模式處理。試驗(yàn)組脅迫模式為：正常生長條件下的幼苗置于26℃ 3 d(常溫對(duì)照，CK)→37℃ 1 h(高溫預(yù)處理，S1)→26℃ 3 d(第1次常溫復(fù)原，R1)→45℃ 1 h(高溫脅迫處理，S2)→26℃ 7 d(第2次常溫復(fù)原，R2)；對(duì)照組脅迫模式為：將正常生長條件下(CK’)的幼苗置于45℃ 1 h處理(S2’)后，直接進(jìn)行26℃ 7 d復(fù)原(第1次常溫復(fù)原，R2’)，在8個(gè)時(shí)間點(diǎn) (CK、S1、 R1、S2、R2、CK’、S2’、 R2’)對(duì)梭梭幼苗同化枝取樣，即試驗(yàn)組比對(duì)照組多一項(xiàng)37℃預(yù)脅迫處理，以期分析高溫預(yù)處理后基因表達(dá)變化。

1.2.2HaFT-9基因的克隆

利用全式金Trizol提取45℃高溫脅迫1 h梭梭幼苗的RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa FirstSrtand cDNA Synthesis kit進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

從梭梭高溫轉(zhuǎn)錄組測序拼接得到標(biāo)注為14-3-3蛋白基因的Unigene序列，將該基因命名為HaFT-9，利用NCBI與DNAMAN 分析得到HaFT-9 ORF全長序列，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)HaFT-9的克隆引物(表1)，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：10×Buffer (含Mg2+) 5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、上下游引物各1.0 μL、cDNA 模板1.0 μL、Taq酶0.5 μL、其余用ddH20補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；PCR產(chǎn)物切膠回收后連接pEASY-T1 載體，轉(zhuǎn)化至Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)中。

膠回收方法參考Midi Purification Kit(天根生化科技有限公司)試劑說明書， pEASY-T1 載體連接與大腸桿菌轉(zhuǎn)化參考(北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書。表1

表1 PCR引物序列
Table 1 Primer sequences of PCR

基因名稱Gene name引物名稱Primer Name引物序列(5'→3')Primer sequence用途ApplicationHaFT-9HaFT-9FATGGCAACCACCGCACCT克隆引物HaFT-9RCTATGCCTCGTCCATTTGATClone primers

1.2.3 目的基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI在線數(shù)據(jù)庫對(duì)HaFT-9基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行搜索以及比對(duì)，并使用非在線軟件(clustalx和genedoc)對(duì)相似序列進(jìn)行多序列比對(duì)。利用軟件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，利用軟件PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預(yù)測蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用軟件SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive/Lmyegg/models/)預(yù)測蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，利用軟件BaCelLo(http://gpcr2.biocomp.unibo.it/bacello/pred.htm)預(yù)測蛋白的亞細(xì)胞定位，利用軟件MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。表2

表2 熒光定量引物序列
Table 2 Realtime fluorescence quantitative primer

基因名稱Gene name引物名稱Primer Name引物序列(5'→3')Primer sequence用途ApplicationHaFT-9HaFT-9qFTACTTTGGGTGAAGAGTCCTACA熒光定量引物HaFT-9qRTTTGATCCTGCATGTCTGATGTRealtime fluorescence quantitative primerHa18sRNA18sRNAFCTCTGCCCGTTGCTCTGATGAT內(nèi)參基因引物18sRNARCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCReference gene primerHaACT7ACT7FTTGAACCCCAAGGCTAACAGAG內(nèi)參基因引物ACT7RACGACCAGCAAGATCCAAACGGReference gene primerHaEF-1AEF-1AFCGTGAAGGCGACTCGTTAATTG 內(nèi)參基因引物EF-1ARGCTTGGAGACGCTTGACAGGACReference gene primer

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

將1.2.1中各處理材料提取總RNA后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa FirstSrtand cDNA Synthesis kit進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)HaFT-9的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，模擬干旱脅迫、高溫脅迫和IAA處理的內(nèi)參基因?yàn)镠a18srRNA，高鹽脅迫的內(nèi)參基因?yàn)镠aAct7、ABA處理下的內(nèi)參基因?yàn)镠aEF-1A[22]，按照SYBR?Premix ExTaqTMII(TaKaRa)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體系：SYBR?Premix ExTaqTMII 10 μL，上下游引物各0.8 μL，Rox DyeⅡ 0.4 μL，cDNA 2 μL，其余用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：95℃ 預(yù)變性30 s；95℃ 變性3 s，60℃退火35 s，循環(huán)40次。待溶解曲線生成后，采用2-△△CT法，計(jì)算HaFT-9基因在不同處理及對(duì)照樣品中的表達(dá)量。

