歐陽文軒

(江蘇康緣陽光藥業(yè)有限公司,江蘇 南京210046)

通塞脈片是由金銀花、石斛、牛膝和甘草等八味中藥制備而成的中藥復(fù)方制劑,它在臨床上可以用來治療脫疽、動(dòng)脈粥樣硬化、腦卒中、腦梗塞、脈管炎等。目前,通塞脈片中的某些有效成分已有研究檢測[1-3],該藥中的牛膝,為“四大懷藥”之一,具有促進(jìn)血液流動(dòng)和通經(jīng)活絡(luò)的功效,還能引導(dǎo)某些藥通達(dá)患肢,其也是通塞脈片的主要功效之一,β-蛻皮甾酮是牛膝中除濕鎮(zhèn)痛、活血通絡(luò)和引諸藥通達(dá)患肢等藥效的代表性有效成分。

目前,通塞脈片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中尚未對牛膝主要有效成分β-蛻皮甾酮進(jìn)行含量測定。在2015版《中國藥典》中[4],已對牛膝藥材中主要有效成分β-蛻皮甾酮制定了相關(guān)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),規(guī)定牛膝按干燥品計(jì)算,含β-蛻皮甾酮(C27 H4407)不得少于0.030%。為更好地對通塞脈片中牛膝有效成分β-蛻皮甾酮進(jìn)行質(zhì)量控制,通過合理優(yōu)化選擇提取溶劑與試驗(yàn)方法,進(jìn)行方法學(xué)研究,從測定方法的專屬性考察、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍、儀器精密度與測量準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性、樣品穩(wěn)定性以及成分回收率等方面著手,對通塞脈片中牛膝的有效成分β-蛻皮甾酮進(jìn)行含量研究。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

LC-2010AHT高效液相色譜儀(日本島津公司,檢測器為LC-2010 detector,LC Solution色譜工作站)；超聲波清洗儀器(KH-500B型,昆山禾創(chuàng)超聲波儀器有限公司)；分析天平(AG135,瑞士梅特勒公司)；DW-調(diào)溫電熱器(上海平環(huán)燃燒設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑

β-蛻皮甾酮對照品(來自中國食品藥品檢定研究院,批號(hào)：111638-200603),乙腈為色譜純(Merck公司),水為純化水,通塞脈片(批號(hào)：160402,生產(chǎn)廠家：江蘇康緣陽光藥業(yè)有限公司),其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的確定

色譜柱為 Wondasil C18(4.6 mm×250 mm,5μm)；流動(dòng)相為乙腈－水－甲酸(15∶85∶0.1),檢測波長為250 nm,柱溫35℃,流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣體積為10μL。具體確定過程如下。

2.1.1 色譜柱的確定 同一色譜條件下,分別對Kromasil C18、Wondasil C18和Hypersil ODS2色譜柱(其規(guī)格均為4.6 mm×250 mm,5μm)進(jìn)行比較,結(jié)果：上述3根色譜柱中用Kromasil C18柱和HypersilODS2柱進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)雜峰較多,基線漂移嚴(yán)重,且不能準(zhǔn)確積峰,分離效果差。而Wondasil C18分離效果較理想,峰形尖銳。因此,本研究采用其中的Wondasil C18色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)。

2.1.2 檢測波長的確定 同一色譜條件下,取一供試品溶液,依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室已有的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn),分別在不同檢測波長(247 nm、248 nm、250 nm)下進(jìn)行試驗(yàn)對比,結(jié)果：檢測波長為250 nm時(shí)的峰形較其他兩個(gè)波長更尖銳,且較對稱,與其他雜質(zhì)峰的分離效果更好。所以,這次實(shí)驗(yàn)檢測波長選用250 nm。

2.1.3 流動(dòng)相的確定 同一色譜條件下,以乙腈－水－甲酸(16∶84∶0.1)、乙腈－水－甲酸(16∶84∶0.2)、乙腈－水－甲酸(15∶85∶0.1)、乙腈－水－甲酸(14∶86∶0.1)和甲醇－水－磷酸(16∶84∶0.1)5種流動(dòng)相進(jìn)行比較。結(jié)果：以乙腈－水－甲酸溶液(15∶85∶0.1)為流動(dòng)相色譜分離效果最理想,β-蛻皮甾酮峰的保留時(shí)間比較適中；使用甲醇－水－磷酸系統(tǒng)得到的峰分離效果較差。所以,本文采用乙腈－水－甲酸溶液(15∶85∶0.1)為流動(dòng)相。

