賈福懷,陸 偉,涂宏建,熊菲菲,陳 磊,雷 蕾

(寧波御坊堂生物科技有限公司,浙江 寧波315012)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根,具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹等功效,主產(chǎn)于甘肅、內(nèi)蒙古、山西等地[1]。黃芪甲苷Astragaloside IV是黃芪增強機體免疫功能的主要活性成分之一,屬于四環(huán)三萜類皂苷,具有良好的免疫調(diào)節(jié)、器官保護、改善心肌能量代謝、消炎抗病毒等功效,已成為評價黃芪藥材及其制劑質(zhì)量優(yōu)劣的主要標準之一[2-4]。近年來越來越多的文獻針對黃芪甲苷的提取純化、含量檢測、藥理作用、機制研究和應用研究等方面進行了詳細的報道[5-9]。因此,建立一種準確、穩(wěn)定、靈敏度高、特異性強的含量測定方法,可以為黃芪甲苷的后續(xù)相關(guān)研究及功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。目前,黃芪甲苷含量檢測的方法較多,主要包括薄層掃描法、熒光分光光譜法、HPLC-UV/ELSD、質(zhì)譜法和近紅外波譜法等[10-12]。中華人民共和國藥典(以下簡稱《中國藥典》)2015版中采用甲醇溶液索氏提取,正丁醇和氨試劑萃取,D101型大孔吸附樹脂凈化以及HPLC-ELSD檢測法,對黃芪藥材中的黃芪甲苷進行定量檢測,該方法中儀器檢測部分較為穩(wěn)定,但樣品前處理部分具有耗時長、人為操作誤差較大、實驗結(jié)果重現(xiàn)性不佳等缺點。相關(guān)文獻針對其前處理方法也進行了相應的優(yōu)化和改進[13-15],但總體效果一般。本研究采用甲醇回流提取和超聲提取相結(jié)合的混合提取方式,HPLC-ELSD儀器檢測方法,既簡化了相應的前處理步驟,縮短處理時間,提高檢測效率,又提高了樣品中黃芪甲苷的提取效率,從而使檢測結(jié)果具有良好的準確度和重現(xiàn)性。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1260 HPLC高效液相色譜儀；Alltech 3300 ELSD蒸發(fā)光散射檢測器；國華電器HH-4水浴鍋；KH-260DB超聲清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；D101大孔吸附樹脂柱(柱內(nèi)徑1.5 cm,長12cm)；普析超純水機等。

1.2 樣品與試劑

黃芪樣品：亳州永剛飲片廠(批號：171124；180402；2018040303,產(chǎn)地均為甘肅)；亳州普仁中藥飲片廠(批號：1804081,產(chǎn)地甘肅)。甲醇(色譜純)；乙腈(色譜純)；正丁醇(分析純)；氨水(分析純)；水(超純水)等。黃芪甲苷對照品(中國食品藥品檢定研究院,含量96.9%,批號：110781-201717)。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-ELSD色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)；流動相：ACN∶H2 O＝32∶68,等度洗脫；柱溫：35℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10μL；ELSD氣化溫度：90℃；氮氣流量：1.8 L/min；增益∶1；運行時間：45 min。數(shù)據(jù)結(jié)果計算方法：外標兩點對數(shù)方程法。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液制備 稱取黃芪甲苷對照品適量,精密稱定,加甲醇溶解稀釋成每1.0mL含0.12mg和0.48mg的溶液,即得2種不同濃度的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 將黃芪藥材或飲片粉碎,過四號篩,備用。

方法1：2015版《中國藥典》方法：稱取4 g左右黃芪粉末,精密稱定,置于索氏提取器中。加甲醇40 mL,冷浸過夜。加熱回流4 h,提取液濃縮至干后加水10 mL,微熱溶解。用水飽和的正丁醇提取4次,每次40 mL,合并正丁醇溶液。用氨試液洗滌2次,每次40 mL,棄去氨試液,正丁醇溶液蒸干,加5 mL水溶液,通過D101型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑1.5 cm,柱高12 cm)。用水50 mL,40%的乙醇溶液30 mL依次洗滌,棄去洗滌液。繼用70%乙醇溶液80 mL洗脫,收集洗脫液,蒸干。甲醇溶解,置于10 mL容量瓶中定容、搖勻。HPLC-ELSD測定,進樣前樣品溶液用0.45μm有機系濾膜過濾。

