張修萍 徐晗 劉彬

摘要：選擇和檢查方針蛋白有關(guān)的信號(hào)，疏忽別的無關(guān)的信號(hào)，因而能夠完成對(duì)方針蛋白定量的高特異性和高準(zhǔn)確性。

前言：

隨著FDA批準(zhǔn)的新藥數(shù)量減少，醫(yī)藥研發(fā)也經(jīng)歷著生產(chǎn)力的下降。市場力量、需求與競爭使得醫(yī)藥研發(fā)越來越具有挑戰(zhàn)性。對(duì)疾病機(jī)制理解的進(jìn)步表明，可以剖析復(fù)雜和多因素系統(tǒng)，以確定可靠、安全和有效的藥物。

設(shè)計(jì)蛋白-蛋白相互作用的特異性抑制劑可以代替PPI網(wǎng)絡(luò)中高度互聯(lián)節(jié)點(diǎn)的多效抑制劑。這些抑制劑不僅有助于解開互連網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，而且可以提供更廣泛的藥物靶標(biāo)。

一、靶向蛋白質(zhì)組相互作用

小分子調(diào)節(jié)劑

發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)伙伴競爭結(jié)合的小分子是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。設(shè)計(jì)抑制PPI的小分子的一個(gè)難點(diǎn)與應(yīng)該被分子覆蓋的表面的大小有關(guān)，而抑制酶的活性位點(diǎn)一般通過占據(jù)酶的功能腔來實(shí)現(xiàn)。與酶的活性位點(diǎn)或受體的結(jié)合位點(diǎn)相比，PPI通過由蛋白質(zhì)原子埋藏形成的大界面穩(wěn)定，達(dá)到數(shù)千平方埃。除了與表面尺寸競爭的難度之外，PPI界面還代表著多樣化和多方面的結(jié)合位點(diǎn)，在構(gòu)建有效的抑制劑方面構(gòu)成重大挑戰(zhàn)。

尋找小分子PPI抑制劑的第二個(gè)難題在于缺乏用于篩選靶向激動(dòng)劑或拮抗劑的簡單功能測定技術(shù)。在PPI的情況下，必須重新審視高通量篩選（HTS）。已經(jīng)開發(fā)出測量使用反向兩種雜交或BRET的相互作用喪失的高通量蜂窩篩選，并且提供僅選擇細(xì)胞可穿透分子的優(yōu)點(diǎn)。

由于八十年代蛋白質(zhì)結(jié)合界面能量分析的出現(xiàn)，小分子PPI抑制劑得到了持續(xù)有力的發(fā)展。通過丙氨酸掃描技術(shù)探索在發(fā)生結(jié)合時(shí)不同接觸的貢獻(xiàn)。這種技術(shù)表明，界面殘基的一些突變對(duì)兩個(gè)分子的結(jié)合親和力幾乎沒有影響，另一些突變主要是不穩(wěn)定效應(yīng)。在熱點(diǎn)位置相互作用的小分子應(yīng)與同源伴侶的結(jié)合形成競爭，而不必覆蓋整個(gè)相互作用的表面。

作為小分子PPI抑制劑開發(fā)的積極步伐，熱點(diǎn)位置與蛋白質(zhì)多重結(jié)合位點(diǎn)的位置相關(guān)。定義這些位點(diǎn)為蛋白質(zhì)同源家族表面的殘基，它們對(duì)應(yīng)于穩(wěn)定天然蛋白質(zhì)協(xié)助伙伴的相互作用中起著關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)的“粘性區(qū)”，并且易于結(jié)合小分子。最新的研究顯示這些粘性區(qū)域富集了抑制劑結(jié)合能，為合理選擇結(jié)合分子開拓了新的思路。

