謝 晶，曹 冶，李 琰，殷明郁，于吉峰，李興玉，康潤(rùn)敏，張金靈

（四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066）

仔豬腹瀉是集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)條件下的一種典型的多因素性疾病，對(duì)仔豬成活率和后期增重都具有嚴(yán)重影響，是目前最為嚴(yán)重的仔豬疾病之一[1-2]。仔豬腹瀉發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，常表現(xiàn)為交叉混合感染，導(dǎo)致臨床診斷與防治困難，為養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（EnterotoxigenicEscherichia coli,ETEC）是導(dǎo)致仔豬腹瀉發(fā)生的主要病原菌，在我國(guó)大約有35%的病例由ETEC引起，部分仔豬會(huì)繼發(fā)感染沙門氏菌[3-8]。目前在生產(chǎn)中主要使用抗生素對(duì)仔豬腹瀉進(jìn)行預(yù)防和治療，但由于抗生素的濫用，不僅使得病原微生物產(chǎn)生耐藥性，降低藥物療效，而且，這些藥物大量使用會(huì)造成畜產(chǎn)品中藥物殘留，嚴(yán)重威脅人類健康。因此，以天然中草藥為原材料或以中草藥與西藥相結(jié)合來防治仔豬腹瀉日益受到重視[9-11]，藏藥作為我國(guó)傳統(tǒng)中草藥的一個(gè)重要組成部分，具有很好的研究?jī)r(jià)值和開發(fā)前景。本研究選擇17味藏藥對(duì)仔豬細(xì)菌性腹瀉主要病原菌產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、豬霍亂沙門氏菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，利用瓊脂擴(kuò)散法和試管二倍稀釋法篩選出對(duì)仔豬細(xì)菌性腹瀉敏感的藏藥，為仔豬細(xì)菌性腹瀉藏藥防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017年8月至2018年8月在四川省畜牧科學(xué)研究院獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 菌株

產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌BNCC186736和豬霍亂沙門氏菌CVCC3383為標(biāo)準(zhǔn)株，分別購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物有限公司和中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.3 藏藥

選擇矮紫堇、波棱瓜子、烏奴龍膽、多刺綠絨蒿、余甘子、螃蟹甲、寬解藤、茜草、翼首草、狼毒、千里光、甘松、虎耳草、訶子、刺柏、藏木香、無(wú)患子共17味藏藥，作為本次研究所用藥物，全部藥物購(gòu)自成都市荷花池中藥材專業(yè)批發(fā)市場(chǎng)。

1.4 主要試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自四川達(dá)文西科技有限公司，Mueller-Hinton瓊脂購(gòu)自O(shè)IOID LTD。

1.5 菌液的制備及計(jì)數(shù)

菌種復(fù)蘇，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)12 h。

1.6 藏藥提取的制備

將已篩選17味藏藥經(jīng)粉碎至粗粉，分別制備水提取物和乙醇提取物，用于體外抑菌作用研究。1.6.1水粗提取物的制備 稱取各藏藥生藥粉末100 g，用濾紙包好后放入索氏抽提器中，加入中性去離子水索氏提取5 h，回收水提取物，在水浴鍋上濃縮并定容，即得水粗提取物，最終濃縮液的藥物濃度見表1，無(wú)菌分裝后放入-20℃冰箱備用。藥物編號(hào)X-1。

1.6.2 乙醇粗提取物的制備 稱取各藏藥粗粉100 g，用濾紙包好后，放入索氏抽提器中，加入無(wú)水乙醇索氏提取6 h，回收乙醇提取物，在水浴鍋上濃縮并定容，最終濃縮液的藥物濃度見表1，紫外線照射滅菌獲得乙醇粗提取物，無(wú)菌分裝后放入-20℃冰箱備用。藥物編號(hào)X-2。

1.7 單味藏藥粗提取物藥物敏感性試驗(yàn)

