林 健，馮 拓，郁 越，李恒宇，盛 湲

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，約占女性所有腫瘤的30%，具有侵襲性，難治愈，且易復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。近年來，乳腺癌死亡率已呈下降趨勢[1]，然而，我國乳腺癌的發(fā)病率增長非?？靃2]，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率依舊較高。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌死亡的最主要原因，及時了解乳腺癌患者的腫瘤負(fù)荷，應(yīng)用確切有效的治療手段，準(zhǔn)確掌握抗腫瘤治療療效，成為降低乳腺癌患者死亡率的關(guān)鍵。近年來一些研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞存在很大的異質(zhì)性[3-4]。一些腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新能力，其生物學(xué)特征與干細(xì)胞的基本特性十分相似，因此，有學(xué)者提出腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC)的理論[5]。這些CSC具有干細(xì)胞特性，包括自我更新、藥物抵抗、遷移能力增強(qiáng)等特點，與腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和化療抵抗密切相關(guān)，因此，CSC假說是理解腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和藥物抵抗的里程碑[6]。而尋找最具轉(zhuǎn)移性和侵襲性的乳腺癌CSC是乳腺癌治療和預(yù)后的關(guān)鍵。目前尚無公認(rèn)的CSC的標(biāo)志物，而以往報道的CD133、三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體和乙醛脫氫酶1等生物標(biāo)志物，在多種來源的干細(xì)胞膜均有表達(dá)，不能區(qū)分正常干細(xì)胞與CSC[7-9]。據(jù)文獻(xiàn)報道，表達(dá)CD44+CD24-的乳腺癌細(xì)胞因具有腫瘤產(chǎn)生能力而被認(rèn)為是CSC[10]，其表達(dá)與三陰性乳腺癌密切相關(guān)，普遍被認(rèn)為是乳腺癌干細(xì)胞。

