吳 健，張建明，溫 穎，雷 達(dá)，吳培豐，高穎龍，王向陽(yáng)，何洪濤

結(jié)核依然是嚴(yán)重威脅人類健康的傳染病，據(jù)世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示[1]，2017年全球結(jié)核病新發(fā)病例1 000萬(wàn)，結(jié)核病死亡病例130萬(wàn)，耐利福平及耐多藥結(jié)核病例55.8萬(wàn)；中國(guó)新發(fā)結(jié)核病例88.9萬(wàn)，耐利福平及耐多藥結(jié)核病例7.3萬(wàn)，死亡結(jié)核病例3.9萬(wàn),是全球耐多藥結(jié)核最為嚴(yán)重的國(guó)家之一。到目前為止，人類依然面臨著結(jié)核預(yù)防控制、臨床診療中的諸多瓶頸問(wèn)題，建設(shè)高質(zhì)量、高標(biāo)準(zhǔn)的菌種生物樣本庫(kù)是結(jié)核基礎(chǔ)和臨床研究的基石，對(duì)于傳染源追蹤，結(jié)核傳播規(guī)律、結(jié)核耐藥機(jī)制研究，診斷試劑研發(fā)，新型治療藥物及疫苗的研制等研究領(lǐng)域都具有重要意義，最終有助于人類實(shí)現(xiàn)消滅結(jié)核的終極目標(biāo)[2]。

廣州國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心實(shí)驗(yàn)室為中華人民共和國(guó)廣州海關(guān)所屬結(jié)核病檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承擔(dān)廣東口岸出入境人員結(jié)核病疑似患者的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)任務(wù)，已在出入境人員中累計(jì)分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌近千株，來(lái)源于國(guó)內(nèi)及20余個(gè)國(guó)家和地區(qū)的出入境人員，菌種生物學(xué)資源豐富。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)室結(jié)核分枝桿菌生物樣本庫(kù)的建設(shè)情況總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本管理軟件 FreezerPro生物樣本庫(kù)管理軟件。

1.1.2 儀器設(shè)備 BACTECTMMGITTM960分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)(美國(guó)BD公司)，Baker生物安全柜，Thermo 991超低溫冰箱，超聲振蕩儀，高速離心機(jī)，HIRAYAMA高壓滅菌器，BRADY BP IP300耐低溫條碼打印機(jī)，移液器。

1.1.3 耗材 凍存盒、凍存管、凍存架、耐低溫條碼、滅菌移液吸頭、15 mL無(wú)菌離心管，5 mL離心管。

1.1.4 試劑 羅氏培養(yǎng)基，廣東省結(jié)核病控制中心提供；分枝桿菌生長(zhǎng)培養(yǎng)管(mycobacteriagrowth indicator tube,MGIT)，美國(guó)Bection Dickinson公司提供；結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)試劑盒(AccuProbe M.Tuberculosis Complex)，美國(guó)Gene-Probe公司提供；血平板，廣州環(huán)凱生物科技有限公司提供；菌種保存液[3]7H9保存液(0.47% 7H9粉劑、20%甘油、10%抗生素混合液)，配制后經(jīng)121 ℃，30 min高壓蒸汽滅菌，冷卻后分裝至凍存管中4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?H9粉劑及抗生素混合液，美國(guó)Bection Dickinson公司提供。

1.1.5 實(shí)驗(yàn)室生物安全等級(jí) 廣東國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心結(jié)核病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室為加強(qiáng)型生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室[4]，已在當(dāng)?shù)匦l(wèi)生主管部門備案。結(jié)核分枝桿菌分離、培養(yǎng)、鑒定及菌種保存等實(shí)驗(yàn)活動(dòng)均在加強(qiáng)型生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，所有實(shí)驗(yàn)操作在生物安全柜中進(jìn)行，確保實(shí)驗(yàn)室生物安全。

1.2 方法

1.2.1 樣本來(lái)源 廣州口岸出入境人員中經(jīng)胸部X線檢查或結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)等方法檢出的結(jié)核疑似病例，留取連續(xù)3 d空腹晨痰分別進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)鑒定為結(jié)核分枝桿菌的菌株納入菌種庫(kù)進(jìn)行保存。