參照YY-T 1191-2011抗菌劑藥敏紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將紙片滴加20 μL提取液，無(wú)菌烘干備用。培養(yǎng)基采用Mueller-Hinton瓊脂。將培養(yǎng)菌液用無(wú)菌生理鹽水稀釋至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙骸Ｓ脽o(wú)菌棉拭蘸取稀釋過的菌液，均勻涂布整塊瓊脂培養(yǎng)基表面，室溫3～5 min后，貼加含藥紙片，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h，測(cè)定其紙片周圍抑菌環(huán)直徑的大小3次，計(jì)算其平均值即為試驗(yàn)結(jié)果。

1.8 單味藏藥粗提取物藥物最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定

粗提取物蒸干稱重后定容，計(jì)算粗提取物濃度，采用試管二倍稀釋法進(jìn)行，確定中藥最小抑菌濃度（MIC）。取無(wú)菌的試管9支進(jìn)行編號(hào)，除第1管加入1～1.5 mL MH肉湯外，其余每管加入MH肉湯1 mL，在第1管加入提取物原液0.5～1 mL，終體積為2 mL，混勻，然后吸取1 mL至第2管，混勻后再吸取1 mL至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第8管，并從第8管中吸取1 mL棄去，第9管為不含藥物的生長(zhǎng)對(duì)照。之后在每管內(nèi)加入上述制備好的接種物各1 mL，使每管最終菌液濃度約為5×105CFU/mL。置35℃普通空氣孵箱中孵育24 h。以肉眼觀察，藥物最低濃度管無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者，即為受試菌的MIC。

2 結(jié)果

2.1 藏藥粗提取物生藥濃度

將17味藏藥粉碎，進(jìn)行水提取、乙醇提取，濃縮獲得粗提取物，并計(jì)算生藥濃度，各藏藥粗提取物生藥濃度見表1。

表1 藏藥粗提取物生藥濃度 g/mL

2.2 單味藏藥粗提取物藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)定結(jié)果顯示，產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)株BNCC186736對(duì)烏奴龍膽、多刺綠絨蒿、余甘子、螃蟹甲、寬解藤、狼毒、甘松、訶子8味藥物敏感。其中，余甘子的水粗提取物和乙醇粗提取物都有顯著的抑菌效果；訶子的水粗提取物有顯著的抑菌效果，而醇粗提取物沒有抑菌效果；烏奴龍膽、多刺綠絨蒿、螃蟹甲、寬解藤、狼毒、甘松的乙醇粗提取物有顯著的抑菌效果，而水粗提取物沒有抑菌效果。豬霍亂沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株CVCC3383對(duì)多刺綠絨蒿、余甘子、螃蟹甲、訶子4味藥物敏感。其中，多刺綠絨蒿、螃蟹甲的乙醇粗提取物有顯著的抑菌效果，而水粗提取物沒有抑菌效果；余甘子、訶子的水粗提取物有顯著的抑菌效果，而乙醇粗提取物沒有抑菌效果。結(jié)果見表2。

表2 單味藏藥藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 mm

2.3 單味中藥最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定結(jié)果

選取對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)株BNCC 186736和豬霍亂沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株CVCC3383均有抑菌效果的藏藥余甘子、訶子水粗提取物和多刺綠絨蒿、螃蟹甲的乙醇粗提取物，測(cè)定最小抑菌濃度，測(cè)定結(jié)果顯示，余甘子、訶子的水粗提取物對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門氏菌的抑菌效果最好，兩味藏藥的最小抑菌濃度分別為1.516 mg/mL和6.065 mg/mL；多刺綠絨蒿、螃蟹甲的乙醇粗提取物對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門氏菌也具有較好的抑菌效果，兩味藏藥的最小抑菌濃度分別為41.333 mg/mL和94.302 mg/mL。結(jié)果見表3。

