劉莉，李金麗，鄧小艷，肖慶，吳春林，胡雅君

肥胖是由于多種原因引發(fā)的體內(nèi)脂肪含量過多而產(chǎn)生的一種臨床常見代謝性疾病，目前肥胖癥已嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)肥胖患者血清中炎性因子表達(dá)水平明顯升高并可促使脂肪組織產(chǎn)生炎性反應(yīng)，同時高表達(dá)的炎性因子又可參與胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路進(jìn)而造成胰島素抵抗[2]。育齡女性過度肥胖導(dǎo)致不孕、流產(chǎn)及妊娠并發(fā)癥發(fā)生率明顯增加，近來研究發(fā)現(xiàn)女性卵泡發(fā)育、排卵等主要依賴于性激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，而性激素主要通過脂肪組織進(jìn)行分泌及代謝[3]。由此推測過度肥胖引發(fā)的脂肪組織炎性反應(yīng)可能影響卵泡發(fā)育，深入研究可為肥胖婦女生殖治療方案的制定提供理論依據(jù)。胰島素生長因子(insulin like growth factor-1，IGF-1)在人體內(nèi)水平過度升高可通過促使卵泡閉鎖、凋亡進(jìn)而降低卵巢功能[4]。同時IGF-1水平升高還可通過促使胰島素受體底物表達(dá)進(jìn)而激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路，研究發(fā)現(xiàn)多囊卵巢綜合征患者血清IGF-1水平升高并可通過激活PI3K/Akt信號通路進(jìn)而參與多囊卵巢綜合征發(fā)生過程[5]。關(guān)于IGF-1/PI3K/Akt信號通路與肥胖及卵泡發(fā)育的關(guān)系尚未闡明，因此，本研究通過構(gòu)建高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠模型檢測卵泡發(fā)育相關(guān)激素水平，初步探討其對IGF-1/PI3K/Akt信號通路的影響，為降低肥胖育齡女性卵泡發(fā)育異常所致的不孕不育發(fā)生率及提高輔助生殖治療效果提供一定依據(jù)，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 8周齡清潔級雌性SD大鼠20只，體質(zhì)量180～270 g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗動物中心提供，分籠喂養(yǎng)且正常飲水?dāng)z食，培養(yǎng)條件為室溫22～25℃，濕度70%。動物許可證號：SCXK(鄂)2017-0008，動物合格證書編號No.42000600007275，實(shí)驗動物設(shè)施使用證編號No.00133206。該實(shí)驗于2017年1月—2018年1月在武漢市第一醫(yī)院中心實(shí)驗室進(jìn)行，并獲得武漢市第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 性激素卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone, LH)、雌激素(estrogen, E2)、催乳素(prolactin，PRL)、睪酮(testosterone,T)放射免疫分析試劑均購自天津協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司；白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢驗試劑盒與三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-C，LDL-C)、總膽固醇(total cholesterol，TC)檢測試劑盒均購自上海博谷生物科技有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)、過氧化氫酶(catalase,CAT)檢測試劑盒均購自南京建成生物研究所；兔抗鼠PI3K及其磷酸化p-PI3K、Akt及其磷酸化p-Akt單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗鼠IGF-1單克隆抗體購自福州邁新公司；HPR標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自上海生物工程股份有限公司。核酸蛋白測定儀購自普泰生物技術(shù)公司；石蠟切片機(jī)購自湖北貝諾醫(yī)療科技有限公司；G9800全自動生化儀購自北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司；DMLS2光學(xué)顯微鏡購自北京普瑞賽司儀器有限公司；SN-697B型智能放射免疫γ測量儀購自上海核所日環(huán)光電儀器有限公司。

1.3 建模與分組 20只雌性SD大鼠均進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按照隨機(jī)數(shù)字表法選取10只作為正常飲食組，其余10只大鼠均參照張靚等[6]研究方法進(jìn)行高脂喂養(yǎng)，喂養(yǎng)10周，大鼠體質(zhì)量超過正常飲食組20%視為肥胖大鼠模型建模成功[7]。將建模成功的10只大鼠作為高脂飲食組，正常飲食組與高脂飲食組SD大鼠均繼續(xù)喂養(yǎng)1周后檢測各項指標(biāo)。