在較大的蛋白蛋白界面中，熱點(diǎn)可以在界面上分布得更多，其間距相當(dāng)大。它們涵蓋了更復(fù)雜的化學(xué)功能組合，增加了發(fā)現(xiàn)所有熱點(diǎn)抑制劑的難度。PPI抑制劑顯示出比傳統(tǒng)藥物更大的尺寸和分子量。PPI抑制劑也更具疏水性，它們含有更多數(shù)量的氫鍵和至少四個(gè)環(huán)。這種與經(jīng)典特征的偏離指出了組合專用于PPI篩選的分子庫的必要性，其含有比傳統(tǒng)藥物設(shè)計(jì)的化合物庫更高的化學(xué)多樣性和更大的復(fù)雜性。對(duì)天然產(chǎn)物的進(jìn)一步探索通常應(yīng)該有助于多樣化和補(bǔ)充這類化合物。用于搜索PPI抑制劑的計(jì)算工具也與實(shí)驗(yàn)篩選相結(jié)合，以加速篩選和降低成本。

化合物庫組合的另一種方法稱作“片段方法”。它不是選擇分子量相對(duì)較高的起始分子，而是對(duì)一個(gè)伙伴進(jìn)行一組簡單的低親和力小分子片段搜索，并通過基于結(jié)構(gòu)的策略逐步建立抑制劑。對(duì)于該策略，結(jié)合熱點(diǎn)的確定對(duì)于定義分子可以有效結(jié)合與同源伙伴競爭的關(guān)鍵位置特別有用。在前期的篩選中采用X射線或NMR技術(shù)直接進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的篩選取得成功?？梢曰谄浣Y(jié)合位點(diǎn)直接選擇起始分子。即使起始化合物的親合力落在毫摩爾范圍內(nèi)，通過擴(kuò)大分子大小同時(shí)優(yōu)化結(jié)合親和力來優(yōu)化已經(jīng)足夠。也可以使用晶體接觸來找到新的結(jié)合位點(diǎn)，并通過連接片段增加分子的大小。選擇第一個(gè)片段的另一個(gè)成功的策略是通過SS鍵在接近靶向PPI相互作用的位置上束縛分子。在該策略中，靶標(biāo)和初始片段化合物之間共價(jià)鍵的存在有助于獲得復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。

蛋白調(diào)節(jié)劑：

在這一領(lǐng)域計(jì)算方法也做出了重大貢獻(xiàn)。建模和設(shè)計(jì)工具，如Rosetta已經(jīng)達(dá)到了足夠的準(zhǔn)確性以便能夠指導(dǎo)結(jié)合劑的合理設(shè)計(jì)。將合理的設(shè)計(jì)策略與最先進(jìn)的顯示技術(shù)相結(jié)合，為結(jié)合劑類的多樣化打開了很大的視角。計(jì)算方法也可用于設(shè)計(jì)降低蛋白的免疫原性。設(shè)計(jì)用于抑制PPI的天然、工程或人造抗體通常被認(rèn)為與同源伙伴競爭;但在少數(shù)情況下，他們也通過變構(gòu)機(jī)制發(fā)揮效應(yīng)。然而，由于蛋白質(zhì)構(gòu)象的微妙變化，后一種效應(yīng)機(jī)制難以合理化或預(yù)測。最后，選擇用于緊密結(jié)合靶標(biāo)的抗體、納米抗體和其他蛋白質(zhì)的主要限制仍然是這些蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的困難。它們的應(yīng)用主要限于細(xì)胞外靶標(biāo)。

肽和肽擬似物：

肽是足夠大的天然化合物，可能阻礙PPI相互作用和命中幾個(gè)熱點(diǎn)。然而，靶向細(xì)胞內(nèi)PPI時(shí)，肽抑制劑必須跨過細(xì)胞膜。目前細(xì)胞穿透肽（CPPs）方面取得了重大進(jìn)展，這為細(xì)胞內(nèi)肽樣藥物的發(fā)展帶來了顯著進(jìn)步。特定肽序列穿透細(xì)胞的能力首先在神經(jīng)遞質(zhì)和病毒蛋白的小蛋白中發(fā)現(xiàn)。然后深入研究滲透機(jī)制，突出顯示各種機(jī)制，具體取決于仍在研究中的CPP類型。進(jìn)入細(xì)胞涉及內(nèi)吞吸收，但也可直接穿越膜。