最新研究報道，多巴胺受體可能是一個CSC的生物標(biāo)志物[11]，研究者發(fā)現(xiàn)正常人多能干細(xì)胞不表達(dá)多巴胺受體，而CSC表達(dá)所有5種多巴胺受體(DRD1-DRD5)，在三陰性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)CD44+CD24-的CSC同樣表達(dá)多巴胺受體。多巴胺受體拮抗劑硫利達(dá)嗪能通過表達(dá)在CSC上的D2受體家族，特異性地作用于CSC，抑制CSC的增殖生長。這不僅提示CSC特異性地表達(dá)多巴胺受體，并且能通過多巴胺受體信號途徑靶向抗CSC治療，也說明多巴胺受體既是一個CSC的生物標(biāo)志物，也是一個潛在靶向抗CSC的藥物靶點，具有十分重要的研究價值。但目前，多巴胺受體在乳腺癌中作用機(jī)制還不是十分清楚，尤其是多巴胺受體5個亞型在乳腺癌中的具體表達(dá)情況尚不清晰，這是開展多巴胺受體信號途徑與乳腺癌機(jī)制研究的基礎(chǔ)。本研究擬針對多巴胺受體5個亞型在乳腺癌中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，具體分析各亞型在乳腺癌及其癌旁組織中的表達(dá)情況和分布特征，并結(jié)合癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫中有關(guān)乳腺癌組織多巴胺受體表達(dá)情況進(jìn)行進(jìn)一步驗證，為今后乳腺癌CSC的研究積累數(shù)據(jù)，也為未來多巴胺受體靶向藥的開發(fā)利用提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院生物樣本庫中挑選2015年5月—2016年12月住院的20例確診女性乳腺癌患者癌與癌旁組織樣本，以及癌與癌旁組織石蠟包塊，收集其臨床病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①無其他腫瘤病史；②術(shù)前未進(jìn)行過任何抗腫瘤治療；③病理證實為乳腺癌；④無其他嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病或感染。所有患者的臨床信息均從醫(yī)院電子病歷管理系統(tǒng)中提取，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。患者均簽署了正式的知情同意文件。20例女性乳腺癌患者，年齡(58.05±13.37)歲，腫瘤大小為(2.99±1.19)cm，腋窩淋巴結(jié)個數(shù)為(3.60±7.50)。按分子分型：Lumianl A型和Lumianl B型各有3例(15%)，HER-2陽性型4例(20%)，三陰性10例(50%)。其中行WB、IHC檢測的5例患者年齡(59.60±15.06)歲，腫瘤大小為(3.82±1.46)cm，腋窩淋巴結(jié)個數(shù)為(0.80±1.79)。按分子分型：Lumianl A型、Lumianl B型、HER-2陽性型各1例(20%)，三陰性2例(40%)，病理診斷均為浸潤性導(dǎo)管癌。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 從20例乳腺癌患者的癌和癌旁組織中剪取綠豆大小樣本，使用RNAiso試劑(日本TaKaRa公司)抽提RNA，M-MLV試劑盒(日本TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄cDNA，用SYBR Green/ROX qRT-PCR Master Mix(美國Thermo公司)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR特異性引物序列(上海生工生物工程股份有限公司)包括DRD1：正向5′-CTTCCTCAACGTTTCGGAGCC-3′，反向5′-AGCTCTCCAAACGCCTTGCCTT-3′；DRD2：正向5′-TGTACAATACGCGCTACAGCTCCA-3′，反向5′-ATGCACTCGTTCTGGTCTGCGTTA-3′；DRD3：正向5′-TCTGTGCCATCAGCATAGACAGGT-3′，反向5′-TAAAGCCAAACAGAAGAGGGCAGG-3′；DRD4：正向5′-TCTTCGTCTACTCCGAGGTCCA-3′，反向5′-TGATGGCGCACAGGTTGAAGAT-3′；DRD5：正向5′-TCATCTATGCCTTCAACGCCGACT-3′，反向5′-AGCTGCGATTTCCTTGTGGAAGAC-3′。qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Green+ROX 10 μL，上下游引物1 μL，cDNA模板2 μL，H2O 7 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性15 s；60 ℃退火15 s，共45個循環(huán)。以GAPDH基因為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt來估算多巴胺受體各亞型的相對表達(dá)量。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法(western blot，WB) 從20例乳腺癌患者中選取5例乳腺癌患者，將腫瘤組織剪碎，加入RIPA裂解液(含PMSF，蛋白酶等)提取總蛋白，以BCA法測定總蛋白濃度。每樣本取20 μg總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，5%牛奶封閉1 h，一抗(1∶1 000)(jakson)4 ℃孵育過夜，1X TBST洗滌3次，二抗(1∶5 000)(jakson)孵育1 h，1X TBST洗滌3次，顯色曝光。各目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值為相對表達(dá)量。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry，IHC) 相同的5例乳腺癌患者的癌和癌旁石蠟樣本，進(jìn)行組織切片。選擇腫瘤組織面積較大、形態(tài)保存較為完好的石蠟切片，經(jīng)脫蠟水化、3%H2O2甲醇液封閉、0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)、1%BSA封閉，加一抗(absin)4 ℃過夜，加二抗(即用型，美國Thermo公司)室溫孵育45 min，DAB顯色、蘇木素復(fù)染，脫水封片拍照。陽性細(xì)胞染色標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞膜染色明顯，和背景對比清楚。每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野進(jìn)行結(jié)果判定，按染色強(qiáng)度計分:未著色(0分)，淡黃(1分)，棕黃(2分)，棕褐(3分)。按著色細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞總數(shù)計分：陽性細(xì)胞數(shù)≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，≥51%計3分。根據(jù)兩項計分之和判定其結(jié)果，<3分計為陰性(-)，≥3分計為陽性(+)，≥4分為弱陽性(++)，≥6分為強(qiáng)陽性(+++)。使用Image-Pro Plus(IPP)軟件測量多巴胺受體蛋白相對表達(dá)量。免疫組化染色陽性呈黃色，IPP軟件通過測量圖片中黃色光密度和面積，轉(zhuǎn)化為蛋白相對表達(dá)量，半定量地得出多巴胺受體表達(dá)的值。