2.1.4 理論塔板數(shù)的確定 經(jīng)對3批樣品進(jìn)行測定,樣品中β-蛻皮甾酮峰和其他雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離時(shí)的理論塔板數(shù)均大于10 000。故本方法理論塔板數(shù)按β-蛻皮甾酮峰計(jì)應(yīng)不低于10 000。

2.2 供試品溶液制備方法的確定

2.2.1 提取方法的探索[5-6]取本品20片,除去包衣后研細(xì),取2g,平行精密稱取3份,置具塞錐形瓶中,分別加甲醇50 mL,精密稱重。分別密塞超聲30 min,45 min和60min,放至室溫,分別精密稱定重量,用甲醇補(bǔ)重,搖勻,濾過,蒸干,殘?jiān)铀?0 mL使溶解,加水飽和正丁醇萃取3次,每次30 mL,合并正丁醇液,蒸干,殘?jiān)蛹状际谷芙?轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,進(jìn)樣測定β-蛻皮甾酮含量。結(jié)果：超聲30 min的含量為0.152 5 mg/mL,超聲45min的含量為0.200 7 mg/mL,超聲60 min的含量為0.202 0mg/mL。為更好地節(jié)約時(shí)間和成本,本實(shí)驗(yàn)確定超聲時(shí)間為45 min。

由于β-蛻皮甾酮極性較大,依據(jù)“相似相溶”原理,溶于極性大的溶劑,易溶于正丁醇,微溶于乙酸乙酯和三氯甲烷,在乙醚中幾乎不溶。因此,考察用甲醇和乙醇作為超聲提取溶劑,用水飽和正丁醇溶液和乙酸乙酯溶液作為萃取劑。

取本品20片,除去包衣后研細(xì),取2 g,平行精密稱取4份,置具塞錐形瓶中,其中2份各加甲醇50mL,其余2份各加乙醇50 mL,精密稱重,密塞,超聲45 min,放至室溫,分別精密稱定重量,用甲醇補(bǔ)重,搖勻,濾過,蒸干,殘?jiān)铀?0 mL使溶解,用甲醇試劑超聲的2份分別加水飽和的正丁醇溶液和乙酸乙酯各萃取3次(每次30 mL),合并正丁醇液,蒸干,殘?jiān)蛹状际谷芙?轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,進(jìn)樣測定β-蛻皮甾酮含量。加乙醇超聲的2份做法同上。結(jié)果：用甲醇溶液超聲,水飽和正丁醇溶液萃取測得的含量為0.204 3 mg/mL,乙酸乙酯萃取測得的含量為0.031 8 mg/mL；用乙醇溶液超聲,水飽和正丁醇溶液萃取測得的含量為0.191 6 mg/mL,乙酸乙酯萃取測得的含量為0.026 8mg/mL。因此,確定超聲提取溶劑為甲醇溶液,萃取溶劑為水飽和正丁醇溶液。

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液制備 取本品20片,除去包衣后研細(xì),取2g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加甲醇50mL,精密稱定重量,密塞,超聲45min,放冷至室溫,用甲醇補(bǔ)重,搖勻,濾過,蒸干,殘?jiān)铀?0 mL使溶解,加水飽和的正丁醇溶液萃取3次,每次加30 mL,合并正丁醇液,蒸干,殘?jiān)蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至5mL的量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得。

2.3.2 對照品溶液制備 取β-蛻皮甾酮對照品適量,精密稱定,加甲醇定容至25 mL,得到1.006 8 mg/mL和1.087 0 mg/mL的溶液,作為對照品母液。

2.3.3 陰性對照溶液制備 除牛膝外,其他七味中藥,按照國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)(試行)YBZ08372004中通塞脈片(薄膜衣)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的處方比例和生產(chǎn)制備方法,制備出陰性樣品,依據(jù)“2.3.1”項(xiàng)中的供試品制備方法,制備出陰性對照溶液。見圖1、圖2、圖3。

圖1 對照品色譜

圖2 供試品溶液色譜

圖3 陰性供試品溶液色譜

2.4 專屬性試驗(yàn)

精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10μL,進(jìn)樣,測定。結(jié)果顯示：供試品溶液的色譜圖在與對照品溶液色譜圖相應(yīng)位置上,有相同保留時(shí)間的吸收峰,陰性對照品溶液色譜圖上則無相應(yīng)吸收峰。說明本方法測定β-蛻皮甾酮含量專屬性強(qiáng),無陰性干擾。