方法2：與方法1同至“正丁醇溶液蒸干”,加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,用甲醇定容。HPLC-ELSD測定,進樣前樣品溶液用0.45μm有機系濾膜過濾。

方法3：稱取4g左右黃芪粉末,精密稱定,置于圓底燒瓶中,加入甲醇80mL,冷浸過夜。70℃加熱回流4.0 h后,靜置5min,取上清液過濾。濾液于65℃旋蒸至干,加15mL熱水溶解。用水飽和的正丁醇提取4次,每次40 mL,合并正丁醇提取溶液。用氨試液洗滌2次,每次50 mL,棄去氨試液,正丁醇溶液在85℃下旋蒸至干,殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,加甲醇定容,0.45μm濾膜過濾后即得樣品溶液。

方法4：稱取4g左右黃芪粉末,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,加甲醇80 mL,冷浸過夜。30℃,100 W功率超聲30 min,靜置5 min后取上清液過濾。殘渣加入甲醇80 mL后再次超聲提取,重復3次后合并甲醇溶液,從“濾液于65℃旋蒸至干”開始,與方法3相同操作。

方法5：稱取4g左右黃芪粉末,精密稱定,置于圓底燒瓶中。加入甲醇80mL,冷浸過夜。70℃加熱回流1.5h后,靜置5 min,取上清液過濾。殘渣加入甲醇50 mL,30℃,100 W功率超聲15min。靜置5 min后取上清液過濾,重復超聲步驟2次。合并甲醇提取溶液,從“濾液于65℃旋蒸至干”開始,與方法3相同操作。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精確配制 0.06 mg/mL、0.12 mg/mL、0.24mg/mL、0.48mg/mL、0.96 mg/mL、1.92 mg/mL一系列濃度的黃芪甲苷對照品溶液,按照上述“2.1”色譜條件進行測試,記錄不同濃度黃芪甲苷對照品色譜峰面積。以濃度的對數(shù)為橫坐標,峰面積的對數(shù)為縱坐標,獲得線性回歸方程：Y＝1.672X＋3.544,r＝0.999 8。數(shù)據(jù)表明黃芪甲苷在0.06～1.92 mg/mL濃度范圍內(nèi),進樣溶液濃度的對數(shù)與峰面積的對數(shù)呈良好的線性關(guān)系,表明本方法適用于黃芪甲苷定量分析檢測。

2.4 樣品溶液穩(wěn)定性考察

在常溫、避光放置的條件下,取本品方法5制備的供試品溶液,分別于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h進樣10μL注入Agilent HPLC 1260儀器中,按“2.1”項下色譜條件測定黃芪甲苷的色譜峰面積,7次測定的色譜峰面積RSD為1.87%,表明供試品溶液在常溫避光環(huán)境中12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 儀器精密度考察

使用液相色譜儀重復6次測定黃芪甲苷對照品溶液,每次精密吸取濃度為0.48 mg/mL的黃芪甲苷對照品溶液10μL,收集色譜峰面積,結(jié)果RSD為0.76%。表明本HPLC-ELSD方法儀器精密度良好。

