王振東，魯曉燕，涂文文，王曉麗,何晨晨

(石河子大學農學院/特色果蔬栽培生理與種質資源利用兵團重點實驗室, 新疆石河子832000)

0 引 言

【研究意義】土壤鹽堿化是干旱和半干旱地區(qū)農業(yè)的主要威脅，土壤鹽濃度的增加抑制了植物的生長，降低了吸收水分和養(yǎng)分的能力，破壞代謝過程和降低光合效率來影響生長[1-3]。鈣是植物生長、發(fā)育必需的營養(yǎng)元素之一，植物生長發(fā)育的各個方面和應激生理是由Ca2+的化學信號介導的，在植物的生理過程中起著重要作用[4]；在鹽脅迫下，補充適量的外源Ca2+可以提高植物對鹽度的抵抗力[5]。酸棗(ZiziphusacidojujubaC.Y.Cheng et M.J.Liu)屬鼠李科 (Rhammaceae) 棗屬 (Ziziphus Mill.)，是我國的特色優(yōu)勢野生果樹和重要的藥用植物[6,7]；酸棗還是棗樹最常用的砧木，具有抗旱耐瘠和耐鹽堿的特點[8]。轉錄組學關注RNA水平的基因表達，并提供全基因組的基因結構和功能信息，以揭示參與特定生物過程的分子機制[9]。高通量測序技術可以高效的產生大量的短測序讀數(shù)，同時對整個樣本內容進行測序[10]。通過對兩種處理下酸棗幼苗進行轉錄組測序分析，進一步完善了酸棗的基因信息，從轉錄水平上探究CaCl2緩解NaCl脅迫的機制?！厩叭搜芯窟M展】楊怡帆等[11]發(fā)現(xiàn)外源CaCl2可以提高酸棗各個器官自由水/束縛水、抗氧化物酶，降低細胞膜透性、MDA含量。呂新民等[12]證實外源CaCl2可以在鹽脅迫下增強酸棗幼苗AsA-GsH能力，清除器官中過量H2O2的能力大大增強，以此緩解NaCl造成的損害。王曉麗等[13]發(fā)現(xiàn)外源CaCl2可通過促進酸棗幼苗根和莖內 GS/GOGAT 循環(huán)和提高幼苗氮素同化效率，從而提高了酸棗幼苗對鹽害的適應性。前人大量的研究主要在抗氧化物保護酶、AsA-GSH循環(huán)、氮代謝等生理特性方面，而利用分子生物學手段來研究酸棗鹽脅迫下的轉錄調控鮮有報道?！颈狙芯壳腥朦c】第二代高通量測序技術可以快速和準確的對整個樣本內容進行測序，利用高通量測序技術對處理后的酸棗幼苗葉片和根系進行了轉錄組測序和生物信息學分析?！緮M解決的關鍵問題】利用轉錄組測序技術對NaCl和NaCl+CaCl2處理6 h的酸棗幼苗葉片和根系進行測序，篩選外源CaCl2緩解NaCl脅迫下酸棗幼苗葉和根的差異表達的基因，并通過GO和 KEGG 通路分析差異基因的分子功能和代謝途徑，為進一步研究CaCl2緩解酸棗鹽害基因功能提供了重要參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

挑選均勻一致的酸棗種子，用0.5% KMnO4浸泡消毒30 min后放入發(fā)芽盒，置于人工氣候箱(RXZ智能型，寧波江南儀器廠)中催芽，待幼苗長出2片真葉后，選擇生長健壯、整齊一致的幼苗懸浮于2 cm厚的泡沫板水培盒中置于人工氣候箱(光照強度12 000 lx，光照時間14 h，黑暗時間10 h；相對濕度65%～70%；溫度25～28℃)。水培盒大小為19 cm×13 cm×11 cm(長×寬×高)。每個水培盒加1倍日本園試配方營養(yǎng)液500 mL，每3 d更換一次營養(yǎng)液。