1.4 動物麻醉及取材 2組大鼠禁食過夜，次日清晨采用1 ml利多卡因?qū)嵤└骨宦樽?，分別摘除大鼠眼球后靜脈叢取血，采集血液樣本，置于離心機(jī)內(nèi)(3 000 r/min轉(zhuǎn)速)離心20 min，收集上層血清，置于-80℃超低溫冰箱保存待測。取血后斷頸處死大鼠，并摘取卵巢，在無菌水中清洗3次，每組選取5只大鼠卵巢采用福爾馬林固定取出包埋于石蠟中。另選取5只大鼠卵巢剪碎后放入勻漿器，在冰盒中勻漿，并將勻漿液分裝到2.0 ml EP管中，剩余的卵巢組織凍存在-200℃的液氮中備用。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 大鼠卵巢組織病理觀察: 取石蠟包埋卵巢組織，采用石蠟切片機(jī)切片，厚度約為6 μm，蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，100倍顯微鏡下觀察大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化，每組標(biāo)本隨機(jī)選取5個視野，計算卵泡總數(shù)、成熟卵泡總數(shù)、黃體總數(shù)等。

1.5.2 血脂水平檢測:取采集的血液標(biāo)本，應(yīng)用全自動生化分析儀檢測2組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5.3 卵泡發(fā)育相關(guān)激素水平檢測: 取采集的血液標(biāo)本，采用放射免疫法檢測血清卵泡發(fā)育相關(guān)激素水平，應(yīng)用放射免疫計數(shù)器檢測大鼠血清中FSH、 E2、P、PRL、LH、T水平。

1.5.4 血清炎性因子檢測： 取采集的血液標(biāo)本，采用ELISA法檢測血清炎性因子IL-6、TNF-α、CRP水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.5.5 卵巢組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測:取20 mg卵巢組織，加入生理鹽水并研磨成組織勻漿，生理鹽水和勻漿液以10∶1混合，置于離心半徑為10 cm離心機(jī)內(nèi)以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，吸取上清液，參照SOD、MDA、ACP、CAT檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.5.6 蛋白免疫印跡法(Western-blot)檢測卵巢組織IGF-1/Akt通路相關(guān)蛋白:取100 mg大鼠卵巢組織，加入RTPA蛋白裂解液，采用BCA法測定蛋白濃度，取20 μg總蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，之后移至PDVF膜，5%脫脂奶粉封閉，2 h后加入IGF-1/Akt通路相關(guān)蛋白一抗，稀釋比均為1∶1000，4℃孵育過夜，次日加入二抗(稀釋比1∶10 000)，室溫孵育1 h后采用ECL法進(jìn)行顯影，放入凝膠分析系統(tǒng)觀察各蛋白條帶并采用Quantity One圖像分析系統(tǒng)對各條帶進(jìn)行光密度分析，各蛋白均以β-actin為內(nèi)參基因，目的蛋白與內(nèi)參條帶積分光密度值的比值即蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 2組大鼠卵巢病理變化及卵泡、黃體變化比較 HE染色結(jié)果顯示，正常飲食組大鼠卵泡正常發(fā)育且內(nèi)含豐富的顆粒細(xì)胞，周圍含有原始卵泡與優(yōu)勢卵泡，黃體結(jié)構(gòu)正常；高脂飲食組大鼠卵泡發(fā)育不正常且內(nèi)含的顆粒細(xì)胞排列松散，同時向腔內(nèi)塌陷且無明顯卵泡腔結(jié)構(gòu)，含有不良黃體且呈彌漫性篩網(wǎng)狀及微囊狀結(jié)構(gòu)，同時黃素化顆粒細(xì)胞減少，圖1見封3。與正常飲食組相比，高脂飲食組大鼠發(fā)育不良卵泡比率顯著升高(P<0.05)，見表1。高脂飲食組黃體總數(shù)17個，異常10個(58.52%)，正常飲食組黃體總數(shù)20個，無異常黃體。

