肖婧薇,王文佳,潘衛(wèi)松,陳志明,何華紅,李 薇

(廣州市藥品檢驗所,廣東 廣州510610)

燈盞花素葡萄糖注射液(Breviscapine Glucose Injection,BGI)是臨床上常用的中藥注射劑,其有效成分燈盞花素是從菊科飛蓬屬植物燈盞花中提取出來的黃酮類化合物,具有擴(kuò)張腦血管、冠脈血管和外周血管的作用,臨床上廣泛用于治療缺血性腦血管疾病、冠心病、心絞痛、心肌梗塞等[1-3]。目前,燈盞花素葡萄糖注射液執(zhí)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-10001-(HD-1480)-2003,此標(biāo)準(zhǔn)受當(dāng)時水平的限制,技術(shù)要求相對較低,檢驗項目不完善,安全性檢查僅收載了熱原項目。本研究屬于國家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高工作,旨在現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上,按中國藥典2015年版四部通則的相關(guān)要求對其生物安全性檢查標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提高研究,從而能更有效地保障注射劑的質(zhì)量和安全。

1 實(shí)驗材料

1.1 試藥

燈盞花素葡萄糖注射液(吉林四長制藥有限公司,規(guī)格：250 mL：20 mg,批號：20180301,20810302,20180303)。

1.2 試劑

氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司,規(guī)格：500 mL：4.5 g,批號：H18040602)。滅菌注射用水(山東齊都藥業(yè)有限公司,規(guī)格：500 mL,批號：2A17121802)。鱟試劑A(湛江安度斯生物有限公司,規(guī)格：0.1 mL/支,靈敏度：0.25 EU·mL-1、0.06 EU·mL-1,批號：1712113、1712253)；鱟試劑B(福州新北生化工業(yè)有限公司,規(guī)格：0.1 mL/支,靈敏度：0.25 EU·mL-1、0.06 EU·mL-1,批號：18010812、17091312)；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(湛江安度斯生物有限公司,批號：1806130)。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院,規(guī)格：80EU/支,批號：150601-201784)；磷酸組織胺對照品(中國食品藥品檢定研究院,規(guī)格：20 mg/支,批號：150510-201313)。

1.3 動物

家兔(1.9～2.4 kg,普通級)、白化豚鼠(260～320 g,普通級)由廣州市花東信華實(shí)驗動物養(yǎng)殖場提供,實(shí)驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2014-0023。NIH小鼠(18～20g,SPF級,♀♂各半)由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物中心提供,實(shí)驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2013-0002。本單位實(shí)驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2018-0084。家貓(♂,3.2 kg),購于市場。

1.4 儀器

智能熱原儀(ZRY-2D型,天津天大天發(fā)公司)；六孔恒溫水浴(TW12型,德國Julabo公司)；旋渦混合器(MS 3 basic型,廣州IKA公司)；生物信號采集處理系統(tǒng)(Medlab-U/4C501 H型,南京美易公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 熱原檢查

2.1.1 限值的確定 本品臨床用法為靜脈滴注,1次最多500mL(0.08mg·mL-1),1次/d。人體1 h滴注量以60滴·min-1×60min×0.05mL/滴×0.08 mg·mL-1＝14.4mg·h-1計,人體重量以60 kg計,則臨床劑量為14.4mg·h-1/60 kg＝0.24mg·kg-1·h-1。中藥注射劑的熱原檢查限值一般為人用每千克體重每小時最大供試品劑量的5倍[5],注射體積最大為每千克體重10 mL,可得供試品濃度為0.12 mg·mL-1。而供試品原液濃度為0.08 mg·mL-1,因此擬采用10 mL·kg-1原液注射作為熱原檢查的限值。