1.2.4 TCGA數(shù)據(jù)庫分析 通過TCGA官網(wǎng)(https://cancergenome.nih.gov/)，以乳腺癌為關(guān)鍵詞查找乳腺癌樣本庫，并篩選有多巴胺受體基因表達(dá)信息的樣本，下載其臨床病理資料(包括患者性別、年齡、臨床分期、病理類型、乳腺癌分子分型、ER、PR、HER-2、腋窩淋巴結(jié)情況、手術(shù)術(shù)式、轉(zhuǎn)移情況、生存情況)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 TCGA乳腺癌數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果 從TCGA數(shù)據(jù)庫一共下載了112例乳腺癌患者癌和癌旁組織的多巴胺受體表達(dá)的數(shù)據(jù)，分析乳腺癌樣本中多巴胺受體的5種亞型基因的表達(dá)情況(圖1)。其中DRD4基因在癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)，DRD1和DRD2基因在癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織(P<0.05)，DRD3和DRD5基因在癌和癌旁組織中的表達(dá)無顯著差異(P=0.9565，P=0.5441)。分析112例乳腺癌患者臨床病理特征與多巴胺受體亞型表達(dá)的關(guān)系，經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)：DRD1基因在乳腺癌中表達(dá)與年齡相關(guān)，按年齡50歲分層，大于50歲的患者更多表現(xiàn)為DRD1基因在癌中表達(dá)下調(diào)(χ2=13.852，P<0.05)。腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，數(shù)量按0～3，4～9，9以上分層，發(fā)現(xiàn)與DRD4的表達(dá)可能存在相關(guān)性，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越少，DRD4在乳腺癌組織表達(dá)上調(diào)的比例越高(Likelihood Ratio=5.8，P=0.055)。而分子分型與多巴胺受體各亞型的表達(dá)關(guān)系比較密切，其中DRD1、DRD4基因表達(dá)情況在各分子分型之間差異顯著(Fisher’s Exact Test，P<0.05)。

橫坐標(biāo)為112例樣本，縱坐標(biāo)為癌和癌旁組織對該基因表達(dá)的差值。0以上為該亞型在癌組織中表達(dá)上調(diào)，0以下為該亞型在癌組織中表達(dá)下調(diào)圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫112例乳腺癌患者癌和癌旁組織多巴胺受體5個亞型的表達(dá)情況

2.2 qRT-PCR實驗結(jié)果 20例患者的乳腺癌樣本中，DRD1基因在9例樣本中表達(dá)上調(diào)，11例樣本中表達(dá)下調(diào)；DRD2-DRD4基因都發(fā)現(xiàn)在6例樣本中表達(dá)上調(diào)，14例樣本中表達(dá)下調(diào)；DRD5基因在4例樣本中表達(dá)上調(diào)，16例樣本中表達(dá)下調(diào)。多巴胺受體各亞型表達(dá)統(tǒng)計分析顯示，DRD4基因、DRD5基因在癌組織中表達(dá)下調(diào)(11.17±5.04 vs 14.15±6.11；15.44±3.16 vs 18.29±3.34)，差異比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，未在其他3種多巴胺受體亞型發(fā)現(xiàn)癌與癌旁組織表達(dá)有差異(DRD1基因P=0.2436，DRD2基因P=0.1825，DRD3基因P=0.0839)，圖2。結(jié)合20例乳腺癌患者的臨床病理特征分析，只有DRD1基因在乳腺癌組織中表達(dá)情況與乳腺癌分子分型有關(guān)(Likelihood Ratio=10.246，P<0.05)，未能發(fā)現(xiàn)其余亞型表達(dá)情況與臨床病理資料的相關(guān)性。

