徐啟英，郭桂蘭

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年升高的趨勢。全世界每年約有新發(fā)病例50萬[1]。MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的非編碼RNA，它們經(jīng)過一系列的加工后可以形成大小約20～22 bp的單鏈小分子RNA，通過識(shí)別miRNA的3′UTR可以靶向誘導(dǎo)相應(yīng)的miRNA降解或抑制其翻譯[2]，從而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)，Tong和Nemunaitis[3]認(rèn)為機(jī)體內(nèi)具有癌基因活性的miRNA和具有抑癌基因活性的miRNA是保持動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)的，一旦這種平衡被打破，細(xì)胞就會(huì)向惡性轉(zhuǎn)化。因此，miRNA成為深入研究惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展，診斷治療的新靶點(diǎn)。MicroRNA-29a(miR-29a)目前是miRNAs系列中研究熱點(diǎn)的成員之一，研究已證實(shí)，miRNA-29a在很多不同類型的腫瘤中如前列腺癌、腎細(xì)胞癌、胃癌和胰腺癌不表達(dá)或者低表達(dá)，但miRNA-29a在宮頸癌中的作用尚不清楚。本研究旨在檢測miRNA-29a在宮頸鱗癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平，并探討miRNA-29a的靶向基因DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNA-methyltransferase 3 A，DNMT3A)基因、DNMT3B基因在宮頸癌組織和宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，為進(jìn)一步研究宮頸癌的發(fā)病機(jī)制和尋找腫瘤標(biāo)志物及開發(fā)治療方法提供初步理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 收集青海大學(xué)附屬醫(yī)院婦科2015年6月—2017年6月收治的20例宮頸鱗癌患者的癌組織及癌旁組織，所有標(biāo)本的臨床分期均根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(1995)，其中Ⅰb期12例，Ⅱa期8例，均為鱗癌?；颊咝g(shù)前均簽署知情同意書，研究方案經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、主要試劑和儀器 人宮頸癌細(xì)胞系Hela和人正常宮頸細(xì)胞株ECT-1(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，由青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心保存);miR-29a模擬物(miR-29a mimic)、無關(guān)序列陰性對照(microRNA negative control，miR-NC)片段及靶向基因DNMT3A、DNMT3B的引物片段(購自上海吉瑪生物公司)，mRNA提取試劑(日本TaKaRa公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time quantitative PCR,qRT-PCR)試劑(德國DBI公司)，焦碳酸二乙酯(美國Sigma公司)，RNasin(美國Promega公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國DBI公司)，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(英國Gibico公司)，RPMI1640培養(yǎng)液(美國HyClone公司)，分光光度計(jì)(型號：UV-1206，日本島津公司)，PCR擴(kuò)增儀(型號：ABI9700，美國ABI公司)，qRT-PCR儀(型號：Stratagene Mx3000P，美國Agilent公司)，DNMT3A、DNMT3B酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(美國Epigentek公司)，酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR法檢測組織和細(xì)胞中miR-29a的表達(dá) Trizol法提取組織或細(xì)胞總RNA，檢測濃度與質(zhì)量，光密度(optical density，OD)值在1.8～2.2間方可使用。按照BestarTMqRT-PCR RT Kit以及DBI Bestar?SybrGreen qRT-PCR masterMix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR。用Agilent Stratagene qRT-PCR儀Mx3000P進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)按照2-△△Ct方法處理數(shù)據(jù)。其中，△Ct=(目的基因Ct-內(nèi)參Ct)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；△△Ct=(待測樣品中目的基因△Ct-參照樣品中目的基因△Ct)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(若無參照樣品則選擇Ct最大的樣品為參照進(jìn)行計(jì)算)。MiR-29a引物由日本TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成，序列為:5′-TAGCACCATCTGAAATCGGTTA-3′。以U6作為內(nèi)參，其特異性引物序列為:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′。重復(fù)3次。

