郭璐玫,申 璀?,陳文碧

(1.貴州省食品藥品檢驗(yàn)所,貴州 貴陽(yáng)550004；2.貴州萬(wàn)順堂藥業(yè)有限公司,貴州 貴陽(yáng)550018)

養(yǎng)陰口香合劑收載于國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科脾胃分冊(cè)[1],由石斛、茵陳、黃芩、藍(lán)布正、枳殼等12味藥材組成,具有清胃瀉火、滋陰生津、行氣消積之功效。用于胃熱津虧、陰虛郁熱上蒸所致的口臭、口舌生瘡、齒齦腫痛、咽干口苦、胃灼熱痛、腸燥便秘[2]。方中黃芩歸脾經(jīng),具有明顯的清熱瀉火作用。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅有黃芩苷的TLC鑒別項(xiàng),不能全面控制養(yǎng)陰口香合劑中黃芩的質(zhì)量,故本實(shí)驗(yàn)修訂了黃芩的薄層鑒別,并增加了黃芩苷的含量測(cè)定,以期較全面地對(duì)黃芩進(jìn)行質(zhì)量控制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ThermoFisher Ultimate3000(DAD)液相色譜儀,CAMAG薄層點(diǎn)樣儀,瑞士梅特勒托利多AE200型(十萬(wàn)分之一)和XP26型(百萬(wàn)分之一)電子天平,millipore超純水機(jī)制備超純水。

1.2 材料

養(yǎng)陰口香合劑(貴州萬(wàn)順堂藥業(yè)有限公司),黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)：110715-201821,含量以95.4%計(jì)),黃芩對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)：120955-201309)；甲醇、磷酸均為色譜純,水為超純水,其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

本實(shí)驗(yàn)以黃芩對(duì)照藥材、黃芩苷對(duì)照品為指標(biāo)物質(zhì),建立養(yǎng)陰口香合劑中黃芩的薄層色譜鑒別。

2.1.1 供試品溶液的制備[3]取本品2mL,加乙醇8mL稀釋攪拌均勻后過(guò)濾,即得。

2.1.2 缺黃芩陰性供試品溶液的制備 按處方比例稱(chēng)取除黃芩外其他藥材,制成缺黃芩的陰性樣品,同“2.1.1”項(xiàng)下方法制備缺黃芩的陰性供試品溶液。

2.1.3 黃芩對(duì)照藥材溶液的制備 取黃芩對(duì)照藥材1 g,加水20 mL,加熱回流3 h,過(guò)濾,濾液揮至近干,加乙醇10 mL溶解,過(guò)濾即得。

2.1.4 黃芩苷對(duì)照品的制備 取黃芩苷對(duì)照品,加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液,即得。

2.1.5 TLC色譜條件及檢視方法 照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn),吸取上述3種溶液各3～5μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G板上,以正丁醇－冰醋酸－水(7∶1∶2)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,噴以5%三氯化鐵乙醇溶液,置105℃加熱5 min,置日光下檢視。

2.1.6 結(jié)果 供試品色譜中,在與黃芩對(duì)照藥材、黃芩苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的顏色斑點(diǎn),且缺黃芩的陰性供試品無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 黃芩TLC鑒別

2.2 HPLC含量測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)參照現(xiàn)行《中國(guó)藥典》[4]中黃芩的含量測(cè)定方法,選取黃芩苷為指標(biāo)成分,建立養(yǎng)陰口香合劑中黃芩苷的含量測(cè)定方法。

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Xbridge C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流動(dòng)相：甲醇－0.4%磷酸溶液(40∶60)；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10μL。理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計(jì),應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 取黃芩苷對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,加50%乙醇溶液制成每1mL約含黃芩苷40μg的溶液,即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取本品內(nèi)容物,混勻,精密量取2 mL,置50 mL量瓶中,加50%乙醇適量,振搖使之混勻并定容到刻度,搖勻后過(guò)濾,精密量取續(xù)濾液5 mL,置25 mL量瓶中,加50%乙醇定容至刻度,搖勻,用0.45μm的濾頭濾過(guò),即得。

2.2.4 陰性供試品溶液的制備 取缺黃芩陰性樣品,按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備陰性供試品溶液,即得。

2.2.5 專(zhuān)屬性考察 取黃芩苷對(duì)照品溶液、養(yǎng)陰口香合劑供試品溶液及陰性供試品溶液各10μL,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀,供試品溶液色譜在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置有相應(yīng)的色譜峰,且陰性無(wú)干擾,見(jiàn)圖2。

