張 立，董介軒，殷志榮，石小東，李 皎，許燕飛，董 瑋

(云南省中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院 骨傷科，云南 昆明 650032)

坐骨神經(jīng)痛為臨床多見周圍神經(jīng)疾病，指坐骨神經(jīng)或其周圍結(jié)構(gòu)病變?cè)斐傻淖巧窠?jīng)通路和它所分布范圍內(nèi)出現(xiàn)的疼痛綜合征[1]。臨床表現(xiàn)有：雙下肢放射性疼痛、雙腿麻木、雙腳麻木且無力等[2]，對(duì)患者生活質(zhì)量影響嚴(yán)重?，F(xiàn)代研究表明，坐骨神經(jīng)痛占全球周圍神經(jīng)疾病患病率的1.2%～43%[3]。該病治療方法多樣，主要分為手術(shù)治療、非手術(shù)治療，療效不一。在臨床工作中針刀松解法用于治療坐骨神經(jīng)痛療效良好，文獻(xiàn)報(bào)道也肯定了針刀松解治療坐骨神經(jīng)痛的療效[4]。普遍認(rèn)為針刀松解能減輕局部組織粘連而起到治療作用，對(duì)于針刀松解法對(duì)中樞鎮(zhèn)痛物質(zhì)影響報(bào)道較少?；诖吮緦?shí)驗(yàn)通過觀察針刀松解法治療坐骨神經(jīng)痛大鼠后其中樞各部位組織內(nèi)CCK-8、β-EP、L-ENK表達(dá)水平。試探討針刀松解法對(duì)坐骨神經(jīng)痛大鼠中樞腓呔類物質(zhì)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性成熟SD大鼠90只，體重(200g±20g)隨機(jī)分為對(duì)照組、神經(jīng)損傷組和針刀松解組，每組30只。

1.2 主要試劑及儀器 Leu Enkephalin抗體(abcam公司，貨號(hào)：Ab85798)；Beta endorphin抗體(Bioss公司，貨號(hào)：Bs-1195R)；β-Actin抗體(abcam公司，貨號(hào)：AB6276)；Anti-Rabbit IgG (whole molecule)-Peroxidase antibody抗體(Sigma公司，貨號(hào)：A6154)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(beyotim公司，貨號(hào)：P0009-1)；Immobilon Western HRP Substrate Luminol Reagent(Millipore公司，貨號(hào)：WBKLS0500)；RIPA裂解液(強(qiáng))(Beyotime公司，貨號(hào)：P0013B)；二抗孵育試劑盒(中杉金橋公司，貨號(hào)：PV-9000)；CCK-8放免試劑盒(EB公司，貨號(hào)：xY-10049)；全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀(西安核儀器廠 ，型號(hào)：XH-6020)；放免、免疫組化、Western blotting相關(guān)儀器及實(shí)驗(yàn)手術(shù)相關(guān)器械。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 造模 對(duì)照組10%水合氯醛0.4mL/100g腹腔注射麻醉后，僅手術(shù)不結(jié)扎神經(jīng)。神經(jīng)損傷組和針刀松解組參照Bennett等[5]方法建立CCI模型： 10%水合氯醛0.4mL/100g腹腔注射,在消毒條件下,沿大鼠左側(cè)后肢大腿外側(cè)切皮,暴露坐骨神經(jīng)干,用4號(hào)鉻制羊腸線環(huán)繞神經(jīng)干分別作4個(gè)輕度結(jié)扎,結(jié)扎間距約1mm,結(jié)扎強(qiáng)度以引起小腿肌肉輕度顫動(dòng)反應(yīng)為宜,將結(jié)扎后坐骨神經(jīng)放回原位，消毒后間斷縫合術(shù)口，術(shù)畢放回原籠，給正常飼喂。進(jìn)行行為學(xué)觀察，行走速度變慢，步幅和頻率減小，用嘴反復(fù)舔后爪，足趾并攏輕度外翻、自發(fā)性的縮足反射等現(xiàn)象，即為造模成功。

