蔣鵬飛,吳大力,彭 俊,彭清華1,?

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長沙410208；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧530023；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙410007；4.中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點實驗室,湖南 長沙410208)

隨著激光在眼科檢查及治療中的廣泛應(yīng)用,由激光所致的醫(yī)源性視網(wǎng)膜光損傷也越來越多,許多眼科疾病的發(fā)生與視網(wǎng)膜長期光照的積累效應(yīng)有關(guān)[1,2],如老年性黃斑變性等。中藥材蠐螬在眼科的應(yīng)用較早,早在《晉書》中就有此藥治療目疾的記載：“吳中書郎戰(zhàn)沖,母王氏失明,婢取蠐螬蒸熟與食,王以為美,沖還知之,抱母慟哭,母目即開?！睘橛^察不同劑量蠐螬提取物對光損傷后視網(wǎng)膜變性組織凋亡的作用,本實驗對視網(wǎng)膜光損傷后凋亡因子Fas、Fas L的表達進行了檢測。

1 材料

1.1 實驗動物

選用30只健康實驗性兔,均為雄性,體重1.8～2.3 kg(湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室提供,合格證號：醫(yī)動字第20-002號)。

1.2 主要儀器

電子秤(上海天平儀器廠,JY0001)；眼科手術(shù)顯微鏡(蘇州醫(yī)療器械設(shè)備廠,YZZOT)；PCR儀(德國,Biometra)；凝膠成像系統(tǒng)(美國,Bio-Rad[Gel Doc XR＋])；微量移液器(德國,eppendorf[1 mL/200μL/10μL])；垂直板電泳槽(北京六一儀器廠,DYCZ-24D)；臺式高速冷凍離心機(Thermo)；水平電轉(zhuǎn)槽(北京六一儀器廠,DYCP-40C)；超純水儀(millipore公司)；紫外可見分光光度計(上海spectrum公司,SP-752)；恒溫搖床(金壇,THZ-82A)；水平搖床(北京六一儀器廠,WD-9405B)；壓片夾(koda)；掃描儀(日本Canon,9000F MarkⅡ)。

1.3 主要實驗藥品和試劑

蠐螬提取物(參照譚涵宇所用制備方法[3]制取)；Harris蘇木素(湖南中醫(yī)藥大學(xué)病理實驗室,批號：71020784)；PV9000型二抗試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司,批號：zb-5301)；細胞裂解液(江蘇碧云天,批號：P0013)；RIPA蛋白裂解液(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號：G2002)；ECL發(fā)光試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號：G2014)；Bradford蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天,批號：P0006)；轉(zhuǎn)移緩沖液(武漢賽維爾生物科技有限公司,G2017)；羊抗兔二抗(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號：GB23303)。

2 實驗方法

2.1 分組方法

通過隨機數(shù)字表法將30只實驗性兔評價分為空白組(A)、模型組(B)、蠐螬低劑量組(C)、蠐螬中劑量組(D)、蠐螬高劑量組(E)。

2.2 造模方法

采用自制光化學(xué)損傷裝置[3]對實驗動物進行光照,總光照時間為36h。A組不施行光損傷造模。

2.3 給藥方法

A、B組每日以生理鹽水5 mL/kg灌胃；C組按照0.45 g/kg配成5mL蠐螬提取物混懸液；D組按照成人日用量10倍劑量灌胃,將0.9 g/kg蠐螬提取物配成5 mL蠐螬提取物混懸液；E組按照成人日用量20倍劑量灌胃,將1.8g/kg蠐螬提取物配成5 mL蠐螬提取物混懸液,每日灌胃1次,灌胃14天。

2.4 取材方法

灌胃結(jié)束后24h取材。將動物處死后,剪開眼球壁,剝離激光斑部位視網(wǎng)膜,脫水、石蠟包埋后切片烘干備用。從每組眼球中選取1只用于HE染色和免疫組化檢測,另只眼球用于Western blot檢測Fas、FasL蛋白表達。

2.5 指標(biāo)檢測

2.5.1 HE染色觀察標(biāo)本視網(wǎng)膜細胞結(jié)構(gòu) 經(jīng)脫水、脫蠟、染色、封片等步驟,觀察視網(wǎng)膜組織在光學(xué)顯微鏡下的細胞結(jié)構(gòu)。

2.5.2 Fas、FasL免疫組化檢測 石蠟切片脫蠟,用PBS沖洗3次,3%H2O2室溫孵育10 min,蒸餾水沖洗,滴加Fas、FasL單克隆抗體,室溫或37℃孵育1～2 h,PBS沖洗2min×3次,滴加一抗,沖洗后滴加二抗,復(fù)染,封片。在高倍率顯微鏡下隨機選擇5個視網(wǎng)膜視野測量各個指標(biāo)陽性積分光密度。

2.5.3 Western blot法檢測視網(wǎng)膜Fas、Fas L蛋白表達組織塊剪碎、裂解,測定蛋白質(zhì)含量,加電轉(zhuǎn)移緩沖液,顯色后對圖像進行灰度分析。

2.6 統(tǒng)計分析方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行正態(tài)性和方差齊性檢驗,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組實驗性兔視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果

A組：實驗性兔視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次分明；B組：視網(wǎng)膜層次結(jié)構(gòu)模糊,分界不清,出現(xiàn)不規(guī)則淡染；C組：視網(wǎng)膜外核層胞核排列較疏松；D組：視網(wǎng)膜外核層增厚,視網(wǎng)膜外核層胞核排列較整齊密集；E組：視網(wǎng)膜外核層胞核排列較整齊,厚度有增加。見圖1。