表1 2組大鼠卵泡及黃體變化比較 [例(%)]

2.2 2組大鼠體質(zhì)量及血脂水平變化比較 與正常飲食組相比，高脂飲食組大鼠體質(zhì)量、TC、TG、LDL-C水平均顯著升高(P<0.01)，見表2。

2.3 2組大鼠卵泡發(fā)育相關(guān)激素水平比較 與正常飲食組相比，高脂飲食組大鼠E2、P、FSH、LH、PRL水平均顯著降低(P<0.01)，T水平顯著升高(P<0.01)，見表3。

2.4 2組SD大鼠血清炎性因子及卵巢組織中氧化應(yīng)激水平比較 與正常飲食組相比，高脂飲食組大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α、CRP水平均顯著升高(P<0.01)，卵巢組織中MDA、ACP水平均顯著升高(P<0.01)，SOD、CAT水平均顯著降低(P<0.01)，見表4。

2.5 2組大鼠IGF-1/Akt通路蛋白表達(dá)比較 與正常飲食組相比，高脂飲食組大鼠IGF-1、p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，而Akt、PI3K蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2、表5。

表2 2組大鼠體質(zhì)量及血脂水平變化

圖2 2組大鼠IGF-1/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討 論

女性過度肥胖可引發(fā)不孕癥、月經(jīng)異常、排卵障礙及多囊卵巢綜合征等疾病，同時可增加自然流產(chǎn)及妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病等風(fēng)險，研究顯示肥胖女性新生兒先天性心臟病、神經(jīng)管缺陷等發(fā)生風(fēng)險較高[8]。肥胖患者可能通過胰島素抵抗、慢性炎性反應(yīng)等病理過程影響卵母細(xì)胞發(fā)育及妊娠結(jié)局，但其具體作用機(jī)制尚未完全闡明。因此，探究肥胖對卵泡發(fā)育的影響及其可能作用機(jī)制，為提高肥胖女性輔助生殖治療效果提供依據(jù)。

肥胖是指能量攝入超過能量消耗導(dǎo)致脂肪組織過

度增生，TG、TC等血脂水平升高可引起脂代謝紊亂進(jìn)而產(chǎn)生肥胖[9]。本研究通過高脂飲食誘導(dǎo)構(gòu)建肥胖SD大鼠模型，檢測正常飲食大鼠與肥胖大鼠血脂水平，結(jié)果顯示高脂飲食組大鼠體質(zhì)量、TC、TG、LDL-C水平均明顯高于正常飲食組，提示高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖SD大鼠模型造模成功。HE染色可直接觀察卵巢病理組織改變[10]。本研究切取2組大鼠卵巢與子宮組織，HE染色觀察其病理改變，結(jié)果顯示正常飲食組大鼠卵巢原始卵泡、成熟卵泡較高脂飲食組均明顯增多，高脂飲食組卵泡發(fā)育不良且異常黃體數(shù)目較多，提示肥胖能阻礙SD大鼠生殖細(xì)胞正常發(fā)育并引發(fā)生殖功能失調(diào)。機(jī)體性激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)主要為下丘腦—垂體—卵巢軸(HPOA)，HPOA系統(tǒng)還涉及FSH、LH、E2等激素，激素水平變化直接影響卵泡發(fā)育[11-12]。本研究結(jié)果顯示高脂飲食組大鼠E2、P、PRL、FSH、LH水平均明顯低于正常飲食組，T水平明顯高于正常飲食組，說明E2、P、PRL、FSH、LH、T水平異?？捎绊懧雅莅l(fā)育，分析原因可能為高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠攝入能量過多,引起脂肪細(xì)胞堆積導(dǎo)致血液中T水平升高并抑制HPOA功能,進(jìn)而使肥胖大鼠E2、P、PRL、FSH、LH水平降低。FSH、LH、E2等相關(guān)激素異常表達(dá)可促使HPOA功能紊亂進(jìn)而導(dǎo)致卵泡發(fā)育停止甚至卵泡閉鎖。肥胖還是一種與炎性反應(yīng)相關(guān)的疾病，本研究進(jìn)一步分析高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖對炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，結(jié)果顯示高脂飲食組大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α、CRP水平均明顯高于正常飲食組，高脂飲食組大鼠卵巢組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、ACP水平均明顯高于正常飲食組， SOD、CAT水平均明顯降低。有研究顯示肥胖型多囊卵巢綜合征患者血清中IL-6、TNF-α、CRP水平均明顯升高，其中IL-6作為一種前炎性細(xì)胞因子與胰島素抵抗指數(shù)呈正相關(guān)，IL-6、TNF-α、CRP均與LH、FSH密切相關(guān)[13]。同時肥胖大鼠體內(nèi)炎性反應(yīng)還可促使卵巢組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，MDA、ACP、SOD、CAT異常表達(dá)可反映卵巢組織氧化應(yīng)激水平變化[14-16]。提示高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖可能通過加重大鼠體內(nèi)炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng),干擾HPOA功能進(jìn)而促使FSH、LH、E2等卵泡發(fā)育相關(guān)激素水平異常從而影響卵泡發(fā)育。

