丁永芳,錢海兵,朱廣旗,袁青青,李 夢

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院,貴州 貴陽550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,貴州 貴陽550025；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,貴州 貴陽550025)

腦缺血是一種在臨床上具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率等特點(diǎn),嚴(yán)重威脅人類健康的一類疾病。近年來,對腦缺血的研究取得了很大進(jìn)展,一般認(rèn)為腦缺血或缺血性腦中風(fēng)是由于腦內(nèi)血液供應(yīng)障礙導(dǎo)致大腦某區(qū)域缺血、缺氧,從而引起包括氨基酸興奮毒性,細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、氧化、氮化應(yīng)激形成,炎癥損傷、血腦屏障損傷、線粒體能量障礙以及細(xì)胞凋亡等一系列病理生理學(xué)過程[1]。近年來,對于腦缺血損傷機(jī)制研究已經(jīng)達(dá)到分子和基因水平,治療靶點(diǎn)主要集中在興奮毒性、氧化應(yīng)激、免疫炎癥、凋亡等導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的環(huán)節(jié),但是目前仍然缺乏安全有效的腦缺血治療藥物[2]。通竅化栓顆粒是以通竅化栓湯為基礎(chǔ)研制的治療腦卒中的現(xiàn)代苗藥制劑,通竅化栓湯源于貴州省苗族民間經(jīng)驗(yàn)方,主要由大血藤、飛龍掌血、土三七、金毛狗脊等苗藥組成,具有活血化瘀、舒筋活絡(luò)之效。臨床應(yīng)用表明,通竅化栓湯對治療缺血性腦血管病有較好的療效[3],在中風(fēng)病的治療中顯示出明顯優(yōu)勢。筆者根據(jù)其功效,采用H2O2損傷的PC12細(xì)胞模型及局灶性腦缺血大鼠模型觀察通竅化栓顆粒對腦缺血損傷細(xì)胞凋亡的影響,探討苗藥制劑通竅化栓顆粒對腦缺血的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物與試劑

通竅化栓顆粒,由貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院提供(批號：20150401)；血塞通片(云南維和藥業(yè)股份有限公司,產(chǎn)品批號：140642)；胎牛血清,由杭州四季青生物材料研究所提供；MTT(噻唑蘭,Sigma)；雙抗,青霉素、鏈霉素(Sigma,雙蒸水溶解,過濾除菌,根據(jù)需要控制藥物劑量)；0.125%胰酶溶液；75%乙醇。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠60只,SPF級,雌雄兼有,體重180～220 g,由中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號：SCXK(軍)2012-0011。

SD大鼠20只,雌雄各半,體重280～320g,由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(SCXK黔2002-0001)。

實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置：符合2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

栓線,北京西濃科技有限公司；臺式離心機(jī)(TDL-40B),Anke；電子分析天平(FA1004A),上海精密科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀(Infinite M200),北京新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司；二氧化碳培養(yǎng)箱,本三洋機(jī)電有限公司；光學(xué)顯微鏡(Leica),國Leica Micosystems Ltd；濾器、濾膜(孔徑0.22μm),華美生物工程；6孔、24孔、96孔板,北京COSTAR公司；超凈工作臺(TDGC2J-0.5),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；紫外可見分光光度計(jì)(TU180),北京普析儀器有限責(zé)任公司；三用紫外分析儀,上海華康生化儀器制造廠；2135型石蠟切片機(jī),德國Leica公司；H-600IV型透射電鏡,日本日立公司；BX46型Olympus照相顯微鏡,日本奧林巴斯公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株

PC12細(xì)胞株,購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對H2O2致PC12細(xì)胞損傷的影響