A-E為DRD1-DRD5各亞型表達(dá)情況，F(xiàn)為所有DRD的表達(dá)情況，橫坐標(biāo)為20例樣本，縱坐標(biāo)為癌和癌旁對該基因表達(dá)的差值。0以上為該亞型在癌組織中表達(dá)上調(diào)，0以下為該亞型在癌組織中表達(dá)下調(diào)圖2 20例乳腺癌患者癌和癌旁組織多巴胺受體5個亞型的表達(dá)情況

2.3 WB實驗結(jié)果 結(jié)果顯示，DRD5、DRD4蛋白在癌組織和DRD1蛋白在癌旁組織的表達(dá)水平最顯著(2.82±1.56，2.73±1.42，2.50±1.21)，其中DRD5、DRD4、DRD3蛋白在癌與癌旁組織中的表達(dá)，差異比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(2.82±1.56 vs 0.65±0.58；2.73±1.42 vs 0.54±0.45；1.15±0.67 vs 0.34±0.19)(P<0.05)，DRD1、DRD2在癌與癌旁組織表達(dá)差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(1.31±1.03 vs 2.50±1.21；1.10±0.51 vs 0.57±0.39)(P>0.05)圖3。

2.4 IHC結(jié)果 根據(jù)IPP圖片分析軟件結(jié)果，Graphpad軟件繪圖分析，提示DRD1、 DRD2、 DRD3、DRD5蛋白在癌旁組織表達(dá)高于癌組織(P<0.05)，且DRD5蛋白在癌旁組織的表達(dá)顯著高于其他亞型在各組織中的表達(dá)(0.0445±0.0254，P<0.05)，圖4。根據(jù)人工閱片，多巴胺受體染色主要位于細(xì)胞膜，DRD5癌旁組織染色顯示強(qiáng)陽性(+++)，DRD5癌組織與DRD3、DRD2、DRD1癌旁組織染色顯示為弱陽性(++)，其余亞型癌組織和DRD4癌與癌旁組織染色均較弱(+)，圖5。

DRD4、DRD5蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)較高而在癌旁組織中表達(dá)下調(diào)。DRD1蛋白在癌旁組織表達(dá)較高，DRD1蛋白在癌組織表達(dá)下調(diào)；DRD3蛋白在癌旁組織中表達(dá)下調(diào)，而DRD2在癌和癌旁組織中的表達(dá)差異不明顯；GAPDH為內(nèi)參基因圖3 多巴胺受體的5種亞型在5例乳腺癌患者癌和癌旁組織中的蛋白表達(dá)情況

A-E為DRD1-DRD5癌與癌旁的IHC表達(dá)情況；F為各亞型在癌與癌旁表達(dá)情況的匯總圖4 Graphpad軟件繪圖分析結(jié)果

T為癌，N為癌旁，BLANK為空白對照，比例尺代表20 μm 圖5 DRD2、DRD3、DRD5蛋白癌與癌旁組織免疫組化染色情況

3 討論

多巴胺是重要的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，通過多巴胺受體調(diào)節(jié)人體多個器官的生理功能[12]，而多巴胺系統(tǒng)功能異常，會產(chǎn)生諸如精神分裂癥、亨廷頓氏病、帕金森病等疾病，臨床上應(yīng)用針對多巴胺受體的藥物治療此類疾病。多巴胺受體是由7個跨膜區(qū)域組成的G蛋白偶聯(lián)受體，主要分布在大腦、腎、腎上腺、交感神經(jīng)節(jié)、胃腸道、血管和心臟等周圍臟器，多巴胺受體根據(jù)他們的結(jié)構(gòu)、生化和藥理學(xué)特點分為兩類：D1類和D2類受體。D1類受體包括DRD1和DRD5(以往又稱D1B)受體；D2類受體包括DRD2，DRD3和DRD4?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為，D1類和D2類受體在跨膜區(qū)域高度同源，但卻具備不同的藥理學(xué)特性，D1類受體唯一分布在突觸后多巴胺受體細(xì)胞，能激活腺苷酸環(huán)化酶，產(chǎn)生環(huán)磷酸腺苷；而D2類受體抑制腺苷酸環(huán)化酶，與D1類受體相反，DRD2和DRD3在突觸后靶細(xì)胞和突觸前多巴胺能神經(jīng)元上都表達(dá)[12-13]。

