王靜 ， 王瑾 ， 徐建峰 ， 鄭國建 ， 周衛(wèi)龍 *

（1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.國家茶葉質量監(jiān)督檢驗中心，浙江杭州 310016）

花青素是一種廣泛存在的天然植物水溶性色素，屬于黃酮類化合物。大量研究表明花青素具有諸多生物學功效，例如抗氧化[1-2]、抗病毒[3]、預防心血管疾病[4-5]、抗衰老[6]等。茶葉中也富含花青素，紅紫色茶樹葉片在夏季高溫條件下，易在高海拔的群體茶園中發(fā)生，是一種茶樹抗逆生理的表現(xiàn)形式[7]。有研究表明，茶葉中的花青素具有苦味，影響茶葉品質，因此過去富含花青素的紫芽茶品質欠佳也較少有人關注[8]。一般茶葉中的花青素含量只占干物質的0.01%左右[9]，紫色芽葉中的花青素含量則可高達0.5%～1.0%[10]。云南省農業(yè)科學院茶葉研究所采用單株選種法經多代培育出的新品“紫娟”（品種權號 20050031），具有紫芽、紫葉、紫莖的特性，并且其花青素的含量是一般紅芽茶的3倍左右[11]。由于紫芽茶中花青素含量較高具有一定的特征性，茶葉中花青素含量的高低可以作為一種評判紫芽茶的依據。

近年來由于對花青素生物功能的深入研究，消費者對于在自然界中含量豐富的水溶性色素的關注度隨之上升。目前由肯尼亞提出，國際標準化組織食品技術委員會茶葉分技術委員會（ISO/TC34/SC8）已同意紫芽茶作為前期項目立項，項目名稱為ISO/PWI 23827《紫芽茶 定義和基本要求》。因此建立一種操作簡便、可操作性強的茶葉中花青素含量的檢測方法顯得尤為重要。

目前關于茶葉花青素的研究主要集中在茶樹選育開發(fā)[12-13]、合成途徑及調控機理[14]等，對于花青素的檢測方法研究較少。植物源性食品中花青素含量主要的檢測方法有pH示差法、分光光度法和液相色譜法三種。文章對目前茶葉及其他植源性食品中花青素的主要檢測方法進行綜述，并結合自身研究，對今后茶葉中花青素的檢測方法提出一定的建議及數據支持。

1 花青素的理化特性

花青素的基本結構單元是2-苯基苯并吡喃型陽離子，即花色基元。在植物中常見的花色基元主要有天竺葵色素 （Pelargonidin）、矢車菊色素（Cyanidin）、飛燕草色素（Delphindin）、芍藥色素（Peonidin）、牽?；ㄉ兀≒etunidin）及錦葵色素（Malvidin）[15]，其基本結構和花色基元結構分別如圖1和表1所示。

圖1 花青素的基本結構[16]Fig.1 Basic structure of anthocyanins

表1 常見花色基元結構[16]Table 1 Chemical structure of common anthocyanins

自然條件下游離狀態(tài)的花青素極少見，一般均以糖苷的形式存在，常與一個或多個葡萄糖、半乳糖、鼠李糖等通過糖苷鍵形成花色苷[15，17]。目前，在植物中分離鑒定的花青素種類超過600多種，植物中新的花色苷種類的分離鑒定還在增加[18]。

根據不同的pH和螯合物中金屬離子，花青素所呈現(xiàn)的顏色也不同：pH＜7呈紅色，pH在7～8時呈紫色，pH＞11時呈藍色。茶葉細胞液呈酸性，因此當茶葉中的花青素含量較高時會呈現(xiàn)紅紫色。植源性食品中的花青素易溶于水和醇類化合物，在pH小于3的酸性條件下較為穩(wěn)定[19]。

2 茶葉中花青素的測定方法

2.1 pH示差法

pH示差法的原理為花色苷發(fā)色團的結構轉換是pH的函數，而對花色苷起干擾作用物質的性質卻不隨pH值變化。在花色苷最大吸收波長下確定兩個對花色苷吸光度差別最大但是對花色苷穩(wěn)定的pH值，對花色苷進行定量分析。

趙慧芳等[20]使用pH示差法測定黑莓果實中花色苷的含量，利用花色苷及黃酮在pH為1.0時在510 nm及700nm處均有最大吸收，而pH為4.5時僅在700 nm處有最大吸收的特點，用示差法測定花色苷總量（其總量以矢車菊-3-葡萄糖苷計）。殷海松等[21]參考該方法對藍莓中的花色苷進行了測定。宋德群等[22]在520 nm下，分別測定pH1.0和pH4.5時吸光度，測定藍莓中的花色苷含量（以矢車菊-3-葡萄糖苷計）。其測定結果的相對標準偏差為1.39%，并且認為該種方法受到其他干擾物的影響較小。張榮菲等[23]參考上述方法進行藍莓中花青素的測定。

pH示差法目前也在茶葉中花青素檢測方面有所應用。田野等[24]使用pH示差法測定了“紫嫣”茶中花青素的含量，其結果為2.29 mg/g。陳瓊等[25]對比了單一pH法及pH示差法分別測定茶樹芽葉中花色苷的含量，認為單一pH法的結果與pH示差法存在很大的相關性 （R2＝0.9927），且單一pH法結果偏高，但文中pH示差法的結果較以往文獻結果[2，10]偏低。

pH示差法操作較為簡便，較常見于植源性食品中花色苷的測定，但受兩個不同pH值下兩種花色苷存在形態(tài)的平衡轉化率的影響[25]，其測定結果存在偏低的現(xiàn)象。