1.2.5 酵母雙雜交載體構(gòu)建及互作驗(yàn)證1.2.5.1 入門克隆載體構(gòu)建

采用Gateway?系統(tǒng)構(gòu)建酵母雙雜載體，根據(jù)HaFT-9的ORF序列設(shè)計(jì)入門克隆引物(表3劃線部分為attB位點(diǎn))，以前期測序正確的pEASY-T1- HaFT-9質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，切膠回收，利用BP酶將回收產(chǎn)物與pDONR221載體連接，轉(zhuǎn)化Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR驗(yàn)證正確的陽性克隆送測序。BP反應(yīng)方法見Gateway?Technology(Invitrogen)說明書。表3

表3 入門克隆引物
Table 3 Entry cloning primers

基因名稱引物名稱引物序列(5'→3') 用途Gene namePrimer NamePrimer sequenceApplicationHaFT-9HaFT-9pFGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCAACCACCGCACCTA入門克隆引物HaFT-9pRGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTATGCCTCGTCCATTTGATCEntry clone primers

1.2.5.2 AD與BD重組載體構(gòu)建及互作驗(yàn)證

pDESTTM32含有GAL 4 DNA結(jié)合區(qū)為BD載體，pDESTTM22含有GAL 4激活區(qū)為AD載體。利用LR酶將目的片段從pDONR221- HaFT-9入門克隆載體重組至BD載體與AD載體，驗(yàn)證正確的陽性克隆送測序。LR反應(yīng)方法見ProQuestTMTwo-Hybrid System(Invitrogen)說明書。

將-80℃冰箱保存的酵母菌株MaV203在YPDA固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)進(jìn)行菌體活化，30℃培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落至2 mL YPDA液體培養(yǎng)基，30℃，200 r/min培養(yǎng)24 h。以1∶100的比例加入至30 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.8～1.0，用于酵母轉(zhuǎn)化。BD載體和BD-HaFT-9載體分別轉(zhuǎn)化酵母菌株Mav203，涂布于SD-Leu培養(yǎng)基與SD-His培養(yǎng)基，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄自激活驗(yàn)證。將AD、BD以及構(gòu)建好的BD-HaFT-9、AD-HaFT-9轉(zhuǎn)化至酵母MaV203，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板于二缺板(SD-Leu-Trp) 30℃培養(yǎng)2～3 d。將長出的單克隆用蒸餾水稀釋至同一濃度，轉(zhuǎn)移至三缺板(SD-Leu-Trp-His)培養(yǎng)2～3 d，將三缺板生長的菌落進(jìn)行X-gal染色，觀察結(jié)果。

轉(zhuǎn)化方法參考Frozen-EZ Yeast Transformation IITM試劑盒

注：M：2K Marker； 1：HaFT-9 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物

Note: M:2K Marker;1:HaFT-9 PCR amplification products

圖1 梭梭14-3-3蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物
Fig.1 The amplification result ofHaloxylonammodendron14-3-3 protein gene

2 結(jié)果與分析

2.1 14-3-3蛋白基因HaFT-9的克隆

梭梭干旱轉(zhuǎn)錄組拼接得到標(biāo)注為14-3-3蛋白基因的Unigene序列，根據(jù)梭梭的拉丁名中的首字母和14-3-3蛋白名字中的fourteen與three將該基因命名為HaFT-9。以梭梭cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到與預(yù)期片段大小相符的目的條帶，將該條帶切膠回收，與pEASY-T1連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，挑取陽性克隆送新疆昆泰銳進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示該基因片段大小為789 bp， NCBI登錄號(hào)為API85525。圖1

2.2 目的基因的生物信息學(xué)

2.2.1 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測及序列比對(duì)