幼苗長到6片真葉完全展開時，開始處理：(1)Na處理(CK)：日本園試配方營養(yǎng)液+150 mmol/L NaCl(2)Na+Ca處理：日本園試配方營養(yǎng)液+150 mmol/L NaCl+10 mmol/L CaCl2；每個處理重復3次，每個重復15株幼苗。為避免鹽激反應，Na處理和Na+ Ca處理中，NaCl濃度以每天50 mmol/L的梯度逐步遞增，全部處理于同一天達到目標濃度，此時設為第0 h，在處理時間6 h時進行采樣，酸棗葉片在150 mmol/L NaCl處理樣本記為L Na，酸棗葉片在150 mmol/L NaCl +10 mmol/L CaCl2處理樣本記為L NaCa，酸棗根系在150 mmol/L NaCl處理樣本記為R Na，酸棗根系在150 mmol/L NaCl +10 mmol/L CaCl2處理樣本記為R NaCa。隨機取每個處理中酸棗幼苗的根系、葉片。每個器官設置3個重復，取樣后立即放入液氮中，放入超低溫冰箱(-80℃)中保存。用于RNA提取和轉錄組測序。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取，文庫構建及測序

酸棗幼苗葉和根的后續(xù)處理包括總RNA提取、純化、質量分析和文庫構建，轉錄組測序委托深圳華大基因有限公司進行。酸棗幼苗葉和根總RNA提取后利用Agilent 2100和Fragment Analyzer檢測其RNA樣品的純度、濃度和完整性。用帶有OligdT的磁珠富集mRNA，將得到的mRNA反轉錄合成cDNA，對其進行末端修復、加A 尾并連接測序接頭，連接產物通過特異的引物進行PCR擴增后將單鏈DNA環(huán)化得到單鏈環(huán)狀DNA文庫，最后用BGISEQ-500測序平臺進行測序。

1.2.2 數(shù)據(jù)拼接與組裝

測序所得的原始數(shù)據(jù)(raw reads)用過濾軟件SOAPnuke進行過濾，過濾掉低質量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的reads，獲得clean reads，并對其進行拼接。將拼接得到的轉錄本序列，作為后續(xù)分析的參考序列。

1.2.3 基因差異的篩選與注釋

使用DEGSeq[14]對4個樣品之間差異表達量分析，每個基因的P值用Qvalue進行多重假設檢驗校正，為了提高DEGs的準確性，定義差異倍數(shù)為兩倍以上并且Q-value ≤ 0.005的基因，篩選為顯著差異表達基因。

將差異表達的基因進行富集分析，主要包括GO(Gene Ontology)注釋和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)代謝通路分析。根據(jù)GO注釋和KEGG 注釋結果以及官方分類，將差異基因進行分類，同時使用R軟件中的phyper函數(shù)進行富集分析，計算P-value，然后對P-value進行FDR校正，通常FDR≤0.01的功能視為顯著富集。

2 結果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)質量

研究表明，通過轉錄組測序，酸棗葉片在Na和Na+Ca處理后分別產生73 420 610、72 660 059條原始數(shù)據(jù)，酸棗根系在Na和Na+Ca處理后分別產生72 586 640、70 139 213條原始數(shù)據(jù)。在去掉含低質量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的reads后，酸棗葉片在Na和Na+Ca處理后分別獲得70 354 474、68 689 952干凈的高質量序列；酸棗根中Na和Na+Ca處理下分別獲得了69 240 438、67 274 418干凈的高質量序列，且Q20都達到97%以上和Q30都達到88%以上，不確定堿基比例均小于0.4%，說明轉錄組測序質量較好。表1

表1 測序產出數(shù)據(jù)質量評估
Table 1 Assessment of the quality of sequencing output data

樣品名SampleL_NaL_NaCaR_NaR_NaCa原始數(shù)據(jù)Raw Reads 73 420 61072 660 05972 586 64070 139 213過濾后的數(shù)據(jù)Total Clean Reads 70 354 47468 689 95269 240 43867 274 418Q20(%)97.7797.3697.7797.76Q30(%)89.988.9889.7989.96N(%)0.280.330.220.28

2.2 酸棗幼苗在Na和Na+Ca處理后差異基因

研究表明，與Na處理相比，Na+Ca處理6 h時，酸棗幼苗葉片存在8 612個差異表達基因，其中7 365個DEGs在鹽脅迫響應中上調表達，1 247個DEGs表達下調；酸棗幼苗根系存在5 623個差異表達基因，其中 762個DEGs表達上調，4 861個DEGs表達下調。 圖1

圖1 CaCl2處理對NaCl脅迫下酸棗幼苗差異基因數(shù)量統(tǒng)計
Fig.1 Number Statistics of Differential Genes in Jujube Seedlings under NaCl Stress Treated with CaCl2