3 方法學(xué)考察

3.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取β-蛻皮甾酮對照品溶液(1.006 8 mg/mL)0.5 mL,0.6mL,0.8mL,0.9mL,1.0mL,1.1mL置10mL的容量瓶中,各加甲醇至刻度,搖勻,即得。得到濃度分別為0.050 34 mg/mL,0.060 41 mg/mL,0.080 54 mg/mL,0.090 61mg/mL,0.100 68 mg/mL和0.110 75 mg/mL的對照品溶液,取上述各濃度對照品溶液進(jìn)行測定,進(jìn)樣體積均為10μL,按照“2.1”項(xiàng)中色譜條件,以β-蛻皮甾酮的峰面積(Y?10^3)為縱坐標(biāo),對照品的含量(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X),進(jìn)行線性回歸分析,所得的回歸方程為y＝14 384x－7.280 1,r＝0.999 8(n＝6),β-蛻皮甾酮在0.503 4～1.107 5μg范圍內(nèi)與峰面積擁有良好的線性關(guān)系。見表1和圖4。

表1 β-蛻皮甾酮線性關(guān)系考察結(jié)果

圖4 線性關(guān)系考察

3.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取10μL濃度為0.080 54mg/mL的β-蛻皮甾酮對照品溶液,在“2.1”項(xiàng)中的色譜條件下,連續(xù)進(jìn)樣6次,β-蛻皮甾酮對照品溶液峰面積依次為1 165 843,1 153 489,1 159 742,1 160 225,1 160 733,1 157 950,其平均峰面積為1 159 664,RSD%為0.35%(n＝6),結(jié)果顯示,該儀器精密度良好。具體結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同批號(hào)通塞脈片(批號(hào)：160317),同法平行制備6份供試品溶液,各精密吸取10μL進(jìn)行測定。結(jié)果：6份供試品溶液β-蛻皮甾酮的平均含量為0.132 0mg/g,RSD值為1.30%(n＝6),結(jié)果顯示,用“2.3.1”項(xiàng)中的方法制備樣品有良好的重復(fù)性,結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)中的色譜條件下,每隔2小時(shí)進(jìn)樣1次,連續(xù)進(jìn)樣7次,供試品中β-蛻皮甾酮峰面積分別為730 021、728 970、725 414、718 574、708 730、704 669、703 767；平均峰面積為717 164,RSD為1.59%(n＝7),結(jié)果顯示,該方法下制備的供試品溶液在12 h內(nèi)擁有良好的穩(wěn)定性。具體結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已知β-蛻皮甾酮含量的樣品(批號(hào)：160402,含量為0.060 9mg/mL)3份,分別加入β-蛻皮甾酮對照品0.15mg,0.30 mg,0.45 mg,按照“2.3.1”項(xiàng)中供試品溶液的制備方法和“2.1”項(xiàng)中色譜條件進(jìn)行操作,每次進(jìn)樣10μL,分析數(shù)據(jù)結(jié)果,計(jì)算加樣回收率和RSD值,平均加樣回收率為96.86%,RSD%為1.14%。結(jié)果顯示,該方法準(zhǔn)確度良好,具體結(jié)果見表5、表6。

表5 批號(hào)160402樣品測定

表6 加樣回收結(jié)果

4 討論

在提取方法的考察中,本次試驗(yàn)僅選用了操作方便的超聲作為考察對象。對于回流提取等其他方法的提取效果仍需進(jìn)一步考察。萃取劑只考察了水飽和正丁醇以及乙酸乙酯溶液,還可用其他極性較大且不溶于水的有機(jī)溶劑進(jìn)一步考察。

在本次試驗(yàn)中,測定不同批次的通塞脈片,發(fā)現(xiàn)其中β-蛻皮甾酮的含量存在差別。對于這一問題分析,β-蛻皮甾酮的含量差別與不同批次使用的牛膝藥材質(zhì)量有關(guān)。有研究報(bào)道,梁潔等[7]與潘琦等[8]均對不同產(chǎn)地牛膝中β-蛻皮甾酮含量進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示不同產(chǎn)地的牛膝中β-蛻皮甾酮的含量也有所不同,河南省所產(chǎn)牛膝中β-蛻皮甾酮的含量最高。因此,購進(jìn)的牛膝藥材對該制劑中β-蛻皮甾酮的含量高低有著重要影響,應(yīng)從投料環(huán)節(jié)的原藥材的質(zhì)量進(jìn)行控制。

綜上,若制定β-蛻皮甾酮在該制劑中的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),需要對不同批次的牛膝藥材進(jìn)行β-蛻皮甾酮的含量測定,也需對其制備工藝中各個(gè)關(guān)鍵步驟進(jìn)一步考察。同時(shí),應(yīng)該選取更多批次的通塞脈片,使用本試驗(yàn)中確定的方法,測定該制劑中β-蛻皮甾酮的含量,通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,制定該制劑中β-蛻皮甾酮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),控制生產(chǎn)中該制劑牛膝的質(zhì)量,從而提高該制劑的有效性。