眾多研究揭示，多巴胺及其受體在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用[14]，已有應(yīng)用多巴胺受體激動劑來治療腫瘤，如溴隱亭、卡麥角林是治療泌乳素瘤的一線用藥[15]，也有一些臨床試驗，嘗試使用多巴胺激動劑來治療乳腺癌[16]。眾多圍繞多巴胺受體激動劑或拮抗劑與乳腺癌細(xì)胞的相關(guān)性研究表明，多巴胺受體參與了乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，而特定的激動劑或抑制劑通過多巴胺受體信號途徑，能發(fā)揮抗腫瘤的作用，提示多巴胺受體在抗乳腺癌治療的應(yīng)用中具有巨大的潛力[17-20]。另外，研究發(fā)現(xiàn)多巴胺受體表達(dá)水平與乳腺癌預(yù)后相關(guān)，約30%的晚期乳腺癌中表達(dá)DRD1，并與更大腫瘤、更高等級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和更短生存相關(guān)[21]。最新報道提示多巴胺受體有可能成為篩選CSC的生物標(biāo)志[11]，尤其是CSC表達(dá)所有5種多巴胺受體，而正常人多能干細(xì)胞不表達(dá)多巴胺受體。

多巴胺受體在乳腺癌中的表達(dá)鮮有報道，1986年第一次報道人體乳腺中有多巴胺受體分布，發(fā)現(xiàn)正常乳腺組織多巴胺受體水平可忽略，而所有良性乳腺腫瘤表達(dá)可測量的低多巴胺受體水平，所有乳腺癌患者則表達(dá)更高水平的多巴胺受體水平，并且指出多巴胺及其受體可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[22]。這是第一次將多巴胺及其受體與乳腺癌聯(lián)系起來，之后展開了眾多圍繞多巴胺及其受體與乳腺癌關(guān)系的研究，尤其是多巴胺受體抑制劑及激動劑的使用，更是促使了眾多篩選多巴胺受體化合物用于抗腫瘤的研究[23-28]。

我們通過不同實驗發(fā)現(xiàn)，多巴胺受體各亞型的表達(dá)水平在乳腺癌中的結(jié)果不盡相同。TCGA數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)分析和IHC實驗結(jié)果均提示DRD1、DRD2在乳腺癌組織中低表達(dá)，在癌旁組織高表達(dá)。而qRT-PCR、WB實驗檢測則提示兩者癌與癌旁表達(dá)無差異。在IHC實驗中提示DRD3蛋白在乳腺癌組織低表達(dá)，在癌旁組織高表達(dá)，而WB得出了相反的結(jié)果，其余分析及實驗檢測未得出差異結(jié)果。除IHC實驗提示無差異外，TCGA數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)分析、WB實驗檢測均提示DRD4蛋白在乳腺癌組織中高表達(dá)、在癌旁組織低表達(dá)，而qRT-PCR檢測則得出了相反的結(jié)論。qRT-PCR檢測和IHC實驗均提示DRD5蛋白在癌旁組織高表達(dá)，在乳腺癌組織低表達(dá)，且提示DRD5在癌旁組織的表達(dá)高于所有亞型在癌和癌旁的表達(dá)，但是WB實驗結(jié)果得出了相反的結(jié)論，TCGA數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)分析未得出差異結(jié)論。

總之，多巴胺受體與乳腺癌密切相關(guān)，尤其令人矚目的是，CSC特異性地表達(dá)多巴胺受體，正常人干細(xì)胞不表達(dá)多巴胺受體，使得多巴胺受體有可能成為篩選CSC重要的生物標(biāo)志物，成為靶向抗CSC的理想靶點。開展多巴胺受體各亞型在乳腺癌中的表達(dá)研究，有助于更好地利用多巴胺受體作為特異性的生物標(biāo)志物用于CSC篩選、靶向藥物開發(fā)，這將是今后研究的一個熱點。