2.2 液相色譜法

目前植源性食品中花青素的測定較常見使用液相色譜法。陳長應[26]使用液相色譜測定了黑綠豆中花青素的含量，其使用原花青素作為標準品制作標準曲線進行測定，結果重復性和回收率均較好。趙子丹等[27]使用液相色譜測定黑果枸杞中的花青素含量，其使用了六種常見花青素（矢車菊色素、天竺葵色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽?；ㄉ睾湾\葵色素）標準品進行測定，且結果精密度好、準確度高。

使用液相色譜法對茶葉中的花青素進行測定的文獻報道也較多。李智[28]建立了一種茶樹紫色芽葉花色苷的HPLC分析方法，運用HPLCDAD-MS/MS聯(lián)用技術，初步推測了茶樹紫色芽葉花青素中5個主要組分，分別為飛燕草-3-半乳糖苷、矢車菊-3-半乳糖苷、飛燕草-3-蕓香糖苷、矢車菊-3-蕓香糖苷和天竺葵-3-蕓香糖苷。呂海鵬等[29]使用HPLC法測定“紫娟”茶樹品種的花青素組分及其含量，認為“紫娟”茶的花青素主要成分為4種花青素單體，分別為天竺葵素-3，5-二葡萄糖苷、矢車菊-3-O-半乳糖苷、天竺葵色素和錦葵色素，測定結果這四種花青素單體總和為0.43 mg/g。解東超等[30]使用液相色譜串聯(lián)質譜的方法在紫娟烘青綠茶中鑒定出12種花青素并定量，最終測定的紫娟烘青綠茶成品茶中的花青素總量為1.82 mg/g。在標準方法方面，農業(yè)部發(fā)布了相關行業(yè)標準NY/T 2640—2014《植物源性食品中花青素的測定高效液相色譜法》[31]，其中使用6種花青素標準品作為標品分別對花青素進行定量。

液相色譜法雖然是目前較為簡便快捷的一種花青素的檢測方法，但自然存在的花青素種類繁雜、品種眾多，利用高效液相色譜法直接分析需要購置多種標準品，成本較高，用于實際檢測仍然存在一定難度[27]。并且使用液相色譜法對紫色芽葉品種的花青素進行的測定結果[29-30]與之前普遍認為的紫色芽葉品種中花青素含量 （0.5%～1.0%）[2，10，29]相比普遍偏低。

2.3 分光光度法

分光光度法是較為常用的測定植源性食品中花青素的一種方法。陳長應[32]建立了一種微波消解-可見分光光度法測定紫甘薯中花青素的測定方法，使用原花青素作為標準品進行定量測定，結果表明該方法簡便準確。劉長姣等[33]使用分光光度法對黑米中的花青素進行測定，使用矢車菊素-3-葡萄糖苷作為標準品進行定量，結果表明方法操作簡便、重復性好、測定結果精密度高。

使用分光光度法對茶葉中花青素的測定的文獻報道較少。鐘蘿[34]在《茶葉品質理化分析》中提到測定茶葉中總花青素含量的分光光度法。茶葉磨碎后經沸水提取，使用酸性乙醇溶液顯色后進行比色定量。該種分光光度法操作簡便，無需使用多種標準品，可大幅度降低檢測成本，因此可操作性強，適用于茶葉中花青素含量的測定。

3 茶葉中總花青素分光光度測定法的改進

使用分光光度法測定茶葉中總花青素[34]時，由于茶葉提取液本身在花青素吸收波長下也存在一定的吸光度，會引起測定結果偏高，因此在最后結果計算時應扣除相應的樣品空白。

對該方法改進后具體操作步驟如下：稱取磨碎茶樣2.0 g，加沸水 10 mL，在沸水浴中提取30 min，過濾后加水定容至50 mL。準確吸取2 mL提取液置于試管中，加酸性乙醇溶液5 mL，搖勻。靜置30 min后于535 nm波長下比色，以試劑空白作參比，同時吸取2 mL提取液加入5 mL蒸餾水作為樣品空白，在最后結果計算中扣除。

根據上述方法，對市售綠茶、紅茶和由紫芽茶加工的幾種成品茶進行測定，結果如表2所示。

表2 幾種茶葉中花青素測定結果Table 2 Contents of total anthocyanins in tea samples

從表2中可以看出，一般茶葉中花青素含量較低，加入酸性乙醇溶液后不會顯出明顯剛果紅色，且樣品空白值會略高于樣品測定值。而紫芽成品茶的含量均較高，重復性較好，且與以往文獻[2，10，29]中結果相似 。 張寶宏[35]認 為鐘 蘿所 提出的分光光度法測定茶葉中花青素總量的方法會導致結果偏高，這可能就是由于未進行樣品空白的扣除所導致。

4 結論與討論

文章就目前主要的三種測定植物性食品中花青素的方法進行了綜述，這三種檢測方法的優(yōu)缺點如表3所示?？梢钥闯鰌H示差法雖然操作簡單，但是較常以矢車菊-3-葡萄糖苷對花青素進行定量，同時存在會導致測定結果偏低的情況。液相色譜法雖然操作快捷，結果精密度、準確性均較好，但是需要購置較多標準品進行定量，使檢測成本增加。

分光光度法操作簡便，結果重復性較好。在以往茶葉中總花青素分光光度測定方法[34]的基礎上，加入扣除樣品空白的步驟，消除了樣品提取液本身湯色對結果的影響。根據改進的方法測定的幾種常見傳統(tǒng)茶葉與紫芽成品茶的結果也均與以往文獻中的結果較為一致，具有可參考與對比性。

表3 pH示差法、液相色譜法和分光光度法測定茶葉中的花青素優(yōu)缺點比較Table 3 Comparison among pH-differential method，high performance liquid chromatograph and spectrophotometry