表3 單味藏藥最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定結(jié)果 mg/mL

3 討論

藏藥是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)寶庫(kù)的一個(gè)重要組成部分，傳統(tǒng)藏藥中有許多具有治療細(xì)菌性感染性疾病的功效[13]。目前臨床治療中抗生素耐藥性菌株的增多以及化學(xué)藥物的副作用，使得從天然藥物中分離篩選新的抗菌藥物成為趨勢(shì)和熱點(diǎn)。

本研究選取矮紫堇、波棱瓜子、烏奴龍膽、多刺綠絨蒿等17味藏藥均具有清熱解毒抗感染的作用，體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，烏奴龍膽、多刺綠絨蒿、余甘子、螃蟹甲、寬解藤等8味藏藥具有較好的抑菌效果，矮紫堇、波棱瓜子、虎耳草等9味藏藥未表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性。在具有抑菌效果的8味藏藥中，除訶子外的7味藏藥的乙醇粗提取物均具有抑菌活性；而僅有余甘子、訶子2味藏藥的水粗提取物具有抑菌活性。從中篩選出對(duì)仔豬細(xì)菌性腹瀉主要病原菌產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、豬霍亂沙門氏菌均有抑菌作用的藏藥4味，分別為余甘子、訶子、多刺綠絨蒿和螃蟹甲，其中又以余甘子、訶子的水粗提取物的抑菌效果最好，為仔豬細(xì)菌性腹瀉藏藥防治提供理論基礎(chǔ)。

余甘子是大戟科葉下珠屬植物余甘子的果實(shí)，在藏藥、蒙藥、維藥、彝藥等中都有廣泛應(yīng)用。余甘子含有多種維生素、微量元素、氨基酸、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、糖類等[14]，研究表明余甘子提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、鼠沙門氏菌、霍亂弧菌、大腸埃希氏菌等均有抑菌活性，抗菌譜較廣[15-17]。本試驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，余甘子的乙醇粗提取物和水粗提取物都有顯著的抑菌效果。其乙醇粗提取物對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌具有抑菌作用，水粗提取物對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門氏菌均有抑菌作用，且抑菌效果最好，最小抑菌濃度為1.516 mg/mL。

訶子是使君子科欖仁樹屬植物訶子及其變種絨毛訶子的干燥成熟果實(shí)，在我國(guó)民間用藥較廣泛，在藏藥中有“藥中之王”之稱[18]。訶子化學(xué)成分豐富，含鞣質(zhì)類、酚酸類、三萜類、黃酮類、揮發(fā)油等，研究表明訶子提取物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌均有顯著的抑菌效果[18-20]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，訶子的水粗提取物對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門氏菌均有較強(qiáng)的抑菌作用，最小抑菌濃度為6.065 mg/mL。

多刺綠絨蒿是罌粟科綠絨蒿屬多刺綠絨蒿的全草，為藏醫(yī)習(xí)用藥，具有清熱止痛、活血化瘀等功效[21-22]?，F(xiàn)代研究表明多刺綠絨蒿含有生物堿、黃酮、萜類等成分，其中的血根堿的酸性硫酸鹽、桂皮酸、白屈菜紅堿等成分對(duì)某些細(xì)菌具有顯著的抑制作用[23]，但少見多刺綠絨蒿提取物抑菌效果的研究報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，多刺綠絨蒿的乙醇粗提取物對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門氏菌均有抑菌作用，最小抑菌濃度為41.333 mg/mL。

螃蟹甲是唇形科糙蘇屬多年生草本植物螃蟹甲的干燥塊根，是藏醫(yī)常用傳統(tǒng)藏藥。螃蟹甲主要含有環(huán)烯醚萜苷類、呋喃拉布素型二萜類、黃酮類、苯乙醇苷類、揮發(fā)油類等化合物，具有祛風(fēng)活絡(luò)、強(qiáng)筋壯骨、清熱消腫、止咳祛痰、抗感染等作用[24-25]。研究表明，螃蟹甲提取物對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌具有顯著的抗菌作用[13，26]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，螃蟹甲的乙醇粗提取物對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門氏菌均有抑菌作用，最小抑菌濃度為94.302 mg/mL。