2.3 差異表達基因的 GO 功能注釋

GO分類分為分子功能、細胞組分和生物過程三大功能類，根據(jù)差異基因檢測結果進行功能分類。Na+Ca處理與Na處理相比，酸棗葉片富集了43個GO條件(15 127條)，包括了18個生物過程(5 213條)，14個細胞成分(5 299條)，11個分子功能(4 615條)被富集；根系中富集了42個GO條件(8 847條)，包括了17個生物過程(3 053條)，14個細胞成分(3 071條)，11個分子功能(2 723條)被富集。圖 2

圖2 NaCl處理與NaCl+CaCl2處理間差異基因的的Go功能注釋分類統(tǒng)計
Fig.2 Classification Chart of Go Functional Annotation of Differential Genes between NaCl Treatment and NaCl+CaCl2Treatment

2.4 差異表達基因的 GO 富集

將GO注釋中差異基因進行顯著富集，酸棗幼苗葉片中富集到最多的10個GO條目是催化活性(GO:0003824)、細胞膜(GO:0016020)、膜部件(GO:0044425)、膜的固有成分(GO:0031224)、膜的組成部分(GO:0016021)、陽離子結合(GO:0043169)、金屬離子結合(GO:0046872)、氧化還原酶活性(GO:0016491)、定位(GO:0051179)、建立定位(GO:0051234)；其中催化活性(GO:0003824)表達注釋量最多有878個差異基因富集到，有785個上調，93個下調。

酸棗幼苗根系中富集到最多的10個GO條目是催化活性(GO:0003824)、細胞膜(GO:0016020)、膜部件(GO:0044425)、膜的固有成分(GO:0031224)、膜的組成部分(GO:0016021)、陽離子結合(GO:0043169)、金屬離子結合(GO:0046872)、氧化還原酶活性(GO:0016491)、氧化還原過程(GO:0055114)、金屬離子轉變(GO:0046914)；催化活性(GO:0003824)表達注釋量最多有1 311個差異基因富集到，有237個上調，1 074個下調。

對兩種處理下酸棗葉片和根系轉錄組Unigene進行GO富集，發(fā)現(xiàn)酸棗幼苗葉片和根系關于細胞膜相關被富集到差異基因最多，這說明細胞組分中的細胞膜在酸棗幼苗適應鹽脅迫和CaCl2的緩解鹽脅迫作用中發(fā)揮著重要作用。酸棗幼苗葉片GO富集表現(xiàn)出下調基因多于下調基因，而根系表現(xiàn)出下調基因多于上調基因，葉片和根系表現(xiàn)出相反的結果。表3,表4

表 3 酸棗葉片在NaCl處理與NaCl+CaCl2處理間差異基因富集最多的前10條GO注釋
Table 3 The top 10 GO annotations with the highest concentration of differentially expressed genes between NaCl and NaCl+CaCl2treatments in jujube leaves

GO Term IDGO注釋GO annotation GO注釋中顯著DEGs Significant DEGs in GO Annotations上調Up下調DownGO:0003824催化活性87878593GO:0016020膜62154774GO:0044425膜部件45840157GO:0031224膜的固有成分45039456GO:0016021膜的組成部分44739156GO:0043169陽離子結合30227824GO:0046872金屬離子結合28926524GO:0016491氧化還原酶活性22620917GO:0051179定位15113318GO:0051234建立定位15013218

表 4 酸棗根系在NaCl處理與NaCl+CaCl2處理間差異基因富集最多的前10條GO注釋
Table 4 The top 10 GO annotations with the highest concentration of differentially expressed genes between NaCl and NaCl+CaCl2treatments in jujube root system

GO Term ID分子功能中的GO注釋GO annotation in molecular function GO注釋中顯著DEGs Significant DEGs in GO Annotations上調Up下調DownGO:0003824催化活性1 3112371 074GO:0016020膜926160766GO:0044425膜部件662107555GO:0031224膜的固有成分649105544GO:0016021膜的組成部分646105541GO:0043169陽離子結合41582333GO:0046872金屬離子結合40282320GO:0016491氧化還原酶活性34069271GO:0055114氧化還原過程23757180GO:0046914金屬離子轉變23046184