表3 2組大鼠卵泡發(fā)育相關(guān)激素水平變化比較

表4 2組大鼠血清炎性因子及卵巢組織中氧化應(yīng)激水平比較

表5 2組大鼠IGF-1/Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)比較

卵巢組織中IGF-1呈高表達(dá)時，通過抑制其表達(dá)可改善HPOA調(diào)節(jié)功能進(jìn)而促使初級卵泡發(fā)育為優(yōu)勢卵泡，同時可通過提高大鼠FSH、LH、E2等激素水平抑制卵巢組織中IGF-1表達(dá)進(jìn)而恢復(fù)大鼠排卵功能[17-18]。IGF-1主要由卵巢、肝臟、脂肪組織合成分泌，研究發(fā)現(xiàn)IGF-1表達(dá)水平升高可促使雄激素過量合成進(jìn)而擾亂HPOA調(diào)節(jié)系統(tǒng)[19]。IGF-1/PI3K/Akt信號通路可參與蛋白質(zhì)合成代謝相關(guān)過程，通過激活該信號通路可對糖尿病骨骼肌發(fā)育發(fā)揮保護(hù)作用[20-22]。PI3K/Akt信號通路對炎性反應(yīng)、腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程均發(fā)揮重要作用，研究顯示多囊卵巢綜合征患者IGF-1表達(dá)水平升高可激活PI3K/Akt信號通路[23]。本研究結(jié)果顯示,高脂飲食組大鼠IGF-1、p-Akt、p-PI3K表達(dá)水平均明顯高于正常飲食組，分析原因可能為肥胖大鼠IGF-1水平過度升高可增加卵巢對黃體生成素的敏感性進(jìn)而促使卵泡閉鎖并抑制優(yōu)勢卵泡發(fā)育，同時IGF-1可通過與胰島素樣生長因子受體結(jié)合并促使胰島素受體底物發(fā)生磷酸化進(jìn)而激活PI3K/Akt信號通路[24]。提示高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖可能抑制優(yōu)勢卵泡發(fā)育，其可能與IGF-1/PI3K/Akt信號通路激活有關(guān)。

綜上所述，高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖可促使SD大鼠卵泡發(fā)育相關(guān)激素水平紊亂進(jìn)而促使卵泡發(fā)育停止，其可能與IGF-1/PI3K/Akt信號通路激活有關(guān)。肥胖女性生殖治療過程中抑制IGF-1水平可能有助于卵泡發(fā)育。但關(guān)于高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖與卵泡發(fā)育其他信號通路及其可能作用機(jī)制均需進(jìn)一步研究。

利益沖突：無