1.2.2 ELISA法檢測細(xì)胞中DNMT3A、DNMT3B的表達(dá) 按照DNMT3A、DNMT3B酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒操作方法進(jìn)行操作，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔，用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的OD值，以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

1.2.3 Western Blot法檢測組織中DNMT3A、DNMT3B表達(dá) 將組織用RIPA裂解液進(jìn)行裂解，裂解的蛋白需要BCA進(jìn)行定量，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(恒流35 mA、1 h)。經(jīng)凝膠電泳分離后，將蛋白半干轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上(20 V，1 h),用含5%脫脂奶粉的TBS進(jìn)行封閉。一抗(兔抗人DNMT3A、兔抗人DNMT3B)室溫孵育2 h，TBST洗膜3×5 min;二抗(羊抗兔HRP)室溫孵育1 h，TBST洗膜3×5 min,ECL顯影。使用Image J軟件測定條帶灰度值。

1.2.4 Western Blot法檢測細(xì)胞中DNMT3A、DNMT3B表達(dá) 宮頸癌細(xì)胞系Hela和人正常宮頸細(xì)胞株ECT-1細(xì)胞生長于RPMI1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、100%飽和濕度、5%濃度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈單層貼壁生長，細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行常規(guī)傳代。將Hela細(xì)胞以3×104/孔接種于24孔板中，實(shí)驗(yàn)分為3組：Hela細(xì)胞空白(control)組、miR-29a模擬物(miR-29a mimic)組、無關(guān)序列陰性對照(microRNA negative control，miR-NC)組。根據(jù)Lipo3000(美國ThermoFisher公司)的說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞并用60 μL 1×SDS buffer裂解。以下的操作同1.2.3。

2 結(jié)果

2.1 MiR-29a在宮頸鱗癌組織和癌旁組織中的表達(dá) 2%瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR產(chǎn)物為單一條帶，表明qRT-PCR可特異擴(kuò)增miR-29a片段。MiR-29a在宮頸鱗癌組織中的相對表達(dá)量(2-△△Ct)為0.39±0.21，低于癌旁組織1.10±0.49，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1)。

2.2 宮頸鱗癌組織中miR-29a的表達(dá)和臨床分期的關(guān)系 不同臨床分期的宮頸鱗癌組織中miR-29a的表達(dá)有差異，Ⅱa期宮頸鱗癌組織中miR-29a的相對表達(dá)量為0.23±0.07，低于Ⅰb期0.50±0.20，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

2.3 MiR-29a在人宮頸癌細(xì)胞系Hela和正常宮頸細(xì)胞系ECT-1中的表達(dá) 經(jīng)qRT-PCR檢測miR-29a在人宮頸癌細(xì)胞系Hela中的相對表達(dá)量為0.37±0.19，低于在正常宮頸細(xì)胞系ECT-1中的相對表達(dá)量1.16±0.82，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3)。

圖1 宮頸鱗癌組織和癌旁組織中miR-29a的相對表達(dá)量圖2 不同臨床分期宮頸鱗癌組織中miR-29a的相對表達(dá)量圖3 宮頸癌細(xì)胞和正常宮頸細(xì)胞中miR-29a的相對表達(dá)量

2.4 DNMT3A、DNMT3B在組織中的表達(dá)和與臨床分期的關(guān)系 經(jīng)Western Blot檢測宮頸鱗癌組織中DNMT3A的相對表達(dá)量為1，癌旁組織中的相對表達(dá)量為0.28±0.09;Ⅱa期宮頸癌組織中DNMT3A的相對表達(dá)量為1.17±0.17，高于Ⅰb期的0.88±0.12;Ⅱa期宮頸鱗癌癌旁組織中DNMT3A的相對表達(dá)量為0.38±0.11，高于Ⅰb期的0.21±0.06，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。宮頸鱗癌組織DNMT3B的相對表達(dá)量為1，癌旁組織中的相對表達(dá)量為0.14±0.04，Ⅱa期宮頸鱗癌組織中DNMT3B的相對表達(dá)量為1.29±0.21，高于Ⅰb期的0.80±0.14;Ⅱa期宮頸鱗癌癌旁組織中DNMT3B的相對表達(dá)量為0.18±0.03，高于Ⅰb期的0.11±0.02，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。圖4。