2.5 差異基因的KEGG代謝途徑

根據(jù) KEGG 注釋結果以及官方分類，將差異基因進行生物通路分類。酸棗葉片中7 521條Unigene能夠被KEGG 數(shù)據(jù)庫成功注釋，根中有5 041條Unigene能夠被KEGG 數(shù)據(jù)庫成功注釋，它們涉及到代謝(氨基酸代謝、其他次生代謝產物的生物合成 、碳水化合物代謝 、能量代謝、 全球和概述圖 、聚糖生物合成與代謝 脂代謝、輔助因子和維生素的代謝 、其他氨基酸的代謝 、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝 、核苷酸代謝)、細胞過程(運輸和分解代謝)、有機系統(tǒng)(環(huán)境適應)、環(huán)境信息處理(膜運輸 、信號轉導)、遺傳信息處理(折疊、分類和降解、復制和修復、轉錄、翻譯)5個大類、19中類。圖3

圖3 NaCl處理與NaCl+CaCl2處理間差異基因的KEGG分類統(tǒng)計
Fig.3 KEGG taxonomic map of differentially expressed genes between NaCl treatment and NaCl+CaCl2treatment

2.6 差異表達基因的KEGG富集

對KEGG中所有的代謝通路均使用R 軟件中的phyper函數(shù)進行富集分析，篩選出DEGs顯著性富集最多的前10條代謝通路，葉中分別是：植物病原互作(473)、MAPK信號通路-植物(296)、植物激素信號轉導(270)、苯丙醇生物合成(260)、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化(164)、核糖核酸聚合酶(139)、ABC轉運器(133)、氰氨基酸代謝(108)、倍半萜和三萜生物合成(66)、二萜生物合成(62)，根中分別是：植物病原互作(274)、苯丙醇生物合成(193)、嘧啶代謝(124)、核糖核酸聚合酶(107)、ABC轉運器(100)、氰氨基酸代謝(89)、二萜生物合成(48)、泛醌和其它萜類醌生物合成(48)、苯丙氨酸代謝(46)、倍半萜和三萜生物合成(44)。

酸棗葉片和根系轉錄組Unigene進行KEGG富集,發(fā)現(xiàn)植物病原互作、MAPK信號通路-植物、植物激素信號轉導等代謝途徑和信號轉導在酸棗生理活動中占有重要作用，所涉及到的Unigene數(shù)量也較多。兩種試驗處理下酸棗幼苗根系相比于葉片富集KEGG注釋到顯著性通路少且發(fā)生差異基因也少。依據(jù)差異表達基因在KEGG 分析中不同代謝和信號通路，為研究酸棗幼苗外源CaCl2緩解鹽脅迫的過程、生物功能以及代謝途徑提供了有效依據(jù)，可以直觀的了解酸棗幼苗在CaCl2緩解下代謝過程和信號轉導途徑的變化情況。表5

表5 酸棗葉片和根系在NaCl處理與NaCl+CaCl2處理間差異基因富集最多的前10條KEGG通路
Table 5 The top 10 KEGG pathways with the highest concentration of differentially expressed genes between NaCl treatment and NaCl+CaCl2treatment in the leaves and roots of jujube

葉片根系代謝通路IDPathway ID代謝通路注釋Pathway Name注釋到該通路的差異基因數(shù)DEGs in the pathway with annotation 代謝通路IDPathway ID代謝通路注釋Pathway Name注釋到該通路的差異基因數(shù)DEGs in the pathway with annotation ko04626植物-病原互作473ko04626植物-病原互作274ko04016MAPK信號通路-植物296ko00940苯丙醇生物合成193ko04626植物-病原互作274ko00240嘧啶代謝124ko04075植物激素信號轉導270ko03020核糖核酸聚合酶107ko00940苯丙醇生物合成260ko02010ABC轉運器100ko00940苯丙醇生物合成193ko00460氰氨基酸代謝89ko00040戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化164ko00904二萜生物合成48ko03020核糖核酸聚合酶139ko00130泛醌和其他萜類醌生物合成48ko02010ABC 轉運器133ko00360苯丙氨酸代謝46ko00240嘧啶代謝124ko00909倍半萜和三萜生物合成44

3 討 論

新一代高通量測序技術—轉錄組測序(RNA-Seq)技術，能夠高效全面的獲得研究樣本轉錄本，進而反映出研究樣本的表達水平[15,16]。隨著轉錄組測序技術的發(fā)展和在應用，果樹抗逆分子生物生物學研究也快速發(fā)展，特別是鹽脅迫下果樹逆境調控也取得飛速發(fā)展[17]。采用高通量測序技術已經(jīng)對鹽脅迫下巴西蕉[18]、葡萄[19]、梨[20]等果樹進行轉錄組測序，并發(fā)現(xiàn)了大量與耐鹽相關的基因。試驗在NaCl處理與NaCl+CaCl2下對酸棗幼苗葉片和根系進行了轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)酸棗幼苗葉片中7 365個上調表達，1 247個下調表達；根系中762個上調表達，4 861個下調表達；在這兩種處理下酸棗幼苗葉片中上調基因數(shù)多于下調，根中下調基因數(shù)多于上調，可見CaCl2緩解酸棗幼苗鹽脅迫根系和葉片作用機制有所不同。