2.1.2 熱原檢查 按中國藥典2015年版四部通則1142[6],每批供試品取3只家兔,按10 mL·Kg-1的劑量經(jīng)耳緣靜脈緩慢、勻速注射本品原液,每隔30 min記錄家兔的體溫,共6次,試驗結(jié)束后計算每只家兔體溫升高的數(shù)值和3只家兔體溫升高的總和。結(jié)果受試家兔體溫升高均低于0.6℃,且3只家兔升溫總和均低于1.3℃,3批供試品均符合規(guī)定。

2.1.3 熱原檢查質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)擬定 取本品,依法檢查(中國藥典2015年版四部通則1142),劑量按家兔體重每1 kg緩慢注射10 mL,應(yīng)符合規(guī)定。

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

2.2.1 限值的確定 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的計算公式為L＝K·M-1,其中注射劑K＝5 EU·kg-1·h-1,本品M＝0.24mg·kg-1·h-1。另外考慮到臨床上主要為老年人使用,將安全系數(shù)定為3[5],因此細(xì)菌內(nèi)毒素的限值L＝5/0.24×1/3＝6.9 EU·mg-1。

2.2.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗 按中國藥典2015年版四部通則1143[7]“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”進(jìn)行鱟試劑標(biāo)示靈敏度(λ)的復(fù)核,結(jié)果4批鱟試劑λc均在0.5λ～2.0λ之間,符合進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的規(guī)定。見表1。

表1 TAL靈敏度復(fù)核試驗結(jié)果

2.2.3 干擾預(yù)試驗 根據(jù)市售鱟試劑靈敏度在0.25～0.03 EU·mL-1之間,供試品的最小有效濃度為0.036、0.018、0.009、0.0045 mg·mL-1。取靈敏度為0.25 EU·mL-1的兩個不同廠家的TAL對3批供試品進(jìn)行干擾預(yù)試驗,結(jié)果3批供試品在0.009 mg·mL-1及以下濃度時對兩個廠家鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)無干擾作用。見表2。

表2 供試品干擾預(yù)試驗結(jié)果

2.2.4 正式干擾試驗 將3批供試品分別用BET水稀釋成0.009 mg·mL-1的供試液,同時配制含2λ、λ、0.5λ、0.25λ細(xì)菌內(nèi)毒素的供試液,取靈敏度為0.25EU·mL-1的兩個廠家的TAL進(jìn)行干擾試驗,結(jié)果Es和Et均在0.5λ～2.0λ范圍之內(nèi),3批BGI在0.009 mg·mL-1濃度時對兩個廠家鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)均無干擾作用。見表3。

表3 供試品干擾試驗結(jié)果

續(xù)表3 供試品干擾試驗結(jié)果

2.2.5 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 按中國藥典2015年版四部通則1143進(jìn)行試驗,3批供試品分別用BET水稀釋成0.009 mg·mL-1的供試液,用0.06EU·mL-1靈敏度的鱟試劑(TALA批號：1712253,TALB批號：17091312)進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查,結(jié)果3批供試品均符合規(guī)定。

2.2.6 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)擬定 取本品,依法檢查(中國藥典2015年版四部通則1143),每1mg燈盞花乙素中含細(xì)菌內(nèi)毒素的量應(yīng)小于6.9EU。

2.3 異常毒性檢查

2.3.1 限值的確定 有文獻(xiàn)報道本品小鼠靜脈注射給藥的LD50為267.57 mg·kg-1,95%可信限為248.21～288.44mg·kg-1[4]。本品的臨床體重劑量為0.67 mg·kg-1(人體重量以60 kg計),LD50與臨床體重劑量之比為399.36(大于20),因此異常毒性檢查限值可采用小于LD50可信限下限的1/4～1/8[11],即31.03～62.05mg·kg-1。另外,異常毒性檢查時靜脈注射劑量為0.5mL/只,按每只20g計,供試品的濃度應(yīng)為1.24～2.48mg·mL-1。而供試品原液濃度為0.08mg·mL-1,因此擬采用最高劑量即原液濃度作為異常毒性檢查的限值。