二、靶向蛋白質(zhì)組技能：

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的直接執(zhí)行者，生物學(xué)研討離不開剖析蛋白質(zhì)的構(gòu)成及含量改變。如今研討樣本中蛋白質(zhì)的含量都是直接辦法：

1.根據(jù)抗體的檢查辦法，如Western blotting、ELISA。這些辦法的可靠性、靈敏度十分依賴于抗體的質(zhì)量。對(duì)那些沒有商業(yè)化的抗體的蛋白而言，無法用這些辦法剖析蛋白含量改變。

2.經(jīng)過基因表達(dá)的改變預(yù)測蛋白質(zhì)含量改變，可是mRNA和蛋白含量之間有關(guān)性并不強(qiáng)，致使成果經(jīng)常出現(xiàn)偏差。那么，有沒有一種辦法無需經(jīng)過抗體、或許轉(zhuǎn)錄水平這些直接的辦法，而是能夠之間剖析樣品中的含量呢？答案是必定的，這種辦法即是咱們要介紹的蛋白質(zhì)組技能。依照試驗(yàn)意圖能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)組技能分為兩大類：高通量蛋白質(zhì)組學(xué)和靶向蛋白質(zhì)組學(xué)，別離用于前期的區(qū)別蛋白挑選以及后續(xù)的方針蛋白驗(yàn)證。例如關(guān)于臨床Biomarker的挑選，通常是首先應(yīng)從有限數(shù)意圖臨床樣本中運(yùn)用高通量的辦法挑選出區(qū)別的方針蛋白，然后運(yùn)用靶向蛋白組技能關(guān)于方針蛋白進(jìn)行擴(kuò)展樣本的驗(yàn)證

靶向蛋白質(zhì)組技能首要包含SRM/MRM和PRM兩種辦法。SRM/MRM （Selected/ Multiple reaction monitoring）運(yùn)用的是三重四級(jí)桿的質(zhì)譜，使用四級(jí)桿高選擇性的特色對(duì)母離子和子離子依次進(jìn)行分選，該技能在2012年的在Nature Methods中有具體的總結(jié)論說1，并被評(píng)為年度技能（Method of the Year 2012），可見其重要意義和使用價(jià)值。在SRM/MRM的基礎(chǔ)上，2012年晚些時(shí)候，在MCP上報(bào)導(dǎo)了新式的靶向蛋白組技能——PRM（Parallel reaction monitoring）技能2，該技能聯(lián)系了四級(jí)桿的高選擇性以及Orbitrap的高分辯、高精度特性，能夠?qū)Χ?jí)圖譜進(jìn)行獨(dú)立的判定，辦法流程愈加快捷。與傳統(tǒng)的SRM/MRM對(duì)比，PRM在雜亂布景下具有更優(yōu)異的抗干擾才能和檢查靈敏度。因而，PRM是更具優(yōu)勢和潛力的新式靶向蛋白質(zhì)組檢查辦法，堪稱SRM/MRM的升級(jí)版。

總結(jié)：

考慮到尋找PPI抑制劑，需要擴(kuò)大化學(xué)空間以有效篩選小分子，并且應(yīng)該優(yōu)先聚集專門的化合物庫，也可以選擇核酸適配子結(jié)合蛋白質(zhì)表面并抑制蛋白質(zhì)相互作用。設(shè)計(jì)廣泛的肽模擬物的開發(fā)工作仍在進(jìn)行中，應(yīng)增加有助于靶向PPI的分子化學(xué)空間，這種分子的主要障礙可能是免疫反應(yīng)。最后，如果干擾PPI的研究不斷取得進(jìn)展，那么能夠恢復(fù)由致病突變引起的PPI損失的分子仍然限于特殊情況。這種分子在開發(fā)遺傳性疾病中的新藥物將是非常有意義的，這可能是該領(lǐng)域即將到來的重要挑戰(zhàn)。