第二信使Ca2+廣泛的參與植物對許多信號的轉導，植物對許多外界環(huán)境和激素等刺激作出的反應是通過胞質中自由Ca2+濃度變化來傳遞的[21,22]。在響應逆境脅迫時，Ca2+下游的激酶比如鈣依賴蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases, CDPKs)、鈣調素(Calmodulin, CaM)和類鈣調素蛋白(Calmodulin-like proteins, CMLs)等酶會被激活[22]。研究中發(fā)現(xiàn)實驗中NaCl脅迫下，添加外源CaCl2后發(fā)現(xiàn)酸棗葉片中CDPKs基因16個上調，2個下調，CMLs基因有14個上調，3個下調，CaM基因有11個上調，2個下調；根系中CDPKs基因1個上調，8個下調，CMLs基因有5個上調，4個下調，CaM基因有1個上調，6個下調。酸棗葉片在處理后均出現(xiàn)上調，而根系大多出現(xiàn)下調。另外，SOS(salt overly sensitive)途徑是植物在鹽脅迫條件下Na+/K+調節(jié)的主要信號途徑，并在維持細胞內離子平衡起著重要作用[23]。由鹽脅迫引起細胞內Ca2+濃度的增加被SOS3 感應，SOS3與Ca2+結合并激活SOS2，通過相互作用形成 SOS2/SOS3 復合物，SOS2/SOS3 復合物將SOS2運輸至質膜從而激活SOS1的活性，將Na+排出細胞，從而減少Na+的積累，維持細胞的離子平衡[24-26]。研究在酸棗幼苗葉片中發(fā)現(xiàn)2個上調表達的SOS2相關基因，根中發(fā)現(xiàn)1個下調表達的SOS2相關基因，推測鹽脅迫下酸棗幼苗中存在SOS信號傳導途徑可能參與CaCl2緩解鹽脅迫響應。

在植物對逆境脅迫的應答反應中轉錄調控具有重要的作用，植物感受外界環(huán)境條件發(fā)生變化時，通過一系列傳遞激發(fā)轉錄因子從而啟動基因的轉錄表達，調控并減輕逆境脅迫對植物的傷害[27]。在植物體中和逆境抗性相關的主要有4 類：AP2/EREBP、MYB、WRKY、和bZIP/HD-ZIP[28]，其中MYB轉錄因子是其中功能最豐富、數(shù)量最多的轉錄因子家族之一[29,30]。有大量的研究指出MYB基因能調節(jié)鹽脅迫下ABA生物合成和信號傳導來調節(jié)植物鹽脅迫耐受[31,32]。通過高通量測序研究發(fā)現(xiàn)甜瓜[33]、花生[34]等植物在鹽脅迫下MYB轉錄因子的基因表達量發(fā)生了明顯變化，這些都證明MYB轉錄因子參與了植物對鹽脅迫的響應。在試驗中發(fā)現(xiàn)酸棗幼苗NaCl脅迫下，添加外源CaCl2后有MYB轉錄因子參與了響應，在葉中有個23個MYB 基因上調表達，3個下調表達；根中有6個MYB 基因上調表達，28個下調表達。這些轉錄因子的表達量發(fā)生變化，MYB轉錄因子參與CaCl2緩解鹽脅迫應答，并在酸棗鹽脅迫響應中起到重要的作用。

4 結 論

研究對NaCl處理和NaCl+CaCl2處理的酸棗幼苗葉片和根系進行了轉錄組分析，利用高通量測序技術獲得了酸棗轉錄組的大部分信息，比較了兩種處理后的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)酸棗幼苗葉片和根系上調基因分別為7 365和762個，下調基因的分別有1 247和4 861個。GO富集分析中，差異基因主要在催化活性、膜、膜部件、膜固有成分、膜的組成部分等；KEGG分析表明，差異基因主要在涉及植物病原互作、MAPK信號通路-植物、植物激素信號轉導、苯丙醇生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化等。