2.3.2 異常毒性檢查 按中國藥典2015年版四部通則1141[8],每批供試品取小鼠5只,每只5 s內(nèi)經(jīng)尾靜脈勻速注射本品原液0.5mL,注射后觀察72 h,記錄小鼠的精神狀態(tài)及存活情況。結(jié)果受試小鼠均未見死亡或毒性反應(yīng),3批供試品均符合規(guī)定。

2.3.3 異常毒性檢查質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)擬定 取本品,依法檢查(中國藥典2015年版四部通則1141),按靜脈注射法給藥,應(yīng)符合規(guī)定。

2.4 過敏反應(yīng)檢查

2.4.1 限值的確定 取豚鼠30只,按10只/批分成3組,按原液1 mL/只靜脈注射觀察30 min,未見異常反應(yīng)。因此,采用原液濃度進(jìn)行過敏反應(yīng)項目的檢查。

2.4.2 過敏反應(yīng)檢查 按中國藥典2015年版四部通則1147[9],每批供試品取豚鼠6只,于試驗第0、2、4天腹腔注射供試品原液0.5 mL進(jìn)行致敏,分別于第14天和第21天取3只豚鼠經(jīng)靜脈注射供試品原液1.0 mL進(jìn)行激發(fā),記錄激發(fā)時豚鼠的體重并觀察激發(fā)后30 min內(nèi)豚鼠有無過敏反應(yīng)的發(fā)生。結(jié)果受試豚鼠體重均增加且均未出現(xiàn)過敏反應(yīng),3批供試品均符合規(guī)定。

2.4.3 過敏反應(yīng)檢查質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)擬定 取本品,依法檢查(中國藥典2015年版四部通則1147),應(yīng)符合規(guī)定。

2.5 溶血與凝集檢查

2.5.1 限值的確定 擬采用最高劑量即原液濃度作為過敏檢查的限值。

2.5.2 溶血與凝集檢查 按中國藥典2015年版四部通則1148[10],經(jīng)家兔心臟采血得到新鮮血液,除去纖維蛋白原后用氯化鈉注射液洗凈,再配制成2%紅細(xì)胞混懸液。每批供試品均按表4所示加入各溶液,混勻后立即置(37±0.5)℃的恒溫水浴中進(jìn)行溫育,3h后觀察溶血與凝集反應(yīng)。結(jié)果1、2號管均未出現(xiàn)溶血或凝集反應(yīng),3批供試品均符合規(guī)定。

表4 供試品溶血與凝集試驗方案 (mL)

2.5.3 溶血與凝集檢查質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)擬定 取本品,依法檢查(中國藥典2015年版四部通則1148),應(yīng)符合規(guī)定。

2.6 降壓物質(zhì)檢查

2.6.1 限值的確定 擬采用最高劑量即1 mL·kg-1原液注射作為降壓物質(zhì)檢查的限值。

2.6.2 降壓物質(zhì)檢查 按中國藥典2015年版四部通則1145[11],取健康家貓,麻醉后經(jīng)靜脈依次注入0.05、0.1、0.15μg·kg-1的磷酸組胺標(biāo)準(zhǔn)品,重復(fù)2～3次。靈敏度符合要求后,按1 mL·kg-1的劑量注入供試品原液,并與0.1μg·kg-1標(biāo)準(zhǔn)品所致的反應(yīng)作比較,結(jié)果見圖1,可見3批供試品均符合規(guī)定。

2.6.3 降壓物質(zhì)檢查質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)擬定 取本品,依法檢查(中國藥典2015年版四部通則1145),劑量按貓體重每1 kg注射1mL,應(yīng)符合規(guī)定。

3 討論

臨床上,中藥注射劑可能出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng),用藥安全得不到有效保障[12,13]。為了提高中藥注射劑的藥品質(zhì)量和使用安全,必須對藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)加以完善和提高。BGI就是其中之一,其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)從2003年執(zhí)行至今,生物安全項目只有熱原檢查一個項目,且采用的是傳統(tǒng)家兔法。因此,提高和完善此品種的生物安全性檢查項目是非常必要的。