2.5 DNMT3A、DNMT3B在人宮頸癌細(xì)胞系Hela中mRNA的表達(dá) Hela細(xì)胞株過表達(dá)miR-29a后，qRT-PCR檢測Hela細(xì)胞不同轉(zhuǎn)染組中的DNMT3A，DNMT3B的mRNA表達(dá)水平,結(jié)果表明miR-29a模擬物(miR-29a mimic)組DNMT3A mRNA(0.41±0.11)，DNMT3B mRNA(0.26±0.08)的相對表達(dá)量遠(yuǎn)低于Hela細(xì)胞空白(control)組和無關(guān)序列陰性對照(miR-NC)組，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

注：與癌旁組織比較，**P<0.01；與Ⅱa期比較，*P<0.01圖4 宮頸鱗癌和癌旁組織中DNMT3A、DNMT3B的相對表達(dá)量

注：與miR-NC組比較，*P<0.01；與control組比較，**P<0.01圖5 人宮頸癌細(xì)胞系Hela中DNMT3A、DNMT3B的mRNA表達(dá)量

2.6 DNMT3A、DNMT3B在人宮頸癌細(xì)胞系Hela中蛋白的表達(dá) 用ELISA實(shí)驗(yàn)測定不同轉(zhuǎn)染組中DNMT3A，DNMT3B蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明Hela細(xì)胞過表達(dá)miR29a后，DNMT3A，DNMT3B的蛋白表達(dá)均下降，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。同時(shí)經(jīng)Western Blot再次檢測Hela細(xì)胞在不同轉(zhuǎn)染組中DNMT3A，DNMT3B的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示與Hela細(xì)胞空白(control)組和無關(guān)序列陰性對照(miR-NC)組比較，miR-29a模擬物(miR-29a mimic)組中DNMT3A，DNMT3B的蛋白表達(dá)均不同程度的下調(diào)，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖6)。Western Blot檢測結(jié)果與ELISA的結(jié)果相吻合。

表1 不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中DNMT3A、DNMT3B的蛋白表達(dá)水平

注：與Hela細(xì)胞空白(control)組和無關(guān)序列陰性對照(miR-NC)組比較，*P<0.01

注：與miR-NC組比較，*P<0.01；與control組比較，**P<0.01圖6 人宮頸癌細(xì)胞系Hela中DNMT3A、DNMT3B的蛋白表達(dá)水平

3 討論

人乳頭瘤病毒持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的初始步驟，但是其發(fā)展還需要多因素的共同作用，miRNA被認(rèn)為是此過程中的重要因素。自從miRNA在B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病的表達(dá)發(fā)生改變被證實(shí)后[4]，對miRNA在不同組織和細(xì)胞中差異性表達(dá)的研究顯著增多，有大量的研究對宮頸癌中miRNA的表達(dá)譜進(jìn)行了分析[5-7]，表明了一些miRNA在宮頸癌中的差異性表達(dá)，而這些差異性表達(dá)的miRNA可能成為宮頸癌早期診斷和治療的重要靶點(diǎn)。其中miR-29a表達(dá)下調(diào)顯著[5]，miR-29可調(diào)控人體細(xì)胞中參與細(xì)胞代謝、分化、凋亡、遷移、免疫等過程的相關(guān)基因表達(dá)，多種腫瘤和疾病中存在miR-29的異常表達(dá)。在橫紋肌肉瘤細(xì)胞和原發(fā)性腫瘤中miR-29a可誘導(dǎo)細(xì)胞分化并抑制腫瘤生長，此過程受NF-κB-YY1通路調(diào)控[8]。體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，乙肝病毒X蛋白在促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2遷移中miR-29a-PTEN-Akt調(diào)控起關(guān)鍵作用[9]。但是目前國內(nèi)有關(guān)miR-29a與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)研究報(bào)道不多。