1.3.2 針刀松解 針刀松解組：造模成功后于第14、21、28天進(jìn)行針刀干預(yù)。具體操作：對(duì)大鼠術(shù)側(cè)肢體原術(shù)口周圍進(jìn)行觸診，于坐骨神經(jīng)結(jié)扎周圍找到條索狀物并用龍膽紫定點(diǎn)，每次選1～2個(gè)點(diǎn)，常規(guī)備皮、消毒，用針刀縱向疏通及橫向剝離，出針后以消毒棉簽按壓針眼孔片刻。每周干預(yù)1次，共3周。其余兩組不予任何處理，給正常飼喂。

1.3.3 取材 造模成功后35d將各組大鼠處死，分離出延髓、丘腦、海馬、腰膨大處脊髓。各部位腦組織及脊髓于冰皿上編號(hào)，樣品稱重記錄后置于-70℃保存待測(cè)。

1.3.4 CCK-8的檢測(cè) 以標(biāo)準(zhǔn)管濃度為X軸，以B/T×100% 為Y軸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。嚴(yán)格按照CCK-8放免試劑盒操作說明檢測(cè)組織樣本，采用全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀進(jìn)行讀值，根據(jù)樣品檢測(cè)值以B/T×100%值計(jì)算相應(yīng)樣品的濃度結(jié)果。

1.3.5 免疫組化測(cè)定L-ENK、β-EP 稱取組織樣本用PBS清洗用4%的多聚甲醛浸泡固定24～48 h，固定好的組織放入100%酒精脫水60 min，將脫水好的組織放入二甲苯中浸泡透明90 min，石蠟浸泡滲透120 min，經(jīng)石蠟包埋后，將組織塊固定在切片機(jī)上，切厚度為4 μm的切片，切好后放到50%的酒精中展片，再放到42℃水浴中展片，展平后用陽離子玻片貼片，貼好后放到56℃烘箱中烤片，待石蠟融化后取出玻片放到片盒中。將組織片放入64℃恒溫箱中烘烤30 min，經(jīng)過脫蠟、水化、抗原修復(fù)后，給3%H2O2水37℃孵育10 min，阻斷過氧化物酶；根據(jù)抗體說明書選擇合適的稀釋比例用PBS稀釋一抗，將稀釋好后的一抗滴加到玻片上，放到4℃冰箱中過夜，第2天放到37℃溫箱中復(fù)溫30 min,PBS沖洗3次，每次5 min；滴加反應(yīng)增強(qiáng)液到組織片上，37℃孵育20 min,PBS沖洗3次，每次5 min；滴加試劑盒中的通用二抗在組織塊上，37℃孵育30 min,PBS沖洗3次，每次5 min；將組織片進(jìn)行DAB顯色、蘇木素復(fù)染；染色后的玻片給100%酒精脫水10 min，二甲苯透明10 min；用中性樹膠進(jìn)行封片，使用顯微鏡在200倍鏡下進(jìn)行拍片。

1.3.6 Western blot檢測(cè)L-ENK 取1 mL RIPA裂解液，并加入10 μL蛋白酶100×蛋白抑制劑，置于冰上備用，4℃離心機(jī)預(yù)冷；稱取組織樣本，按1∶20加入組織裂解液，用組織剪將組織盡量剪碎，冰上裂解15 min，4℃，12 500×g 10 min，取上清，再加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，于沸水浴中煮10 min,于-20℃保存或直接上樣。取0.8 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到一管蛋白標(biāo)準(zhǔn)(20 mg BSA)中，充分溶解后配制成25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。取適量25 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)，稀釋至終濃度為0.5 mg/mL。按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50∶1)配制適量BCA工作液，充分混勻。將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20 μL。各孔加入200 μL BCA工作液，37℃放置30 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定590 nm吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。根據(jù)目的蛋白的分子量大小選擇合適的凝膠濃度，分離膠配好后，加異丙醇液封，30 min后棄去異丙醇，用蒸餾水洗10次，用紙吸干水。濃縮膠配好后10 min開始使用。進(jìn)行120 V電泳到溴酚藍(lán)跑到距離玻璃板下端1 cm位置，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后均用5%脫脂牛奶室溫封閉30 min。將切下的膜在對(duì)應(yīng)一抗中室溫孵育60 min。用TBST洗至無脫脂奶粉。隨后室溫孵育二抗60 min。二抗?jié)舛仁褂?∶5 000，二抗孵育完后，TBST洗3次，每次5 min。隨后，進(jìn)行顯影。將化學(xué)發(fā)光底物A液和B液各500 μL混合好，置于避光的盒子中。3 min后，將要顯影的PVDF膜用紙吸干多余的TBST后置于裁剪好的保鮮膜上，滴加混合好的化學(xué)發(fā)光底物，2 min后，用保鮮膜將PVDF膜包好置于暗盒中用透明膠固定好，關(guān)燈，根據(jù)肉眼看到的熒光效果確定壓片時(shí)間，時(shí)間到后，將片子置于顯影液中，待顯出條帶后，置于蒸餾水中洗片，洗好后再置于定影液中定影，最后再置于蒸餾水中洗片，晾干，做好相應(yīng)的標(biāo)記。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)觀察 坐骨神經(jīng)損傷造模后，大鼠行走速度變慢，步幅和頻率減小，用嘴反復(fù)舔后爪，足趾并攏輕度外翻、自發(fā)性的縮足反射等現(xiàn)象，即為造模成功。神經(jīng)損傷組大鼠30只，造模成功27只，后期感染等其他原因死亡3只；針刀松解組大鼠30只，造模成功26只，后期感染等其他原因死亡6只；對(duì)照組大鼠30只假手術(shù)后全部存活。