熱原檢查是注射劑安全性檢查中必不可少的一項[5]。中藥注射劑由于成分復(fù)雜,極易對細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)產(chǎn)生干擾,其熱原檢查一般首選家兔法。但家兔法靈敏度低,且不符合實(shí)驗動物3R原則,而細(xì)菌內(nèi)毒素法具有準(zhǔn)確高效、靈敏度高、操作方便等優(yōu)點(diǎn),得到了廣泛應(yīng)用。因此,本研究首先考察BGI的熱原檢查項目由家兔法改成細(xì)菌內(nèi)毒素法的可行性。結(jié)果顯示,可使用靈敏度為0.06～0.03 EU·mL-1的鱟試劑對此品種的細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行檢查,其限值為每1mg燈盞花乙素中含細(xì)菌內(nèi)毒素的量應(yīng)小于6.9EU。同時,本研究3批BGI的熱原檢查結(jié)果顯示為均符合規(guī)定,因此將熱原檢查法改為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是可行的。

圖1 供試品降壓物質(zhì)檢查結(jié)果

異常毒性檢查法是檢查藥品在生產(chǎn)制造、制劑過程中外來引入的異物或藥物降解的不正常毒性反應(yīng)的實(shí)驗方法,其目的是檢查藥物的生產(chǎn)工藝水平。在我國,由于制藥行業(yè)起步較晚、底子較薄,藥企的生產(chǎn)工藝水平參差不齊,因此藥品的異常毒性檢查仍然有存在的必要性。尤其對于中藥制劑而言,其生產(chǎn)工藝目前尚處在探索發(fā)展階段,異常毒性檢查對其生產(chǎn)工藝的改進(jìn)和產(chǎn)品的質(zhì)量控制有極其重要的意義。因此,考察BGI進(jìn)行異常毒性檢查的可行性十分必要。本研究證實(shí),BGI可以按藥典通則1141的方法建立異常毒性檢查法。

中藥注射劑的不良反應(yīng)中大部分屬于過敏反應(yīng)[15,16],其中不少嚴(yán)重病例。在對過敏原因研究清楚之前,通過動物實(shí)驗來預(yù)判或考察產(chǎn)品發(fā)生過敏反應(yīng)的可能性非常重要。所以,為了降低臨床用藥風(fēng)險,必須增加BGI的過敏反應(yīng)檢查項目。本研究結(jié)果表明,可以按藥典通則1147的方法建立BGI的過敏反應(yīng)檢查法。

許多中藥注射劑本身含有溶血成分或制劑中輔料具有一定溶血作用,因此,溶血作為中藥注射劑安全性的一個重要指標(biāo),對保證臨床用藥的安全有效有著極為重要的意義。BGI本身為淡黃色溶液,在考察其建立溶血與凝集檢查的可行性時不適用于分光光度法,應(yīng)考慮采用體外試管法。經(jīng)研究,BGI可以按藥典通則1148的方法建立溶血與凝集檢查法。

目前我國上市的絕大部分中藥注射劑均未建立降壓物質(zhì)檢查,但近年來的研究結(jié)果表明中藥注射劑所致的過敏反應(yīng)與家貓血壓下降有一定的相關(guān)性,增加降壓物質(zhì)檢查項目對于控制中藥注射劑的不良反應(yīng)有十分積極的意義[17,18]。因此本研究最后考察了BGI建立降壓物質(zhì)檢查項目的可行性。結(jié)果顯示,可以按藥典通則1145的方法建立BGI的降壓物質(zhì)檢查法。

由于國內(nèi)生產(chǎn)燈盞花素葡萄糖注射液的廠家并不多,本研究只收集到一個廠家的3批次品種,要制定相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚需更多批次的試驗數(shù)據(jù)加以驗證,但本研究的研究結(jié)果為此品種生物安全性檢查標(biāo)準(zhǔn)的完善和提高提供了重要參考。