喬波 嚴(yán)平 樂漢橋 張健

摘要：為了解奶牛免疫A19疫苗和S2疫苗后的抗體消長規(guī)律，比較目前地市級實(shí)驗(yàn)室常用的3種血清學(xué)檢測方法的效果，研究分別按廠家說明書對分別對60頭試驗(yàn)?zāi)膛＿M(jìn)行免疫，使用虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）和競爭ELISA（cElisa）對免疫前1d至免疫后260d的血清樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果：2組奶牛血清樣品經(jīng)RBT、SAT、cELISA檢測，抗體在28d達(dá)到峰值，且在21～56d保持較高水平，A19疫苗組260d仍未全部轉(zhuǎn)陰，S2疫苗組在免疫后140d已全部轉(zhuǎn)陰。A19疫苗的陽轉(zhuǎn)率明顯高于S2疫苗組并且抗體持續(xù)時間更長。

關(guān)鍵詞：布魯氏菌病;奶牛;A19和S2疫苗;血清學(xué)檢測

中圖分類號：S855.12

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.12.001

0引言

布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌引起的人獸共患傳染病，病原是革蘭氏陰性菌、兼性胞內(nèi)寄生菌[1]。該病以公畜睪丸炎、母畜流產(chǎn)、產(chǎn)奶量下降等為主要癥狀[2]。布魯氏菌進(jìn)人機(jī)體被巨噬細(xì)胞吞噬，會有10%以上的細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)定植。該菌根據(jù)形態(tài)差異分為粗糙型（rough，R）和光滑型（smooth，S）2種，光滑型具有完整的外膜結(jié)構(gòu)，能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）中的O-側(cè)鏈的抗體，粗糙型布魯氏菌沒有O-側(cè)鏈抗原[3]。常用的血清學(xué)檢測方法中虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）是以布魯氏菌細(xì)胞壁脂多糖上的O鏈抗原作為診斷位點(diǎn)，試管凝集試驗(yàn)（SAT）抗原檢測光滑脂多糖抗體（S-LPS），ELISA方法主要以光滑型布魯氏菌脂多糖抗原檢測布魯氏菌抗體[4-6]。

我國常用的布病疫苗包括牛種布魯氏菌A19疫苗、豬種S2疫苗、羊種M5疫苗，均為光滑型[7]?，F(xiàn)有的血清學(xué)檢測方法無法區(qū)分野毒株和疫苗株。目前河南省用于奶牛布魯氏菌防控的疫苗為A19株和S2株，這2種疫苗分別通過皮下注射和口服2種方式[8]。研究使用3種常用血清學(xué)檢測方法對A19和S22種疫苗免疫后的抗體消長規(guī)律進(jìn)行檢測，結(jié)合本地實(shí)際探究合適的疫苗和檢測方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1疫苗

布魯氏菌病A19株活疫苗，金宇保靈生物藥品有限公司，疫苗批號17942005;布魯氏菌病S2株活疫苗，新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司，疫苗批號2017021。

1.1.2試劑

布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原及陰陽性血清，試管凝集抗原及陰陽性血清購自中國獸藥監(jiān)察所;cELISA試劑盒購自武漢科前公司。

1.1.3主要儀器

布病疫苗全封閉連續(xù)投藥器（鄭州靈格公司）;酶標(biāo)儀（TECANSUNRISE），瑞士TECAN公司產(chǎn)品;洗板機(jī)（ELx50），美國Bio一Tek公司產(chǎn)品。

1.1.4試驗(yàn)動物

某養(yǎng)殖企業(yè)飼養(yǎng)，免疫前間隔2周連續(xù)采血3次，經(jīng)虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和cELISA檢測陰性且經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查無布魯氏菌病感染史的66頭0.5～2歲的奶牛。試驗(yàn)地點(diǎn)選在隔離圈進(jìn)行，試驗(yàn)牛群與其他畜群無直接接觸。1.2方法

（1）試驗(yàn)牛隨機(jī)分組。見表1。

（2）免疫方法。將布病活疫苗A19株和S2株按照說明書所標(biāo)注的含菌數(shù)量，用生理鹽水稀釋。皮下注射組奶牛（A19組）用連續(xù)注射器按1mL/頭份注射布魯氏菌A19疫苗，A19對照組皮下注射1mL/頭生理鹽水;口服組奶牛（S2組）用改裝的連續(xù)注射器按2mL/頭灌服布魯氏菌S2疫苗，S2對照組灌服2mL/頭生理鹽水。

（3）安全性檢測。A19和S2疫苗免疫后7d觀察并記錄奶牛發(fā)熱、呼吸、食欲等狀況。

（4）分別于免疫前1d和免疫后5、7、14、21、28、

56、84、112、140、168、196、224、260d采集試驗(yàn)組和對照組共924份血清，冷凍保存。

（5）虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)按照GB/T18646-2018進(jìn)行;cELISA按照試劑盒說明進(jìn)行。

2結(jié)果

2.1疫苗安全性

疫苗免疫后，A19疫苗組30頭奶牛中有5頭出現(xiàn)發(fā)熱、食欲減退，經(jīng)1～3d均恢復(fù)正常，未見其他癥狀;S2疫苗組未見異常。

2.2轉(zhuǎn)陽率檢測情況

對采集的奶牛血清樣品，采用RBT、SAT和cELISA檢測，對照組均為陰性。A19疫苗組與S2疫苗組在免疫21～56d抗體水平維持在較高水平，之后抗體水平隨時間推移逐漸回落。3種血清學(xué)檢測方法均顯示，免疫奶牛后A19疫苗組抗體水平明顯高于S2疫苗組，抗體產(chǎn)生速度更快，持續(xù)時間更長，見圖1。