2.2 大鼠中樞各區(qū)域CCK-8含量 針刀松解組除延髓各中樞區(qū)域CCK-8含量均高于神經(jīng)損傷組和對(duì)照組(P<0.01)，延髓區(qū)域針刀松解組高于對(duì)照組(P<0.01,見圖1) 。

2.3 大鼠中樞各區(qū)域L-ENK含量(Western blot檢測(cè)) 針刀松解組在中樞海馬區(qū)域明顯高于神經(jīng)損傷組和對(duì)照組(P<0.01)。其余中樞區(qū)域針刀松解組并未完全高于神經(jīng)損傷和對(duì)照組(見圖4)。

**：與對(duì)照組比較，P<0.01；ΔΔ：與神經(jīng)損傷組相比，P<0.01。圖1 大鼠中樞各區(qū)域CCK-8濃度

2.4 大鼠中樞各區(qū)域L-ENK和β-EP含量 針刀松解組在中樞海馬區(qū)域表達(dá)明顯高于神經(jīng)損傷組和對(duì)照組(見圖2、3)。

圖2 在中樞各區(qū)域各組大鼠L-ENK表達(dá)及定量結(jié)果

圖3 在中樞各區(qū)域各組大鼠β-EP表達(dá)及定量結(jié)果

海馬區(qū)域L-ENK/β-Actin灰度比值**：與對(duì)照組比較，P<0.01；* ：與神經(jīng)損傷組相比，P<0.05。圖4 在中樞各區(qū)域各組大鼠L-ENK表達(dá)水平 L-ENK/β-Actin灰度比值

3 討論

坐骨神經(jīng)痛是指沿坐骨神經(jīng)通路及其分布區(qū)的疼痛綜合征，發(fā)病年齡常在20～60歲，其中40歲左右最多見，坐骨神經(jīng)痛在體內(nèi)各種神經(jīng)痛中居于首位。目前坐骨神經(jīng)痛治療主要分為手術(shù)治療和非手術(shù)治療；非手術(shù)治療方法中，近年來小針刀治療坐骨神經(jīng)痛的報(bào)道增多且療效顯著[6]。小針刀自1976朱漢章發(fā)明至今，長期用于治療各種慢性軟組織損傷取得良好療效[7]，有臨床報(bào)道用于運(yùn)動(dòng)損傷也取得良好療效[8]；但主要認(rèn)為小針刀具有兩方面作用：改善局部微循環(huán)[9]；降低局部炎癥反應(yīng)[10]。對(duì)針刀松解法對(duì)中樞鎮(zhèn)痛物質(zhì)的影響鮮有報(bào)道，在臨床工作中采用針刀松解法治療坐骨神經(jīng)痛，除了能緩解局部癥狀外，還具有一定的中樞鎮(zhèn)痛作用[11]。本實(shí)驗(yàn)基于此，采用針刀松解CCI模型大鼠，對(duì)大鼠中樞各部位組織內(nèi)CCK-8、β-EP、L-ENK。以此試探討針刀松解對(duì)坐骨神經(jīng)痛大鼠中樞腓呔類物質(zhì)的影響。CCI模型大鼠是一種周圍神經(jīng)損傷導(dǎo)致神經(jīng)痛的經(jīng)典模型，其痛覺過敏現(xiàn)象, 癥狀可持續(xù)8周以上[12]。且CCI模型大鼠保留大部分具有傳遞疼痛作用的C類纖維, 可以很好地模擬出人類臨床常見慢性疼痛的癥狀[13]，故而實(shí)驗(yàn)選用CCI模型大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組別設(shè)置上，對(duì)照組排出手術(shù)對(duì)檢測(cè)物質(zhì)表達(dá)影響，神經(jīng)損傷組與針刀松解組數(shù)據(jù)比對(duì)明確針刀松解治療效應(yīng)，針刀松解組與對(duì)照組對(duì)比觀察中樞鎮(zhèn)痛物質(zhì)的表達(dá)。