NCBI BLAST 結(jié)果顯示，HaFT-9基因的ORF為789 bp，編碼262個(gè)氨基酸。多重序列比對(duì)結(jié)果如圖3所示，HaFT-9蛋白序列與所有參與比對(duì)的14-3-3 的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)都高度保守，與菠菜14-3-3蛋白家族成員的氨基酸序列相似性最高，已達(dá)到87.40%，另外與擬南芥和柑橘的相似性分別為77.27%和76.89%。此外14-3-3蛋白與其他物種的14-3-3蛋白家族成員一樣具有保守的酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，N-末端和C-末端的蛋白質(zhì)信號(hào)基序。HaFT-9屬于14-3-3蛋白家族。 圖2

注：HaFT-9為梭梭14-3-3蛋白序列；柑橘(XP_006426292.1)；菠菜(KNA23398.1)；擬南芥(XP_020890110.1)

Note:HaFT-9 is a 14-3-3 protein sequence ofHaloxylonammodendron;Trusclementina(XP_006426292.1);Spinaciaoleracea(KNA23398.1);Arabidopsislyratasubsp.lyrata(XP_020890110.1)

圖2 梭梭HaFT-9基因編碼蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測
Fig.2 The prediction of conserved domains ofHaFT-9 protein genes fromHaloxylonammodendron

圖3HaFT-9基因編碼氨基酸序列與其他植物14-3-3的序列比對(duì)
Fig.3 Alignments of theHaFT-9 deduced amino acid sequences with other 14-3-3 proteins from plants

2.2.2 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位等預(yù)測

利用ProtParam在線軟件對(duì)HaFT-9 蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示和HaFT-9蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定蛋白，分子量是29.392 kD，等電點(diǎn)pI 值為4.88，分子式為C1294H2057N345O4-14S10。利用PSIPRED在線軟件對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)HaFT-9有12個(gè)α螺旋和1個(gè)β折疊。使用swiss-mode在線軟件預(yù)測HaFT-9的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)HaFT-9可以形成同源二聚體，并以“U”的形式排列。利用BaCelLo在線軟件對(duì)HaFT-9亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測表明HaFT-9基因編碼的蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞核內(nèi)。圖4

2.2.3 蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹

選取擬南芥(XP_020890110.1)、油菜(XP_013738533.1)、中華獼猴桃(PSR99833.1)、橡膠樹(XP_021649588.1)、藜麥(XP_021725612.1)、煙草(BAD12174.1)、甜菜(XP_010681047.1)、菠菜(KNA23398.1)、柑橘(XP_006426292.1)等植物中與HaFT-9相似性較高的14-3-3的氨基酸序列，利用MEGA 5.0軟件系統(tǒng)分析。結(jié)果這些物種被聚為兩大類，其中HaFT-9的氨基酸序列與柑橘的親緣關(guān)系最近，與同為黎科的菠菜聚為一類，另一支甜菜、擬南芥、油菜、中華獼猴桃等聚為一類。同為黎科植物但不同來源的14-3-3 基因系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系具有明顯的種屬特征。圖5

注：A和B為蛋白的不同面

Note: A and B are different sides of the protein

圖4 HaFT-9的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測模型
Fig.4 The 3-D structure of HaFT-9 established by SwissModel

注：HaFT-9為梭梭14-3-3蛋白序列

Note:HaFT-9 is a 14-3-3 protein sequence of Haloxylon ammodendron

圖5 HaFT-9與其他物種14-3-3蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹
Fig.5 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of HaFT-9 inHaloxylonammodendronand other species

2.3 不同脅迫條件下的HaFT-9基因表達(dá)

2.3.1 干旱、鹽脅迫和激素處理下的基因表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，檢測梭梭HaFT-9基因在20% PEG6000 模擬干旱脅迫、200 mmol/L NaCl高鹽脅迫、20 μmol/L IAA及100 μmol/L ABA處理下的表達(dá)，在模擬干旱脅迫與鹽脅迫下HaFT-9的表達(dá)均顯著上調(diào)，且該基因的表達(dá)量在6 h達(dá)到峰值(圖6 A，圖6 B)；在IAA和ABA激素處理下，HaFT-9基因的表達(dá)量分別在1和6 h達(dá)到峰值(圖6 C，圖6D)。以上結(jié)果表明，該基因可響應(yīng)干旱脅迫、鹽脅迫和激素誘導(dǎo)，同時(shí)對(duì)IAA信號(hào)的響應(yīng)快于ABA，并且ABA信號(hào)響應(yīng)與干旱和鹽脅迫的響應(yīng)模式相似。圖6