1.2.2 樣本檢測(cè) 痰標(biāo)本經(jīng)N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH充分消化處理，所獲得沉渣分別進(jìn)行集菌涂片及金胺O染色，接種羅氏培養(yǎng)基、MGIT培養(yǎng)管各1支置于恒溫培養(yǎng)箱及BACTECTMMGITTM960中進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性樣本進(jìn)行涂片抗酸染色，抗酸染色陽(yáng)性者經(jīng)基因探針核酸雜交法進(jìn)行菌種鑒定，鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群者采用BACTECTMMGITTM960系統(tǒng)液體比例法進(jìn)行一線和(或)二線抗結(jié)核藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 樣本信息采集

1.2.3.1 樣本基礎(chǔ)信息 包括病例的性別、年齡、職業(yè)、文化程度、來(lái)源地區(qū)、人員類別、旅行史、相關(guān)病史、分離時(shí)間、臨床癥狀、臨床治療記錄以及常規(guī)血液生化等檢測(cè)指標(biāo)，錄入樣本管理系統(tǒng)，所有病例的相關(guān)信息收集整理均在收集前獲得知情同意。

1.2.3.2 樣本生物學(xué)信息 包括痰涂片抗酸/金胺O染色結(jié)果、菌落形態(tài)、一線(鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺)及二線(阿米卡星、卷曲霉素、乙硫異煙胺、KAN卡拉霉素、氧氟沙星、對(duì)氨基水楊酸)抗結(jié)核藥物藥敏結(jié)果、利福平耐藥基因rpoB常見(jiàn)耐藥突變、異煙肼耐藥基因katG、inhA常見(jiàn)耐藥突變、MIRU基因分型、Spoligotyping分型等。

1.2.4 樣本制備

1.2.4.1 菌種制備 ①?gòu)? ℃冰箱中取出適當(dāng)數(shù)量的菌種保存管(每株菌分別保存3～4支)，室溫平衡，打印二維碼粘貼備用。②取經(jīng)鑒定的結(jié)核分枝桿菌菌種重新轉(zhuǎn)種至新的MGIT培養(yǎng)管中培養(yǎng)至報(bào)告陽(yáng)性，肉眼觀察培養(yǎng)基背景澄清，結(jié)核桿菌呈顆粒狀分布，即可進(jìn)行菌種保存。③取MGIT培養(yǎng)管置于渦旋震蕩儀震蕩30～60 s，3 000 r/min離心5 min，棄上清，剩余約1 mL菌懸液充分混勻后平均分裝至準(zhǔn)備好的菌種保存液中。④制備好的菌種保存管掃描二維碼錄入樣本管理系統(tǒng)，放入-80℃冰箱指定位置長(zhǎng)期保存[3]。

1.2.4.2 DNA制備 混勻MGIT培養(yǎng)管中的菌液，吸取1 mL于1.5 mL離心管中，13 000 r/min離心15 min，棄上清，加入100 μL分子生物級(jí)滅菌水重懸；上述制備好的菌液置于95 ℃水浴中滅活20 min，移入超聲振蕩儀中作用15 min后，15 000 r/min離心5 min，吸出上清液，即為所提取的DNA，每支20 μL分裝至3～5支0.5 mL離心管中保存。

1.2.5 樣本的標(biāo)識(shí)與儲(chǔ)存

1.2.5.1 樣本編號(hào)標(biāo)識(shí) 登錄FreezerPro生物樣本庫(kù)管理軟件，通過(guò)樣本號(hào)自動(dòng)生成樣本標(biāo)識(shí)條碼。

1.2.5.2 樣本儲(chǔ)存 樣本儲(chǔ)存按樣本種類、分離時(shí)間等分區(qū)儲(chǔ)存于-80 ℃超低溫冰箱中，冰箱溫度實(shí)時(shí)監(jiān)控。

1.2.6 質(zhì)量控制

1.2.6.1 菌種純度檢測(cè) 在FreezerPro軟件中將待抽檢菌種出庫(kù)，從冰箱中取出目標(biāo)菌種，置37 ℃水浴中快速解凍后充分混勻，將菌液用接種環(huán)無(wú)菌接種于血平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，血平板連續(xù)培養(yǎng)72 h觀察有無(wú)雜菌生長(zhǎng)。