黃智述和任黔川[10]的研究顯示，不同的宮頸病變組織中表達(dá)水平有差異，隨著宮頸病變由正常宮頸和低度鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)逐步向高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)和宮頸癌演變的過程中，miR-29a的表達(dá)水平逐步減低，miR-29a在正常宮頸和LSIL組織中表達(dá)水平相對較高，而在宮頸鱗癌及HSIL組織中呈低表達(dá)，且miR-29a在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)低于HSIL。吳玉萍[11]的研究也表明miR-29a在宮頸癌組織中的表達(dá)量明顯低于正常宮頸組織，且miR-29a在Ⅱa期宮頸癌組織中的表達(dá)量明顯低于Ⅰa期和Ⅰb期。本研究顯示，miR-29a在宮頸癌組織中的表達(dá)量低于癌旁組織，且Ⅱa期宮頸癌組織中miR-29a的相對表達(dá)量低于Ⅰb期，與國內(nèi)學(xué)者的研究結(jié)果基本一致。同時(shí)本研究對正常宮頸細(xì)胞系和宮頸癌細(xì)胞系檢測發(fā)現(xiàn)，miR-29a在宮頸癌細(xì)胞系中的mRNA和蛋白的表達(dá)均低于正常宮頸細(xì)胞系，推測miR-29a的表達(dá)下調(diào)可能與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

DNMT3A和DNMT3B分別位于2p23和20q11.2，其編碼的蛋白質(zhì)為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A和DNMT3B，可使未甲基化的DNA雙鏈發(fā)生甲基化。DNA甲基化異常與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，當(dāng)DNA甲基化酶水平升高，其可導(dǎo)致抑癌基因失活或癌基因的激活，進(jìn)一步影響惡性腫瘤易感性及機(jī)體對化療的敏感性[12]。DNMT3A和DNMT3B在多種實(shí)體腫瘤和造血系統(tǒng)腫瘤中表達(dá)升高，但有關(guān)宮頸癌的相關(guān)研究較少。在本研究中，DNMT3A、DNMT3B在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且在Ⅱa期宮頸癌組織中的相對表達(dá)量高于Ⅰb期，考慮DNMT3A、DNMT3B的高表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。在本研究中，轉(zhuǎn)染人宮頸癌Hela細(xì)胞株過表達(dá)miR-29a后DNMT3A、DNMT3B的mRNA和蛋白的相對表達(dá)量均明顯下降，也證實(shí)了DNMT3A、DNMT3B是miR-29a的靶基因，但其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為是腫瘤進(jìn)展的重要原因。本研究顯示miR-29a在宮頸癌組織中呈低表達(dá)，DNMT3A及DNMT3B在宮頸癌組織中呈高表達(dá)，且轉(zhuǎn)染人宮頸癌Hela細(xì)胞株過表達(dá)miR-29a后DNMT3A及DNMT3B的mRNA和蛋白的相對表達(dá)量明顯下降，推測miR-29a可能為抑癌基因，它可能通過降低DNMT3A及DNMT3B的表達(dá)來發(fā)揮其抑癌作用，推測miR-29a可能調(diào)控宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展，但有關(guān)miR-29a調(diào)控腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的具體分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確。目前國內(nèi)外對于miR-29a、DNMT3A及DNMT3B在宮頸癌中的具體作用及其機(jī)制研究尚不完善，本研究雖然提示miR-29a在宮頸癌組織中的表達(dá)量低于癌旁組織，DNMT3A及DNMT3B在宮頸癌組織中的表達(dá)量高于癌旁組織，且隨著腫瘤分期的增加，miR-29a的相對表達(dá)量有所降低，DNMT3A及DNMT3B的相對表達(dá)量有所增加，但是由于樣本量較少的客觀原因，仍需要更大樣本量的研究以驗(yàn)證。