注：A、 B、C、D：分別為干旱脅迫、鹽脅迫、IAA、ABA處理下HaFT-9的表達(dá)模式；*代表顯著水平差異(P< 0.05)；**代表極顯著水平差異(P< 0.01)

Note: A, B, C and D: The expression patterns ofHaFT-9 under drought stress, salt stress, IAA and ABA treatments, respectively*Represent significant level difference (P< 0.05);**Represent extremely significant level difference (P< 0.01)

圖6 非生物逆境脅迫下HaFT-9 的表達(dá)模式
Fig.6 Expression patterns ofHaFT-9 under abiotic stress

2.3.2 地表高溫脅迫下的基因表達(dá)分析

研究表明， 一年生梭梭40℃脅迫下，HaFT-9基因的表達(dá)在脅迫時(shí)沒有增加，在常溫復(fù)原3 d時(shí)上調(diào)表達(dá)，但差異不顯著；55℃脅迫下，基因的表達(dá)量在2 h達(dá)到峰值，之后逐漸下降(圖7 A)，在復(fù)原15 d時(shí)仍有高表達(dá)。兩年生梭梭55℃脅迫下，HaFT-9基因的表達(dá)在常溫復(fù)原7 d時(shí)顯著上調(diào)，65℃脅迫下，24 h和常溫復(fù)原7 d時(shí)基因表達(dá)上調(diào)顯著，常溫復(fù)原7 d時(shí)達(dá)到最高(圖7 B)。表明HaFT-9基因可響應(yīng)地表高溫脅迫誘導(dǎo)同時(shí)在脅迫后的常溫復(fù)原階段仍能持續(xù)表達(dá)，推測該基因可能與高溫脅迫和脅迫適應(yīng)性相關(guān)。圖7

2.3.3 高溫脅迫適應(yīng)條件下的基因表達(dá)分析

經(jīng)模擬地表高溫脅迫試驗(yàn)，證明梭梭結(jié)束高溫誘導(dǎo)并恢復(fù)正常生長條件后，HaFT-9仍存在高水平表達(dá)，推測該基因可能與梭梭高溫脅迫適應(yīng)機(jī)制相關(guān)，為進(jìn)一步驗(yàn)證該推測，設(shè)計(jì)如圖8 A所示的處理模式，試驗(yàn)組和對(duì)照組初期都在26℃培養(yǎng)3 d作為CK和CK’，脅迫處理，試驗(yàn)組比對(duì)照組多一項(xiàng)37℃預(yù)脅迫。結(jié)果表明，對(duì)照組(圖8B中的黑框):45℃高溫脅迫1 h(S2’)后HaFT-9上調(diào)表達(dá)，在26℃恢復(fù)7 d后(R2’)表達(dá)沒有下降，表達(dá)量是CK’的1.6倍；試驗(yàn)組(圖8B中的灰框)：在37℃高溫預(yù)脅迫1 h(S1)后HaFT-9上調(diào)表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量是CK的2倍，26℃ 恢復(fù)3 d后，表達(dá)量是CK的1.5倍，繼續(xù)進(jìn)行45℃脅迫1 h(S2)后，HaFT-9的表達(dá)量仍為對(duì)照的1.5倍，繼續(xù)26℃常溫恢復(fù)7 d(R2)后HaFT-9的表達(dá)量上升至CK的2.7倍，顯著高于對(duì)照組的恢復(fù)階段(R2’)。表明HaFT-9在高溫處理和恢復(fù)階段都上調(diào)表達(dá)，且經(jīng)過37℃高溫預(yù)處理后進(jìn)行45℃脅迫后的恢復(fù)階段，HaFT-9的表達(dá)量顯著高于未經(jīng)過預(yù)處理組，推測HaFT-9可能與高溫脅迫適應(yīng)性和脅迫記憶相關(guān)。圖8

注：A：模擬地表高溫脅迫下一年生梭梭HaFT-9的表達(dá)模式； B：模擬地表高溫脅迫下兩年生梭梭HaFT-9的表達(dá)模式；*代表顯著水平差異(P< 0.05)；**代表極顯著水平差異(P< 0.01)