1.2.6.2 菌種活力檢測(cè) 移液器吸取100 μL上述菌懸液接種于中性羅氏培養(yǎng)基，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，定期觀察羅氏培養(yǎng)基，記錄出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)菌落的時(shí)間及菌落形態(tài)。

1.2.6.3 菌種特性檢測(cè) 取1.2.6.2所培養(yǎng)的菌落，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)或耐藥基因突變檢測(cè)，與既往檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，是否保持原有特性。

1.2.6.4 DNA質(zhì)量檢測(cè) 通過(guò)核酸蛋白分析儀檢測(cè)所保存DNA的濃度。

1.2.6.5 質(zhì)控頻次 菌種抽檢均以5%的比例按照隨機(jī)抽樣的方式每年抽取前一年保存的菌種進(jìn)行純度、活力及特性的檢測(cè)；DNA抽檢以5%的比例按照隨機(jī)抽樣的方法每年抽取前一年保存的DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 菌種庫(kù)管理 樣本管理軟件由專人進(jìn)行設(shè)置維護(hù)，定期升級(jí)更新；樣本入庫(kù)后由專人進(jìn)行相關(guān)資料收集整理，并導(dǎo)入系統(tǒng)；樣本出庫(kù)需經(jīng)負(fù)責(zé)人審批，樣本出庫(kù)后從使用到廢棄全過(guò)程需詳細(xì)記錄，確保每份樣本流向清晰，保持管理系統(tǒng)數(shù)據(jù)與實(shí)物庫(kù)一致；樣本庫(kù)保管采用雙人雙鎖，確保樣本安全；樣本儲(chǔ)存超低溫冰箱溫度進(jìn)行時(shí)實(shí)監(jiān)控，確保樣本質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)識(shí)及保存

2.1.1 菌種及DNA標(biāo)識(shí) 樣本標(biāo)識(shí)采用四級(jí)編號(hào)，包括超低溫冰箱、凍存架、凍存盒及凍存盒內(nèi)位置等相關(guān)信息，對(duì)應(yīng)生成每株菌的唯一性二維碼標(biāo)識(shí)及唯一樣本編號(hào)(圖1)，菌種與其DNA的編號(hào)相對(duì)應(yīng)，多管相同的樣本通過(guò)分管號(hào)進(jìn)行區(qū)分。通過(guò)二維碼可追溯樣本的所有信息資源。所采用條碼標(biāo)簽為專用耐低溫條碼，耐酸堿、防水、防油污且粘貼牢固不脫落。

圖1 樣本二維碼及編號(hào)

2.1.2 保存位置 菌種與DNA分開存放于-80 ℃冰箱不同儲(chǔ)存室中；按分離時(shí)間不同分列于不同凍存架中，每個(gè)凍存架包含若干凍存盒，樣本則按編號(hào)順序存放于相應(yīng)凍存盒中。

2.2 菌種庫(kù)構(gòu)成 截至2017年12月，結(jié)核分枝桿菌菌種庫(kù)庫(kù)存結(jié)核分枝桿菌863株，每株菌含保存菌種3～4支，每支800 μL，含保存DNA 3～5支，每支20 μL。菌種庫(kù)菌種來(lái)源構(gòu)成及菌種生物學(xué)特性分別見(jiàn)表1，表2。

2.3 菌種庫(kù)質(zhì)量抽檢 通過(guò)對(duì)菌種庫(kù)庫(kù)存菌種進(jìn)行抽檢，總體菌種保存狀態(tài)良好，生物學(xué)特性穩(wěn)定，對(duì)2株檢出的雜菌污染菌及非結(jié)核分枝桿菌混雜菌進(jìn)行了剔除、廢棄。

表1 菌種庫(kù)菌種構(gòu)成(n=863)

表2 菌種庫(kù)菌種生物學(xué)特性(n=863)

