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        柱前衍生高效液相色譜法測定中韓泡菜中的氨基酸含量

        2019-10-22 08:59:08賈載凱毛新剛蘇曉嵐灑榮波
        農(nóng)產(chǎn)品加工 2019年20期
        關鍵詞:檢測

        賈載凱,毛新剛,蘇曉嵐,張 云,灑榮波

        (1.山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院) 生命科學學院,山東泰安 271000;2.泰安市疾病預防控制中心,山東泰安 271000)

        泡菜是中國、韓國等亞洲國家傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜食品,是以新鮮蔬菜為原料,在多種微生物作用下經(jīng)鹽水泡制而成的發(fā)酵蔬菜[1]。泡菜風味獨特、鮮酸可口、質地脆嫩、營養(yǎng)豐富,具有增加食欲、促進消化、解膩開胃的作用,經(jīng)常食用具有延年益壽、預防癌癥等功效[2]。中國泡菜的杰出代表傳統(tǒng)四川泡菜已有1 700多年的歷史,以新鮮蔬菜為主要原料,將發(fā)酵原料浸泡在密閉的容器中,不添加過多的調味料[3]。韓國泡菜以大白菜等各種蔬菜為主要原料,調料豐富多樣且配比合理,以腌漬式進行兼性厭氧型的發(fā)酵過程[4]。無論中國泡菜還是韓國泡菜,風味是其中的一項重要指標。泡菜的風味物質包括有機酸[5]、氨基酸[6]、揮發(fā)性風味物質[7]等。

        目前,氨基酸的檢測主要采用氨基酸分析儀和液相色譜儀等手段,氨基酸分析儀檢測氨基酸雖然快速、準確,但由于儀器昂貴,且運行成本高不具有普遍性[8]。近年來,柱前衍生化液相色譜法檢測氨基酸得到了更加普遍的應用。檢測氨基酸常用的衍生試劑主要有芴甲氧羰酰氯(FMOC-CL)、6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(AQC)、2,4-二硝基氟苯(DNFB)、異硫氰酸苯酯(PITC)及鄰苯二甲醛(OPA)等。其中,使用PITC對氨基酸進行衍生具有操作簡單、產(chǎn)物穩(wěn)定、反應迅速等優(yōu)點,已成為一種經(jīng)典的氨基酸衍生方法[9]。試驗建立了一種柱前衍生化HPLC方法快速檢測中韓泡菜中的游離氨基酸種類和含量,以期為中韓泡菜風味物質的來源研究提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料、試劑和儀器

        中國泡菜,購自四川味之源食品有限公司;韓國泡菜,購自香港進口韓國泡菜代理清關公司。

        17種氨基酸混合標樣:天門冬氨酸(Asp)、谷氨酸 (Glu)、絲氨酸 (Ser)、甘氨酸 (Gly)、組氨(His)、精氨酸(Arg)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys),17種氨基酸的濃度均為2.5 mmol/L,購自美國沃特世公司;乙腈(色譜純),購自德國默克公司;異硫氰酸苯酯、乙酸鈉、正己烷等,均為國產(chǎn)分析純試劑。

        安捷倫1200型高效液相色譜儀,可以使用二元、三元和四元梯度;安捷倫1200型二極管陣列檢測器;Milli-Q型超純水制備機。

        1.2 試劑配制

        (1) 異硫氰酸苯酯乙腈溶液(0.1 mol/L):準確移取120μL異硫氰酸苯酯溶液至10 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度。

        (2) 三乙胺乙腈溶液 (1 mol/L):準確移取1.398 mL三乙胺至10 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度。

        (3) 乙酸鈉緩沖鹽溶液:準確稱量2.72 g三水乙酸鈉,溶解于1 000 mL水中,充分混合后,用0.45μm水相濾膜過濾,超聲處理后備用。

        1.3 樣品預處理

        取10 g泡菜于80℃下烘干后加石英砂研磨,溶于50 mL去離子水超聲處理30 min后離心取上清液待衍生化處理。

        1.4 樣品衍生化

        向2 mL離心管中加入氨基酸混合標樣或泡菜樣品(過0.45μm濾膜)50μL和150μL超純水,再加入異硫氰酸苯酯乙腈溶液100μL和三乙胺乙腈溶液100μL后振蕩混勻。靜置1 h后加入正己烷400μL,充分振蕩后靜置10 min,待溶液分層后取下層溶液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后進行HPLC分析。

        1.5 色譜條件

        色譜柱使用美國SMA氨基酸分析柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流動相A為乙酸鈉緩沖液-乙腈(97∶3,V/V),流動相B為乙腈-水(4∶1,V/V),流速1.0 mL/min,檢測波長254 nm,柱溫30℃,進樣量10μL,設計梯度洗脫程序。