Note: A:Expression pattern of HaFT-9 in annualHaloxylonammodendronunder simulated surface heat stress; B:Expression pattern of HaFT-9 in biennialHaloxylonammodendronunder simulated surface heat stress*Represent significant level difference (P< 0.05);**Represent extremely significant level difference (P< 0.01)

圖7 模擬地表高溫脅迫下梭梭同化枝中HaFT-9的表達(dá)模式
Fig.7 Patterns ofHaFT-9 expression in assimilation branches ofHaloxylonammodendronunder simulated surface high temperature stress

注：A：處理模式； B：梭梭同化枝中HaFT-9的表達(dá)模式；CK’、CK、R1：梭梭幼苗26℃培養(yǎng)3 d；S1：梭梭幼苗37℃脅迫1 h；S2’、S2：梭梭幼苗45℃脅迫1 h；R2’、R2：梭梭幼苗26℃恢復(fù)7 d**代表極顯著水平差異(P< 0.01)

Note: A: High temperature treatment patterns; B: Analysis ofHaFT-9 expression in assimilated shoots ofHaloxylonammodendron;CK'、CK、R1: Seedlings ofHaloxylonammodendronwere cultured at 26℃ for 3 days; S1: Seedlings ofHaloxylon ammodendron were cultured at 37℃ for 1 hour; S2’、S2:Seedlings ofHaloxylon ammodendron were cultured at 45℃ for 1 hour; R2’、R2 : Seedlings ofHaloxylonammodendronwere cultured at 26℃for 7 days;**Represent extremely significant level difference (P< 0.01)

圖8 高溫脅迫和常溫復(fù)原條件下梭梭同化枝中HaFT-9的表達(dá)
Fig.8 Analysis ofHaFT-9 expression in assimilated shoots ofHaloxylonammodendronunder high temperature stress and normal temperature recovery

2.4 蛋白自激活及酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)

將BD載體和BD-HaFT-9載體分別轉(zhuǎn)化酵母菌株Mav203，涂布于SD-Leu培養(yǎng)基，挑取單克隆點(diǎn)于SD-His培養(yǎng)基上(含10 mmol/L 3-AT)，30℃培養(yǎng)2～3 d。轉(zhuǎn)化子能夠在SD-Leu培養(yǎng)基上正常生長，說明質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞，但無法在SD-His培養(yǎng)基上生長，HaFT-9蛋白無自激活活性(圖9 A)。

將BD載體、BD-HaFT-9載體、AD載體、AD-HaFT-9載體、陽性對(duì)照(pEXP32-Krev1+pEXP22-RalGDS-wt)、陰性對(duì)照(pEXP32-Krev1+pEXP22-RalGDS-m2)轉(zhuǎn)化酵母菌株Mav203，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化子都能夠在雙缺培養(yǎng)基(SD-Leu-Trp)上生長，陽性對(duì)照與BD-HaFT9+ AD-HaFT-9可以在三缺培養(yǎng)基(含40 mmol/L 3-AT)上生長， 并在X-Gal的處理下顯藍(lán)色(圖9 B)。HaFT-9蛋白在酵母體內(nèi)能與自身互作形成同源二聚體。圖9

注：A：HaFT-9自激活實(shí)驗(yàn)；B：HaFT-9酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)；BD：載體pDESTTM32；SD-2：SD-Leu-Trp；SD-3：SD-His-Leu-Trp

Note: A :Self-activation experiment ofHaFT-9; B:Two-hybrid experiment ofHaFT-9 yeast; BD:Vector pDESTTM32; SD-2:SD-Leu-Trp; SD-3:SD-His-Leu-Trp

圖9 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)檢測HaFT-9蛋白結(jié)合特性
Fig.9 Detection ofHaFT-9 protein binding characteristics by yeast two-hybrid assay