2.6 不同方法比較

取同一批黃芪飲片(批號：永剛180402),按照“2.2.2”項下的5種不同前處理方法進行黃芪甲苷檢測方法研究,每種方法各重復5次。詳細數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。分析總結(jié)實驗數(shù)據(jù),我們可以發(fā)現(xiàn)：①按照方法1(2015版《中國藥典》方法),前處理步驟繁瑣,人為操作引入的誤差較大,導致重現(xiàn)性差；同時耗時較長,冷浸過夜之后前處理時間仍需8 h左右。②對比方法1、2數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)樹脂凈化除雜的過程會造成黃芪甲苷的大量損失,含量檢測結(jié)果明顯偏低。潘細貴等[16]也已通過實驗證明：使用D101型大孔吸附樹脂在黃芪總皂苷凈化除雜過程中,即使采用少量低濃度乙醇(15%)清洗樣品,也能洗脫部分黃芪總皂苷,并隨著濃度的增大而增大。同時D101型大孔吸附樹脂也會對黃芪總皂苷進行一定的殘留吸附,難以洗脫。由此可見柱層析凈化過程將會對黃芪甲苷的含量造成不可避免的損失。③通過使用柱效較高的反相色譜柱結(jié)合高靈敏的ELSD檢測器,已足夠分離黃芪供試品中的雜質(zhì)干擾,而無需采用樹脂凈化除雜的過程。采用上述“2.1”色譜方法,針對未過柱的黃芪供試品溶液分析,發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷主峰的理論塔板數(shù)達18 000,與最近的雜質(zhì)峰的分離度達2.62,且峰型對稱,拖尾因子為0.95,完全滿足定量分析條件。因此,大孔吸附樹脂除雜過程可以省去,不會對定量檢測造成影響,詳細色譜見圖1。④索氏提取、回流提取、超聲提取間具有一定的差異：索氏提取操作復雜,效率低；回流提取的提取率相較于超聲和索氏提取稍高；超聲提取操作簡便,處理時間短,但提取效率偏低；⑤改進后的方法5,通過結(jié)合加熱回流和超聲提取兩種提取方法。不僅縮短了提取步驟和時間,冷浸過夜之后前處理時間縮短到4 h之內(nèi),相較與藥典方法縮短了一半左右。同時,提高了提取效率,檢測結(jié)果顯示方法5處理后的提取液中黃芪甲苷含量最高。⑥對比5種前處理方法平行實驗的RSD數(shù)據(jù)：方法5＜方法3＜方法4＜方法2＜方法1,發(fā)現(xiàn)改進后的方法5簡化了實驗步驟,增強了可操作性,提高了實驗結(jié)果的重現(xiàn)性。

圖1 黃芪甲苷HPLC-ELSD色譜

表1 不同提取方法測定黃芪樣品中黃芪甲苷含量結(jié)果 (n＝5)

續(xù)表1 不同提取方法測定黃芪樣品中黃芪甲苷含量結(jié)果 (n＝5)

2.7 加標回收率試驗

精密稱定5份4 g左右的黃芪粉末樣品(批號：永剛180402,含量通過方法5已測定為0.076 4%)。分別精密加入0.48 mg/mL的黃芪對照品2.0 mL進行加標,按照“2.2.2”項中的方法5步驟進行加標回收率試驗,重復試驗過程并計算回收率,結(jié)果平均回收率為100.16%,5次加標實驗的RSD值為2.63%,表明加標實驗結(jié)果良好,改進后的方法5能夠針黃芪飲片中的黃芪甲苷進行準確測定。詳細結(jié)果見表2。

表2 加標回收率試驗結(jié)果

2.8 實際樣品測定

為驗證“2.2.2”項中方法5的實用性,我們針對4批亳州飲片公司購買的黃芪飲片進行實際樣品測定,檢測結(jié)果良好,含量均符合2015版《中國藥典》中規(guī)定的黃芪甲苷要求含量0.040%。但同時也發(fā)現(xiàn)不同批次飲片之間黃芪甲苷含量差異明顯,說明不同批次的黃芪藥材之間質(zhì)量差異較大。通過改變方法中的稱樣量(提取物稱樣量為2.5g左右),本方法也適用于黃芪水提提取物中黃芪甲苷的含量測定。結(jié)果見表3。

表3 黃芪飲片及水提提取物中黃芪甲苷含量測定結(jié)果

3 討論

本研究建立了一種加熱回流提取結(jié)合超聲提取的混合提取前處理方法,通過高靈敏的HPLC-ELSD儀器檢測,針對黃芪飲片及其水提提取物中黃芪甲苷的含量進行準確定量。相比于2015版《中國藥典》中的檢測方法,混合提取模式不僅縮短了提取時間,提高黃芪甲苷的提取率和檢測的效率,而且通過省略大孔樹脂的凈化過程,減少前處理步驟,降低了檢測成本,從而明顯提高了檢測方法的準確度和重現(xiàn)性。本改進方法可以作為黃芪藥材、飲片、提取物和中成藥中黃芪甲苷質(zhì)量的檢測方法,同時也可以為后續(xù)黃芪甲苷相關(guān)功效研究及功能性食品開發(fā)提供依據(jù)。