3 討論

我國(guó)生物樣本庫(kù)的收集最早開始于20世紀(jì)70年代，但早期的樣本收集存在無(wú)序、分散、封閉、缺乏標(biāo)準(zhǔn)化流程、缺乏質(zhì)控體系與信息化管理、臨床資料殘缺不全(尤其是治療與隨訪資料)、倫理學(xué)與相關(guān)法律不健全等問(wèn)題,導(dǎo)致其所能發(fā)揮的作用非常有限[5]。進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，國(guó)內(nèi)生物樣本庫(kù)建設(shè)逐漸步入正軌，憑借著人口基數(shù)大、病例資源豐富等優(yōu)勢(shì)，逐步建成一批有代表性的生物樣本庫(kù)，包括中山大學(xué)腫瘤防治中心腫瘤資源庫(kù)、天津協(xié)和干細(xì)胞庫(kù)、北京市乙型病毒性肝炎/艾滋病樣本庫(kù)等[5]。同時(shí)，生物樣本庫(kù)建立與運(yùn)行的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)體系也在逐步形成，2011年，由中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)發(fā)布了《生物樣本庫(kù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[6]，并推行生物樣本庫(kù)的質(zhì)量監(jiān)督檢查，促進(jìn)了數(shù)據(jù)的可靠性、提高了樣本的使用率，不斷推動(dòng)了基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)展[7]。

菌種庫(kù)作為生物樣本庫(kù)的一個(gè)重要部分，對(duì)于研究病原體的分子流行病學(xué)特征、遺傳及變異規(guī)律、疾病爆發(fā)的傳染源追溯、耐藥突變機(jī)制研究、診斷試劑及疫苗研發(fā)等具有重要意義，但國(guó)內(nèi)有關(guān)結(jié)核分枝桿菌菌種庫(kù)的文獻(xiàn)報(bào)道并不多見(jiàn)，劉志輝等[8-9]、柳正衛(wèi)和丁北川[10]在分枝桿菌菌種庫(kù)的系統(tǒng)建設(shè)方面進(jìn)行了有意義的探討，但國(guó)內(nèi)分枝桿菌菌株庫(kù)建設(shè)依然存在菌株收集盲目、菌株資料局限和保存方法單一等問(wèn)題[11]。

國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道主要有2個(gè)結(jié)核分枝桿菌菌種庫(kù)，分別是：①TDR-TB結(jié)核分枝桿菌菌種庫(kù)(TDR-TB Strain Bank)，由世界范圍內(nèi)多家實(shí)驗(yàn)室共同創(chuàng)立，報(bào)道庫(kù)存耐藥結(jié)核菌種229株，來(lái)源于世界范圍內(nèi)31個(gè)國(guó)家和地區(qū)，主要應(yīng)用于結(jié)核桿菌耐藥機(jī)制研究、結(jié)核及耐藥結(jié)核診斷試劑研發(fā)及跨國(guó)結(jié)核參比實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證項(xiàng)目[12]。②FIND結(jié)核分枝桿菌菌種庫(kù)(FIND Tuberculosis Strain Bank)，由FIND基金會(huì)創(chuàng)建，主要收集耐藥結(jié)核菌株(包括單一耐藥、耐多藥、廣泛耐藥)，所有庫(kù)存菌種包含完整的感染者信息及菌種的生物學(xué)信息，主要應(yīng)用于耐藥結(jié)核耐藥機(jī)制及新的診斷技術(shù)方法研究[13]。

本實(shí)驗(yàn)室主要承擔(dān)廣東口岸出入境人員結(jié)核病疑似患者的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作，病例來(lái)源包括全國(guó)各地的出境人員及來(lái)自非洲、東南亞等近20余個(gè)國(guó)家和地區(qū)的入境人員，病例地域分布廣泛，所感染結(jié)核分枝桿菌菌種生物學(xué)資源豐富，相比國(guó)內(nèi)的菌種庫(kù)有其獨(dú)特之處。鑒于日?？蒲泄ぷ髦兴庥龅臉颖玖餍胁W(xué)資料、臨床資料不全，樣本生物信息資料缺乏，使研究無(wú)法深入的窘?jīng)r，吳玲等[14]在對(duì)廣州市胸科醫(yī)院庫(kù)存的廣州地區(qū)15 854株分枝桿菌菌種的資源組成進(jìn)行了系統(tǒng)的分析后，也報(bào)道約1/4保藏菌株的患者信息資料不完整。因此，我們著力將菌種庫(kù)的菌種資源信息建設(shè)作為工作的首要任務(wù)，收集整理詳細(xì)的宿主流行病學(xué)資料、臨床資料及菌種生物學(xué)特征信息資料，利用實(shí)驗(yàn)室生物樣本智能管理系統(tǒng)(RuRo FreezerPro)對(duì)樣本資料信息進(jìn)行系統(tǒng)的分類管理，使信息數(shù)據(jù)的錄入、查詢及管理高效而便捷。但比較而言，國(guó)外菌種庫(kù)[12-13]包含了更為詳盡的菌種生物學(xué)特征信息：包括rpoB、katGinhA、embB、rpsL、rrs、gyrA等耐藥基因序列分析，基因分型甚至全基因組序列等，給菌種庫(kù)未來(lái)的使用帶來(lái)了極大的便利，也節(jié)省了重復(fù)檢測(cè)的成本。