3 討 論

14-3-3蛋白是高度保守且功能多樣的調(diào)節(jié)蛋白[23]，在植物體內(nèi)主要以同源或異源二聚體的形式存在，已報(bào)道的14-3-3蛋白二聚體，煙草14-3-3c[24]和人類14-3-3t[25]的每個(gè)單體都是由9個(gè)反平行α螺旋組成。Lozano-Durán等[26]研究發(fā)現(xiàn)煙草14-3-3c蛋白，以“U”的形式排列形成同源二聚體，該蛋白具有干擾靶蛋白結(jié)合、連接兩種靶蛋白、改變靶蛋白的催化活性和亞細(xì)胞定位等作用。試驗(yàn)利用在線軟件swiss-mode預(yù)測HaFT-9的三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)HaFT-9可以形成同源二聚體，并以“U”的形式排列。由此對(duì)HaFT-9進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄自激活和酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明，HaFT-9不具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，并且與自身互作形成二聚體，說明，HaFT-9可以在酵母中形成同源二聚體。但試驗(yàn)預(yù)測HaFT-9蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，表明該蛋白單體由12個(gè)α螺旋和1個(gè)β折疊組成，與前人研究[24-26]結(jié)果不完全相同，這種結(jié)構(gòu)是否引起HaFT-9蛋白功能上的不同還需進(jìn)一步研究。

Zhang等[27]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)小麥14-3-3基因TaGF14b可以利用ABA信號(hào)通路增強(qiáng)植物對(duì)干旱、高鹽等非生物脅迫的耐受能力。Yan等[11]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)擬南芥14-3-3蛋白基因GF14λ，可提高棉花的耐旱性，減弱植株萎蔫程度。任江萍等[28]研究發(fā)現(xiàn)小麥14-3-3蛋白基因Ta14S的表達(dá)量在ABA、PEG、高溫脅迫下顯著上調(diào)。試驗(yàn)對(duì)梭梭幼苗進(jìn)行干旱、鹽脅迫和IAA、ABA處理時(shí)HaFT-9基因的表達(dá)均上調(diào)，說明，HaFT-9能夠響應(yīng)干旱脅迫、高鹽脅迫、IAA、ABA激素信號(hào)誘導(dǎo)，該結(jié)果與前人的研究相似[11, 12, 27, 28]。

高溫脅迫是一種常見的非生物脅迫，植物在初次受到這種高溫脅迫后，體內(nèi)的適應(yīng)機(jī)制被啟動(dòng)，產(chǎn)生“脅迫記憶”，當(dāng)植物再次受到這種脅迫時(shí)就會(huì)表現(xiàn)出對(duì)這種脅迫的適應(yīng)性[29, 30]。近年來對(duì)擬南芥和水稻等植物的研究發(fā)現(xiàn)，由高溫脅迫啟動(dòng)的基因表達(dá)會(huì)在正常生長溫度下持續(xù)數(shù)日[31]，當(dāng)?shù)诙胃邷貋砼R時(shí)，基因會(huì)表現(xiàn)出比第一次更高的表達(dá)水平[32]。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥在高溫脅迫處理結(jié)束后的2～6 h內(nèi)，14-3-3蛋白基因GRF9仍然上調(diào)表達(dá)，表明GRF9的功能可能與高溫脅迫適應(yīng)性相關(guān)[33]。試驗(yàn)對(duì)一年生和兩年生梭梭進(jìn)行模擬地表高溫脅迫處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)梭梭在常溫復(fù)原階段，HaFT-9基因仍然上調(diào)表達(dá)，推測HaFT-9可能與熱脅迫適應(yīng)性有關(guān)。為驗(yàn)證這一推測，設(shè)計(jì)高溫脅迫和常溫復(fù)原試驗(yàn)，給予梭梭幼苗37℃非致死溫度脅迫后，第二次再給予梭梭幼苗45℃脅迫后，HaFT-9表現(xiàn)出比第一次和對(duì)照組更高的基因表達(dá)水平，該結(jié)果與上述[29-33]研究一致。梭梭14-3-3蛋白基因HaFT-9可能與高溫脅迫和高溫脅迫適應(yīng)性相關(guān)。

4 結(jié) 論

從梭梭中成功克隆得到了14-3-3蛋白基因HaFT-9，全長789 bp，編碼262個(gè)氨基酸，HaFT-9蛋白不具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，能與自身互作形成同源二聚體。HaFT-9基因可響應(yīng)模擬干旱、鹽、高溫脅迫和IAA、ABA處理，并可能與高溫脅迫適應(yīng)性相關(guān)。