圖2 養(yǎng)陰口香合劑HPLC色譜

2.2.6 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液①(0.403 1 mg/mL)2 mL、5 mL于10 mL容量瓶中,加50%乙醇稀釋至刻度,再分別精密取對(duì)照品溶液②(1.770 1mg/mL)5 mL、7mL于10mL容量瓶中,加50%乙醇稀釋至刻度,得到濃度為0.080 7 mg/mL、0.201 8 mg/mL、0.403 6 mg/mL、0.885 0mg/mL、1.239 0mg/mL、1.770 1 mg/mL的對(duì)照品溶液,分別精密吸取10μL依次注入液相色譜儀,測(cè)定峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo),峰面積Y為縱坐標(biāo),進(jìn)行線(xiàn)性回歸計(jì)算,繪制工作曲線(xiàn),得出線(xiàn)性回歸方程為：Y＝6 125.565 8X＋48.181 4,r＝0.999 8,在0.807 2～17.701μg的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。見(jiàn)表1、圖3。

表1 線(xiàn)性關(guān)系結(jié)果

圖3 線(xiàn)性關(guān)系曲線(xiàn)

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液10μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖峰面積,黃芩苷對(duì)照品的峰面積RSD為0.8%,結(jié)果表明儀器精密度良好。見(jiàn)表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批養(yǎng)陰口香合劑,按“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備6份,按“2.2.1”色譜條件測(cè)定含量,結(jié)果測(cè)得黃芩苷的平均含量為4.427 8 mg/mL,RSD%為0.9%,表明方法重復(fù)性良好。見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取養(yǎng)陰口香合劑供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件,于0h、4h、8h、12h、18h、24h,測(cè)定峰面積,黃芩苷的RSD%為0.2%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。見(jiàn)表4。

2.2.10 回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定含量的養(yǎng)陰口香合劑(黃芩苷含量4.427 8mg/mL)1 mL,置50mL量瓶中,精密加入黃芩苷對(duì)照品溶液(0.177 0 mg/mL)25 mL,振搖混勻,按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液,并按“2.2.1”色譜條件測(cè)定黃芩苷的含量,計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表5,表明有較好的回收率。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n＝6)

2.2.11 樣品含量測(cè)定 取15批養(yǎng)陰口香合劑,按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。見(jiàn)表6。

表6 樣品測(cè)定結(jié)果 (n＝2)

續(xù)表6 樣品測(cè)定結(jié)果 (n＝2)

3 討論

3.1 TLC鑒別

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了3種TLC展開(kāi)方法：①采用含4%醋酸鈉硅膠G薄層板以乙酸乙酯－丁酮－甲酸－水(5∶3∶1∶1)為展開(kāi)劑,噴5%三氯化鐵乙醇溶液,日光下檢視[5]；②采用聚酰胺薄膜以36%乙酸為展開(kāi)劑,在紫外光365 nm下檢視[3]；③采用硅膠G薄層板以正丁醇－冰醋酸－水(7∶1∶2)為展開(kāi)劑,噴5%三氯化鐵乙醇溶液,置105℃加熱5min,日光下檢視[4]。

結(jié)果顯示,方法①分離效果不佳,方法②和方法③均可實(shí)現(xiàn)供試品與黃芩對(duì)照藥材顯相同的顏色斑點(diǎn),且缺黃芩的陰性樣品無(wú)干擾,但方法②采用聚酰胺薄膜為載體,受環(huán)境濕度影響較大,重現(xiàn)性不佳,同時(shí)聚酰胺薄膜的載樣量較小,斑點(diǎn)清晰度較低,故最終選用效果更佳的方法③為養(yǎng)陰口香合劑中黃芩的TLC展開(kāi)方法。

3.2 HPLC含量測(cè)定

黃芩的HPLC含量測(cè)定研究中,取對(duì)照品溶液在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描,黃芩苷在280 nm處有最大吸收,故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。本研究在現(xiàn)行藥典中黃芩的含量測(cè)定所使用的流動(dòng)相甲醇－0.4%磷酸(47∶53)[1]的基礎(chǔ)上,對(duì)養(yǎng)陰口香合劑進(jìn)行洗脫,當(dāng)甲醇－0.4%磷酸的比例為(40∶60)時(shí)黃芩苷的峰型和分離度較好,故采用甲醇－0.4%磷酸(40∶60)作為流動(dòng)相。

本實(shí)驗(yàn)還研究了供試品的提取溶劑,采用水、甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇對(duì)養(yǎng)陰口香合劑進(jìn)行提取,結(jié)果表明,以水為溶劑時(shí),峰型矮塌,理論塔板數(shù)大大降低；以甲醇、50%甲醇為溶劑時(shí),雜峰較多,分離度不好；以乙醇、50%乙醇為溶劑時(shí)雜峰較少,分離度好,50%乙醇的提取效率較乙醇高,故選用50%乙醇為提取溶劑。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃芩的TLC鑒別及HPLC含量測(cè)定的研究,方法可靠穩(wěn)定,簡(jiǎn)便易行,可較全面、可靠地控制養(yǎng)陰口香合劑中黃芩的質(zhì)量,為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升制定提供可靠依據(jù)。