3.2 蠐螬對兔視網(wǎng)膜Fas、FasL表達影響的免疫組化結(jié)果

A組視網(wǎng)膜外核層細胞漿中Fas、FasL含量較少。B組視網(wǎng)膜外核層細胞漿中Fas、FasL陽性物質(zhì)彌漫分布,含量較多,與A組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。C、D、E組視網(wǎng)膜外核層細胞漿中Fas、FasL陽性物質(zhì)有不同程度減少,與模型組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

圖1 各組實驗性兔視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果

表1 組間兔視網(wǎng)膜Fas、FasL表達的比較 (±s)

表1 組間兔視網(wǎng)膜Fas、FasL表達的比較 (±s)

注：與A組比較,＊P＜0.05；與B組比較,▲P＜0.05。

組別 眼數(shù)(只) Fas積分光密度(×106)FasL積分光密度(×106)A組 6 2.64±0.27 2.39±0.12 B組 6 5.11±0.36＊ 6.30±0.11＊C組 6 3.98±0.43＊▲ 4.23±1.31＊▲D組 6 3.68±0.47＊▲ 3.96±0.48＊▲E組 6 3.88±0.39＊▲ 4.01±1.00＊▲

3.4 蠐螬對兔視網(wǎng)膜Fas蛋白表達影響的WB結(jié)果

與A組相比,B、C、D、E組Fas、Fas L蛋白表達均明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與B組相比,C、D、E組Fas、Fas L蛋白表達降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與C組相比,D組、FasL蛋白表達降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 各組間兔視網(wǎng)膜Fas、FasL蛋白表達的比較 (±s)

注：與A組比較,＊P＜0.05；與B組比較,▲P＜0.05。

組別 眼數(shù)(只) Fas FasL A組 6 0.27±0.13 0.21±0.10 B組 6 0.69±0.15＊ 0.68±0.11＊C組 6 0.45±0.07＊▲ 0.48±0.09＊▲D組 6 0.38±0.14＊▲ 0.40±0.22＊▲E組 6 0.39±0.09＊▲ 0.43±0.12＊▲

4 討論

眼底激光作為高能量的單色光,其對視網(wǎng)膜的灼傷屬于眼外傷范疇,多導(dǎo)致視衣氣陰受損,氣虛血瘀。目珠脈道幽深細微,經(jīng)絡(luò)分布周密,氣血縱橫貫?zāi)?若激光灼傷目珠,氣陰受損,脈絡(luò)瘀滯,使神光發(fā)越受阻,視功能減退。目得陰血而能視,氣脫者目不明,神光賴其真氣真血真精之滋養(yǎng),方能明視萬物。益氣則神光有所滋養(yǎng),同時,氣旺以促血行；活血化瘀則目珠脈道通暢,氣血可以縱橫貫?zāi)?神光方能有所發(fā)越。故治療常以益氣活血化瘀為主,輔以養(yǎng)陰利水。

蠐螬是金龜子科昆蟲朝鮮黑金龜子或其他近緣昆蟲的干燥幼蟲,屬蟲類藥,味咸微溫,有毒,有破血、行瘀、散結(jié)、通乳之功效,早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中有記載：“主惡血血瘀痹氣,破折血在脅下堅滿痛,月閉,目中淫膚、青翳白膜。”從蠐螬中維生素含量測定結(jié)果看,B族維生素含量較高,維生素A和維生素E的含量也較豐富。維生素B1和煙酸能促進血液循環(huán),維生素B2能緩解眼睛疲勞、預(yù)防白內(nèi)障,維生素A有增強機體免疫功能的作用,維生素E是抗氧化維生素。蠐螬滴中含有大量天門冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸等氨基酸與Zn、Fe作用可以緩解組織缺氧缺血,有活血化瘀之效,可針對視網(wǎng)膜光損傷的脈絡(luò)瘀滯進行治療。

由于持續(xù)的光照,活性脂肪酸代謝和高氧消耗,視網(wǎng)膜光感受器細胞發(fā)生慢性氧化應(yīng)激[4,5],導(dǎo)致細胞內(nèi)循環(huán)和降解減少,誘導(dǎo)視網(wǎng)膜感光細胞的凋亡[6]。感光細胞的大量凋亡是視網(wǎng)膜光損傷后視力下降的主要原因[7,8]。

Fas/Fas L系統(tǒng)介導(dǎo)的受體途徑是細胞凋亡的經(jīng)典途徑之一[9]。Fas主要表達于眼和睪丸[10],Fas L是Fas的天然配體,兩者結(jié)合后,可以激活細胞凋亡途徑中的死亡受體凋亡途徑,引起細胞凋亡[11,12],如Fas/FasL信號通路可影響白血病細胞的凋亡[13],抗腫瘤效應(yīng)B細胞通過Fas/FasL系統(tǒng)的凋亡途徑可直接殺死腫瘤細胞[14]。所以Fas/Fas L系統(tǒng)一直都是細胞凋亡研究的熱點,研究表明[15]Fas/Fas L觸發(fā)的細胞凋亡導(dǎo)致視網(wǎng)膜感光細胞的死亡。

本實驗發(fā)現(xiàn)模型組Fas、FasL表達增加,蠐螬中、高劑量治療組Fas、Fas L表達減少,提示視網(wǎng)膜光損傷可能通過激活細胞凋亡通路,引起光感受器細胞凋亡從而引起視網(wǎng)膜損傷；蠐螬可能通過抑制細胞凋亡通路,對視網(wǎng)膜光損傷起到保護作用。

綜上所述,蠐螬通過抑制Fas蛋白、FasL蛋白的相對表達,保護視網(wǎng)膜感光細胞,改善視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu),改善了視功能。其療效與劑量相關(guān),中、高劑量療效較好。