        梯度洗脫程序見表1。

        表1 梯度洗脫程序

        1.6 數(shù)據(jù)處理

        采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,每組進行3次平行試驗,結果取平均值。

        2 結果與分析

        2.1 氨基酸標樣的定性

        采用Agilent TC-C18柱、Ultimate XB C-18、ODS通用柱和美國SMA氨基酸專用分析柱對氨基酸標樣中的17種氨基酸進行檢測,發(fā)現(xiàn)使用美國SMA氨基酸專用分析柱檢測可以使氨基酸標樣中的17種氨基酸達到基線分離,17種氨基酸色譜峰的分離度均大于1.5,在選定的分離條件下,其分離效果和穩(wěn)定性最好。所有的氨基酸在35 min內即全部出峰,相對于其他氨基酸檢測的報道,試驗的檢測方法更具有檢測時間上的優(yōu)勢。

        17種氨基酸混合標樣高效液相色譜圖見圖1。

        2.2 氨基酸檢測標準曲線和檢測方法的檢測限

        將氨基酸混和標準溶液(2.5 mmol/L) 按2倍梯度逐漸稀釋至0.01 mmol/L,按照上述的色譜條件進行紫外檢測,以各氨基酸色譜峰峰面積(Y)對氨基酸濃度(X) 進行回歸分析,得到線性回歸方程。結果表明,除天冬氨酸和谷氨酸檢測標準曲線的線性范圍較窄外(分別為0.08~2.50 mmol/L和0.16~2.50 mmol/L),其他氨基酸基本在0.02~2.50 mmol/L范圍內均具有較好的線性關系,所有氨基酸的標準曲線在設定的線性范圍內的相關系數(shù)均≥0.99。

        圖1 17種氨基酸混合標樣高效液相色譜圖

        17種氨基酸的線性回歸方程、檢測限和分離度見表2。

        2.3 中韓泡菜氨基酸種類和含量的測定

        中國泡菜中氨基酸高效液相色譜圖見圖2,韓國泡菜中氨基酸高效液相色譜圖見圖3。

        圖2 中國泡菜中氨基酸高效液相色譜圖

        表2 17種氨基酸的線性回歸方程、檢測限和分離度

        圖3 韓國泡菜中氨基酸高效液相色譜圖

        從氨基酸種類來看,中國泡菜中的游離氨基酸種類比韓國泡菜要少,中國泡菜中沒有酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸,其他14種氨基酸均存在;韓國泡菜中除了沒有蛋氨酸以外,其他16種氨基酸均存在。從氨基酸含量來看,中國泡菜中的各種氨基酸含量均遠大于韓國泡菜,其中中國泡菜中的天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸和甘氨酸含量比韓國泡菜高出1倍左右,而苯丙氨酸含量比韓國泡菜高出近8倍;中國泡菜中的總氨基酸含量(12 204.19μg/g泡菜)遠高于韓國泡菜中的總氨基酸含量(5 275.27μg/g泡菜),前者為后者的2.3倍。

        樣品中氨基酸檢測結果見表3。

        表3 樣品中氨基酸檢測結果

        2.3 加樣回收率和精密度試驗

        對中國泡菜樣品進行2個水平(半量、等量)的加標試驗,平行測定3次,平均加標回收率在79.5%~94.7%,相對標準偏差為1.23%~5.76%,可以滿足泡菜中氨基酸含量測定的要求。

        2.4 重復性試驗

        將17種氨基酸混合標樣在試驗的檢測條件下連續(xù)進樣3次,考查檢測方法的重復性。結果顯示17種氨基酸的峰面積的相對標準偏差RSD為0.2%~0.7%。

        3 結論

        建立了一種快速有效的檢測中國泡菜和韓國泡菜中的游離氨基酸含量的方法,經(jīng)PITC衍生后,17種氨基酸在36 min以內均得到了基線分離,檢測時間優(yōu)于已經(jīng)報道的文獻中氨基酸的檢測時間。利用此方法對中國泡菜和韓國泡菜中的游離氨基酸種類和含量進行了檢測,結果發(fā)現(xiàn)中國泡菜中的氨基酸種類比韓國泡菜要少,但中國泡菜中的氨基酸含量,尤其是呈味氨基酸,均遠大于韓國泡菜。

        樣品中氨基酸的風味分析見圖4。

        氨基酸按照呈味特征可以分為4類:甜味氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、脯氨酸和蛋氨酸),苦味氨基酸(纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、精氨酸和賴氨酸),鮮味氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸),澀味氨基酸(酪氨酸)。從呈味特征方面對中韓泡菜中的氨基酸組成進行分析,從圖4中可以看出,對中國泡菜而言,甜味氨基酸是最主要的氨基酸,占氨基酸總量的50%,其次是苦味氨基酸,占到總氨基酸的46%,鮮味氨基酸只占3%,在中國泡菜中沒有發(fā)現(xiàn)澀味氨基酸。而對韓國泡菜而言,苦味氨基酸是最主要的氨基酸成分,占氨基酸總量的51%,甜味氨基酸次之,占比為37%;鮮味氨基酸和澀味氨基酸分別占氨基酸總量的3%和6%。

        風味是泡菜的一個主要品質指標[10],通過對風味物質的檢測和定量分析,可以為泡菜加工工業(yè)的品質控制及工藝改進提供依據(jù)[11]。氨基酸作為泡菜中非常重要的一類風味物質,其快速和準確的檢測方法,一直是人們研究的一個重點和熱點。試驗為中韓泡菜風味物質的來源研究提供了理論依據(jù),值得泡菜加工企業(yè)借鑒。

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