2.3A19免疫牛群3種血清學(xué)方法陽性率

A19疫苗免疫后，應(yīng)用RBT、SAT和cELISA方法檢測顯示免疫后28d所有動物均為陽性，陽轉(zhuǎn)率達(dá)到100%，說明此時奶牛機(jī)體內(nèi)抗體水平達(dá)到最高水平。免疫84d后，抗體水平開始出現(xiàn)下降，cELISA較RBT和SAT檢測抗體持續(xù)時間更長，表現(xiàn)出更好的靈敏性。見表2。

2.4S2免疫牛群3種血清學(xué)方法陽性率

S2疫苗免疫后，應(yīng)用RBT、SAT和cELISA方法檢測顯示免疫后抗體轉(zhuǎn)陽率始終低于30%，免疫后168d3種檢測方法均未檢測陽性血清。見表3。

3討論

我國現(xiàn)有的A19疫苗是20世紀(jì)50年代從蘇聯(lián)引進(jìn)的未缺失序列的S19株，毒力強(qiáng)于S2疫苗株，該毒株不適用于懷孕動物和公畜：免疫懷孕奶牛可引起1%～2.5%的流產(chǎn)和公畜持續(xù)睪丸炎[9]。S2疫苗是中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所于1960年從豬胚篩選出的豬種布氏菌2號弱毒菌株，安全性較好，孕期家畜仍可使用[10]。目前認(rèn)為清除胞內(nèi)寄生菌主要依賴于細(xì)胞免疫，但是布魯氏菌細(xì)胞免疫水平的檢測尚不成熟，抗體水平通常與細(xì)胞免疫水平呈正比，可在很大程度上反映細(xì)胞免疫水平[11]。

結(jié)果表明，A19疫苗能刺激奶牛產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，陽轉(zhuǎn)率和抗體持續(xù)時間明顯優(yōu)于S2疫苗，對奶牛免疫效果較好。在免疫方法上，口服法使用布病疫苗雖使用全封閉連續(xù)投藥器，但對牛的保定和人員的操作水平有一定要求，實(shí)際免疫劑量和外泄數(shù)量較難控制。相比之下，皮內(nèi)注射操作更為方便，免疫劑量更易控制。結(jié)合試驗(yàn)數(shù)據(jù)和2種疫苗的特點(diǎn)，建議本地區(qū)牛場有選擇的使用2種疫苗：育成牛和產(chǎn)后母牛選擇A19疫苗，孕牛選擇S2疫苗。在免疫程序上可采取犢牛3～6月齡首免A19疫苗，6～8個月后加強(qiáng)免疫1次，此后及時監(jiān)測抗體水平，根據(jù)需要每年加強(qiáng)1～2次;S2疫苗在使用時間隔3～4個月加強(qiáng)1次免疫。4結(jié)論

對比RBT、SAT.cELISA檢測可知，RBT在2種疫苗免疫后5～28d敏感性高于另外2種檢測方法。SAT在免疫后檢測到抗體峰值水平的時間較兩者晚且操作復(fù)雜、費(fèi)時，判斷時對操作人員的要求較高。cELISA表現(xiàn)出較SAT更好的敏感性，結(jié)果判定時人為誤差較小，操作更為方便。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果并結(jié)合實(shí)際工作中的應(yīng)用，建議在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測中使用RBT方法進(jìn)行初篩，用SAT或cELISA進(jìn)行確診。

參考文獻(xiàn)

[1]ALEIXO MJ， FERRIRA M L， ANTUNES F. Brucellosis[J]. . Acta Med Port， 1999， 12 （ 12 ） ： 323-330.

[2]Gul S T， Khan A. Epidemiology and epizootology of brucellosis： review[J]. Pakistan Veterinary Journal， 2007， 27 （3 ） ： 145-151.

[3] Cloeckaert A， Grayon M， Verger JM， et al. Conservationof seven genes involved in the biosynthesi-s of the lipopolysaccharide O-side chain in Brucellaspp. [J]. ResMicrobiol， 2000， 151：209-216.

[4]Zhan Y， Yang J， Cheers c. Cytokine response of T-cell subsets from Brucella abortus-infected mice to soluble Brucella proteins[J]. Infect Immun， 1993， 61： 2 841-2 847.

[5]丁家波，馮忠武.動物布魯氏菌疫苗應(yīng)用現(xiàn)狀及研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)，2013，25（1）;91-99.

[6]Skendros P， Pappas G， Boura P. Cell-mediated immunity in human brucellosis [J]. Microbes and Infection， 2011， 13 （2 ） ： 134-142.

[7]錢晶、犬布氏桿菌菌殼疫苗株的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)免疫研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[8]Beckett F W， MacDiarmid S C.The effect of reduced-dose Brucella abortus strain 19 vaccination in accredited dairy herds.Br VetJ， 1985， l41： 507-514.

[9]張海霞，孫曉梅，魏凱，等.布魯氏菌病的研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.2018，49（3）：402-407.

[10]李建玲，李愛巧，楊啟元，等、烏魯木齊牛羊布魯氏菌疫.苗免疫效果對比試驗(yàn)[J].中國動物檢疫，2013，2（4）：47-49.

[11]景志剛，嚴(yán)家瑞，范偉興、布魯氏菌病疫苗研究進(jìn)展[J].中國人獸共患病學(xué)報，2016，32（2）：188-199.