李宏珍,趙 婷,趙 雪,李旭軍
(成都市華測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司,四川成都 610041)
不確定度反映了在檢測(cè)過(guò)程中由誤差導(dǎo)致的實(shí)際值出現(xiàn)偏差的大小程度,是檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確程度的一種評(píng)價(jià)指標(biāo)和方式。檢測(cè)機(jī)構(gòu)在出具試驗(yàn)報(bào)告的同時(shí)出具該檢測(cè)項(xiàng)目的不確定度說(shuō)明,能夠更加確切地說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)室所具有的檢測(cè)能力及技術(shù)水平[1],因此評(píng)定一個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目的不確定度在試驗(yàn)方法、流程及試驗(yàn)結(jié)果中扮演著至關(guān)重要的角色,在實(shí)際檢測(cè)中不容忽視。
甜蜜素作為一種甜味劑食品添加劑,在食品行業(yè)發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用,被應(yīng)用于很多食品中,但同時(shí)也是很多食品中禁止使用的食品添加劑。參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.97—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測(cè)定》第一法氣相色譜法,測(cè)定雪糕中的甜蜜素并進(jìn)行不確定度評(píng)定。了解其不確定度的主要來(lái)源,以便在工作中引起重視并予以改進(jìn),為檢測(cè)結(jié)果的正確評(píng)價(jià)提供一定的科學(xué)依據(jù)。
1.1.1 儀器
7890B型氣相色譜儀,安捷倫科技有限公司產(chǎn)品;LE204E 220 g/0.1 mg型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品;SK8200HP型超聲波清洗機(jī),上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司產(chǎn)品;XW-80A型渦旋混合器,上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品;LD5-2B型離心機(jī),北京京立離心機(jī)有限公司產(chǎn)品。
1.1.2 試劑
氫氧化鈉(分析純),成都市科隆化學(xué)品有限公司提供;正己烷(色譜純),上海星可高純?nèi)軇┯邢薰咎峁?;氯化鈉(分析純)、濃硫酸(分析純)、硫酸鋅(分析純)、亞硝酸鈉(分析純)、亞鐵氰化鉀(分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。
按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.97—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測(cè)定》第一法氣相色譜法[2]檢測(cè)方法,稱雪糕樣品5 g于50 mL離心管,加水30 mL,超聲提取30 min,加入2 mL亞鐵氰化鉀和2 mL硫酸鋅溶液,混勻沉淀蛋白后以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min,過(guò)濾,收集濾液并用水定容至50 mL,混勻備用。取收集液于50 mL離心管中,冰浴冷卻5 min后加入正己烷,混勻后加入2.5 mL亞硝酸鈉溶液和2.5 mL硫酸水溶液,混勻后冰浴環(huán)境下衍生30 min,衍生期間振蕩3~5次以確保衍生完全。衍生后加入適量氯化鈉,混勻后以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min,取上清液上機(jī)分析。
取甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液 (10.0 mg/mL) 50,100,200,500μL和甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 mg/mL) 100,200μL,用超純水定容至10.0 mL,得到10,20,50,100,200,500μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液,并同樣品一起衍生。
色譜柱HP-5(30 m×320μm×0.25μm);進(jìn)樣口溫度230℃,分流比5∶1,升溫程序?yàn)槌跏紲囟?5℃保持0 min,以10℃/min速率升至90℃保持0.5 min,以20℃/min速率升至200℃保持3 min,進(jìn)樣量1μL,檢測(cè)器溫度260℃,色譜柱流量1 mL/min,氫氣流量30 mL/min,空氣流量330 mL/min。
評(píng)定某個(gè)項(xiàng)目的不確定度,應(yīng)在計(jì)算公式的基礎(chǔ)上建立數(shù)學(xué)模型并逐步分析可能引入不確定度的因素[3],試驗(yàn)中甜蜜素含量計(jì)算公式為:
式中:X1——試樣中甜蜜素的含量,g/kg;
C——由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出定容樣液中甜蜜素的質(zhì)量濃度,μg/mL;
m——試樣質(zhì)量,g;
V——試樣的最后定容體積,mL;
f——回收率,%。
結(jié)合以上公式和《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[4],氣相色譜法測(cè)雪糕中甜蜜素含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定為:
結(jié)合測(cè)定試樣中甜蜜素的計(jì)算公式、檢測(cè)方法和實(shí)際操作對(duì)其不確定度來(lái)源分析可知,采用氣相色譜法測(cè)雪糕中甜蜜素含量,影響試驗(yàn)結(jié)果的不確定度因素主要包括稱取樣品誤差,試樣定容誤差,標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的誤差,試驗(yàn)過(guò)程中回收率引入誤差[5]。
甜蜜素含量測(cè)定不確定來(lái)源見(jiàn)圖1。
當(dāng)稱樣量為5.000 0 g,所需天平的最大允許誤差為±0.1 mg,按照矩形分布原則,在樣品稱量過(guò)程中天平引入的不確定度為:
甜蜜素在檢測(cè)過(guò)程中由標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度主要包括標(biāo)準(zhǔn)品的純度、標(biāo)品的稱量及標(biāo)品的配制過(guò)程,具體分析如下:
3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度(P) 引入的不確定度
由甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液證書(shū)可知其純度為99.90%,按照矩形分布原則,由標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)不確定度分別為:
相對(duì)不確定度為:
3.2.2 天平稱量引入的不確定度
標(biāo)品的稱量需用十萬(wàn)分之一的天平,其最大允許誤差為±0.01 mg,按照矩形分布原則,稱取113 mg甜蜜素標(biāo)品時(shí),由天平引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)不確定度分別為:
相對(duì)不確定度為:
3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品配制過(guò)程中引入的不確定度
標(biāo)準(zhǔn)品在配制過(guò)程中,所使用的定容容器和環(huán)境溫度的變化是引入不確定度的主要來(lái)源,具體分析如下:
(1)標(biāo)準(zhǔn)品配制過(guò)程中由定容容器引入的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)品在配制過(guò)程中需使用A級(jí)容量瓶(10.0 mL) 和A級(jí)單標(biāo)線吸量管(5.0 mL),依據(jù)JJG 196—2006常用玻璃量具檢定規(guī)程,A級(jí)容量瓶(10.0 mL)的最大允許偏差為±0.020 mL,A級(jí)單標(biāo)線吸量管(5.0 mL)最大允許偏差為±0.015 mL,按照矩形分布原則,A級(jí)容量瓶(10.0 mL) 引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)不確定度分別為:
相對(duì)不確定度為:
A級(jí)單標(biāo)線吸量管(5.0 mL)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)不確定度分別為:
相對(duì)不確定度為:
則在標(biāo)準(zhǔn)品配制過(guò)程中由定容容器引入的合成不確定度為:
(2)標(biāo)準(zhǔn)品配制過(guò)程中環(huán)境溫度變化引入的不確定度。在標(biāo)品配制過(guò)程中,環(huán)境溫度的變化也會(huì)影響標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的準(zhǔn)確性,從而產(chǎn)生不確定度。依照J(rèn)JG 196—2006常用玻璃量具檢定規(guī)程,玻璃量器最佳使用環(huán)境溫度為20℃,而實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度保持在20±5℃,在20±5℃溫度范圍下,水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4,此系數(shù)遠(yuǎn)大于玻璃器具的體積膨脹系數(shù),因此在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中,環(huán)境溫度變化對(duì)玻璃器具體積的影響可忽略[6],按照矩形分布原則,標(biāo)品配制過(guò)程中溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)不確定度分別為:
相對(duì)不確定度分別為:
則在標(biāo)準(zhǔn)品配制過(guò)程中由定容容器引入的不確定度為:
綜合以上分析,標(biāo)準(zhǔn)品在配制過(guò)程中引入的合成不確定度為:
用10.0 mg/mL的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制系列曲線10,20,50,100,200,500μg/mL時(shí),需使用移液管 (1 mL) 6次和容量瓶 (10 mL) 6個(gè)[7]。
3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制由移液管引入的不確定度
依照J(rèn)JG 196—2006常用玻璃量具檢定規(guī)程A級(jí)1 mL移液管的允許誤差為±0.007 mL,按照矩形分布的原則,使用6次移液管(1 mL) 引入的相對(duì)不確定度為:
3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制由容量瓶引入的不確定度
依據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃量具檢定規(guī)程》,A級(jí)容量瓶(10.0 mL) 的最大允許偏差為±0.020 mL,照矩形分布的原則,標(biāo)準(zhǔn)工作液配制由容量瓶(10 mL) 引入的相對(duì)不確定度為:
3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制由環(huán)境溫度變化引入的不確定度
根據(jù)3.2標(biāo)準(zhǔn)品配制過(guò)程環(huán)境溫度變化引入的不確定度計(jì)算原則,A級(jí)移液管(1 mL) 和容量瓶(10 mL)在使
用時(shí)由環(huán)境溫度引入的相對(duì)不確定度分別為:
綜合以上分析,標(biāo)準(zhǔn)工作液在配制過(guò)程中引入的合成不確定度為:
所用標(biāo)準(zhǔn)工作液為6個(gè)不同質(zhì)量濃度梯度,且每個(gè)梯度重復(fù)測(cè)定3次,并采用最小二乘法擬合甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)曲線[8],得每個(gè)梯度質(zhì)量濃度的峰面積。
最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。
擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為:
式中:y——色譜峰面積,mAU;
表1 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)
a——曲線斜率;
x——甜蜜素質(zhì)量濃度,μg·mL-1;
b——截距
即擬合曲線結(jié)果為:y=2.119 3x+0.892 5,R2=1.000 0.