在中樞鎮(zhèn)痛機(jī)制中，內(nèi)源性阿片呔的鎮(zhèn)痛作用不容忽視。內(nèi)源性阿片呔包括ENK、β-EP、強(qiáng)腓呔(A(1-13))[14]，本試驗(yàn)檢測(cè)的L-ENK從屬于ENK，主要分布在各級(jí)中樞。而阿片呔中以β-EP鎮(zhèn)痛能力最強(qiáng)，相當(dāng)于嗎啡鎮(zhèn)痛的數(shù)十倍，L-ENK鎮(zhèn)痛能力相對(duì)嗎啡較弱[15]。阿片呔的鎮(zhèn)痛機(jī)制認(rèn)為是降低c-AMP水平和鈣傳導(dǎo)[16]，其鎮(zhèn)痛作用可以被阿片受體拮抗劑如納洛酮翻轉(zhuǎn)[17]。本試驗(yàn)采用免疫組化法測(cè)定L-ENK、β-EP 針刀松解組在中樞海馬區(qū)域表達(dá)高于神經(jīng)損傷組及對(duì)照組，而其余區(qū)域并未表現(xiàn)出高于神經(jīng)損傷組及對(duì)照組(P<0.01)。Western blot檢測(cè)L-ENK結(jié)果與免疫組化結(jié)果相似即海馬區(qū)域針刀松解組LENK表達(dá)高于神經(jīng)損傷組及對(duì)照組(P<0.01)。同樣作為阿片受體拮抗劑內(nèi)源性CCK-8，拮抗作用納洛酮的6000～8000倍，當(dāng)體內(nèi)阿片呔物質(zhì)過多時(shí)可引起 CCK-8 生成和釋放增多[18]。本實(shí)驗(yàn)通過放免檢測(cè)法檢測(cè)大鼠中樞各區(qū)域CCK-8 針刀松解組除延髓各中樞區(qū)域CCK-8均高于神經(jīng)損傷組和對(duì)照組(P<0.01)，延髓區(qū)域針刀松解組CCK-8表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.01)。即在治療過程存在針刀松解組大鼠中樞內(nèi)啡呔類物質(zhì)表達(dá)水平高于神經(jīng)損傷組及對(duì)照組，而大鼠長期處于疼痛狀態(tài)體內(nèi)自發(fā)鎮(zhèn)痛機(jī)制降低大鼠體內(nèi)腓呔類物質(zhì)的儲(chǔ)存。臨床也有報(bào)道在長期處于LDH疼痛狀態(tài)下的患者其體內(nèi)的腓呔類物質(zhì)會(huì)較正常人偏低[19]。

針刀作為針灸針與手術(shù)刀有機(jī)的結(jié)合體，近年用來治療坐骨神經(jīng)痛臨床報(bào)道有效率高。本實(shí)驗(yàn)證明用針刀松解法治療坐骨神經(jīng)痛大鼠，除改善局部癥狀，還能促進(jìn)中樞腓呔類物質(zhì)參與內(nèi)源性鎮(zhèn)痛過程。