經(jīng)過(guò)近十年的建設(shè)，本菌種庫(kù)目前已累計(jì)保存結(jié)核分枝桿菌菌種863株，數(shù)量還在不斷增加。除結(jié)核分枝桿菌臨床分離株外，本菌種庫(kù)還保存了標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核分枝桿菌菌株：H37Ra(ATCC 25177)1株，參加世界衛(wèi)生組織跨國(guó)結(jié)核實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感試驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證樣本30株，參加中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室抗結(jié)核藥物敏感性試驗(yàn)熟練度測(cè)試項(xiàng)目樣本120株。與TDR-TB菌種庫(kù)和FIND菌種庫(kù)所不同的是，這2個(gè)菌種庫(kù)側(cè)重于提供不同生物學(xué)特性的標(biāo)準(zhǔn)化菌株，關(guān)注菌種的純度及長(zhǎng)期研究的穩(wěn)定性，因而所保存的菌種均來(lái)源同一個(gè)單一克隆，不一定能夠反應(yīng)其對(duì)應(yīng)宿主體內(nèi)結(jié)核種群的所有特征[12]，本菌種庫(kù)所保存的是宿主體內(nèi)完整的結(jié)核桿菌種群。

在菌種庫(kù)的保存樣本種類方面，本菌種庫(kù)除保存分枝桿菌菌種外，還保存了菌種DNA樣本，可直接用于核酸水平的研究工作，并保存了宿主部分血液檢測(cè)結(jié)果，在菌種庫(kù)的不斷建設(shè)中還可嘗試同時(shí)保存宿主的血液或者尿液樣本。TDR-TB菌種庫(kù)同時(shí)配套建立了TDR-TB樣本庫(kù)[15]，主要收集結(jié)核組及具有相同臨床癥候群的非結(jié)核組對(duì)照病例的痰液、尿液、血液等各類樣本；FIND菌種庫(kù)也保存了同時(shí)采集的患者痰液、血液、尿液或唾液樣本[13]，這對(duì)于結(jié)核特定領(lǐng)域的深入研究具有重要意義。

本菌種庫(kù)的使用主要用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的科研工作，包括結(jié)核快速診斷試劑研究、耐藥結(jié)核耐藥突變基因篩查、結(jié)核桿菌全基因組測(cè)序等。菌種生物學(xué)信息的獲得也是建立在菌種庫(kù)的基礎(chǔ)之上，所獲得的結(jié)果又同時(shí)成為樣本庫(kù)資源的重要組成部分，兩者相輔相成。TDR-TB庫(kù)[12，15]免費(fèi)為申請(qǐng)機(jī)構(gòu)提供用于包括抗體檢測(cè)、核酸檢測(cè)、結(jié)核抗原靶標(biāo)、蛋白質(zhì)組學(xué)等研究領(lǐng)域的菌種，并已取得顯著成果，包括進(jìn)入臨床應(yīng)用的Xpert MTB/RIF，Cephid檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)等，充分體現(xiàn)了菌種庫(kù)的研究?jī)r(jià)值，實(shí)現(xiàn)了資源共享，其運(yùn)作模式值得國(guó)內(nèi)借鑒。

隨著菌種保藏質(zhì)量的不斷提高，數(shù)量的不斷增加，樣本的資源信息不斷豐富完善，將菌種庫(kù)逐步建設(shè)成為樣本管理系統(tǒng)化、規(guī)范化，樣本種類多樣化的結(jié)核分枝桿菌生物樣本庫(kù)，在滿足自身科研工作的同時(shí)，還可將樣本提供給出入境口岸、甚至結(jié)核病防控系統(tǒng)其他實(shí)驗(yàn)室開展相關(guān)科學(xué)研究，共同促進(jìn)結(jié)核研究領(lǐng)域的不斷進(jìn)步。