則標(biāo)準(zhǔn)工作液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差
對(duì)樣品重復(fù)平行測(cè)定9次,得雪糕試樣中甜蜜素的平均含量為C樣=26.615μg/mL,則由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的相對(duì)不確定度為:=0.008 86.
綜合以上分析,由標(biāo)準(zhǔn)品配制、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的合成不確定度為:
3.5.1 定容容器引入的不確定度
試樣在處理過(guò)程中使用了A級(jí)50 mL容量瓶(50 mL),依據(jù)JJG 196—2006常用玻璃量具檢定規(guī)程,A級(jí)容量瓶(50 mL) 的最大允許偏差為±0.05 mL,按照矩形分布原則,試樣處理過(guò)程中定容容器引入的相對(duì)不確定度為:
3.5.2 定容過(guò)程中由環(huán)境溫度變化引入的不確定度
依照J(rèn)JG 196—2006常用玻璃量具檢定規(guī)程,玻璃量器應(yīng)在環(huán)境溫度為20℃條件下使用,而實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度保持在20±5℃,在此溫度范圍內(nèi),水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4,按照矩形分布原則,在定容時(shí)溫度變化引入的相對(duì)不確定度分別為:
因此試樣定容過(guò)程中的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
樣品在進(jìn)行前處理時(shí),每一步的操作都可能引入誤差,逐步分析每一操作所引入的不確定度很困難,則結(jié)合實(shí)際工作情況,可用回收率來(lái)統(tǒng)一評(píng)定試樣在處理過(guò)程中引入的不確定度[9]。對(duì)雪糕樣品進(jìn)行高、中、低3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),且每個(gè)水平進(jìn)行3次平行測(cè)定,根據(jù)9次測(cè)定結(jié)果計(jì)算其回收率。
加標(biāo)回收試驗(yàn)引入的不確定度見(jiàn)表2。
表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)引入的不確定度
則由樣品前處理過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度[10]為:
綜合以上各個(gè)分量的相對(duì)不確定度,計(jì)算氣相色譜法測(cè)定雪糕中甜蜜素的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
參照標(biāo)準(zhǔn)JJF 1059.1—2012測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[11],對(duì)于大多數(shù)測(cè)定不確定評(píng)估,取置信水平95%,k=2。試驗(yàn)用氣相色譜法測(cè)定雪糕中甜蜜素含量的平均結(jié)果X=0.266 g/kg,則擴(kuò)展不確定度為:
因此,按照國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)用氣相色譜法對(duì)雪糕中甜蜜素進(jìn)行測(cè)定,其測(cè)定結(jié)果為X=0.266 g/kg±0.015 0 g/kg,k=2,p=95%。
采用氣相色譜法測(cè)定雪糕中甜蜜素含量結(jié)果:0.266 g/kg±0.015 0 g/kg,k=2,p=95%。參考國(guó)標(biāo)GB 5009.97—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測(cè)定第一法氣相色譜法,同時(shí)根據(jù)測(cè)定不確定度的評(píng)定方法,建立氣相色譜法測(cè)甜蜜素的數(shù)學(xué)模型,從稱量樣品、標(biāo)品、標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品定容、測(cè)試過(guò)程中加標(biāo)回收率幾個(gè)方面對(duì)不確定度進(jìn)行評(píng)價(jià),根據(jù)對(duì)各分量不確定度結(jié)果分析可知,氣相色譜法測(cè)定雪糕中甜蜜素的不確定度主要來(lái)源為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合,其次是標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制及檢測(cè)過(guò)程中回收率,此結(jié)論與眾多類(lèi)似研究結(jié)果基本保持一致[12-16]。因此,在實(shí)際測(cè)定過(guò)程中,為提高檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度,應(yīng)著重注意以下幾點(diǎn):增加標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度測(cè)定的次數(shù)及平行樣品的測(cè)定;通過(guò)定期培訓(xùn)或練習(xí)的方式提高人員的技術(shù)水平,提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性;所使用的天平及量器應(yīng)及時(shí)定期檢定與維護(hù),以保持設(shè)備的最佳狀態(tài)。