2.1.1 通竅化栓顆粒含藥血清的制備 將SD大鼠12只隨機(jī)分為3組：正常動(dòng)物組、通竅化栓給藥組、陽性藥組,雌雄各半,正常組灌胃蒸餾水,通竅化栓組和陽性對照組按照人臨床用藥量的40倍灌服通竅化栓顆粒和陽性藥懸浮液,連續(xù)5 d,末次給藥后1 h,清醒狀態(tài)下進(jìn)行股動(dòng)脈采血,血清在室溫下放置30 min,3 000 r/min離心10 min,分離血清,合并同組動(dòng)物血清,56℃水浴30 min,滅活補(bǔ)體,－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 通竅化栓顆粒劑量的選擇 取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞完全貼壁后,加入100μL不同濃度含藥血清(通竅化栓顆粒、陽性藥物)的培養(yǎng)基,濃度分別為50%、25%、12.5%、6.25%,共設(shè)5個(gè)濃度組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用MTT法檢測細(xì)胞活力。

計(jì)算含藥血清各個(gè)濃度下的細(xì)胞抑制率,以細(xì)胞抑制率＜10%時(shí)的含藥血清濃度為最大無毒劑量。

2.1.3 H2O2致細(xì)胞損傷濃度的確定 取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞完全貼壁后,加入100μL含不同濃度H2O2的培養(yǎng)基,濃度分別為0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L,設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)2h后置顯微鏡下觀察藥物的作用效果,濃度階梯稱取102mg 30%H2O2(H2O2分子量為34,密度為1.11g/cm3),加入1mL無血清培養(yǎng)基,得到0.9mol/L的H2O2溶液,一共設(shè)置12個(gè)濃度；用MTT法檢測細(xì)胞活力。

計(jì)算含藥血清各個(gè)濃度下的細(xì)胞抑制率,以細(xì)胞抑制率＜10%時(shí)的含藥血清濃度為最大無毒劑量。

2.1.4 通竅化栓顆粒含藥血清對PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用 取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞完全貼壁后,將其分為6組：①通竅化栓顆粒高劑量組(30%含藥血清＋H2O2)；②通竅化栓顆粒中劑量組(20%含藥血清＋H2O2)；③通竅化栓顆粒低劑量組(10%含藥血清＋H2O2)；④陽性對照組(20%陽性血清＋H2O2)；⑤模型對照組(20%空白血清＋H2O2)；⑥空白對照組(20%空白血清200μL)。每一濃度設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔,放在37℃、5%CO2的孵箱中繼續(xù)孵育48 h；用MTT法檢測計(jì)算通竅化栓顆粒對H2O2致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

2.2 對線栓致局灶性腦缺血大鼠模型的影響

2.2.1 動(dòng)物分組及模型建立 取健康大鼠60只,雌雄各半,隨機(jī)分為假手術(shù)組,模型組,通竅化栓顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組及陽性對照組6組,每組10只,參照文獻(xiàn)方法[4]制備大鼠局灶性腦缺血模型。

2.2.2 給藥 術(shù)后第2天,按照通竅化栓混懸液高、中、低劑量組大鼠以1 mL/100 g灌胃給藥(分別為7、3.5、1.75 g/kg),陽性對照組灌胃血塞通片(給藥劑量為50 mg/kg),模型對照組及假手術(shù)組灌胃等體積的生理鹽水。每天給藥1次,連續(xù)給藥7 d。

2.2.3 對腦缺血水腫的影響 腦含水量檢測：末次給藥后,動(dòng)物禁食(不禁水)12 h,用4%水合氯醛腹腔注射大鼠麻醉,立即于冰臺上快速斷頭處死,取出全腦,稱腦濕重,然后在80℃烤箱中烘干至恒溫,稱腦干重,計(jì)算水腫指數(shù),計(jì)算公式：水腫指數(shù)＝(濕重－干重)/濕重×100%。

2.2.4 對腦組織病理改變的影響 末次給藥后,動(dòng)物禁食(不禁水)12 h,用4%水合氯醛腹腔注射大鼠麻醉,立即于冰臺上快速斷頭處死,取出全腦,將大鼠腦組織浸泡于10%福爾馬林中固定,常規(guī)HE染色,觀察大腦組織。按病變占組織塊的30%以下1分,占%30～50%2分,占50%以上3分,將所有評分累加即得神經(jīng)系統(tǒng)損傷評分。

2.2.5 對Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響 將組織制作成4μm厚度切片,分別進(jìn)行BAX(Santa公司)和BCL-2(Santa公司)標(biāo)記,二抗和顯色系統(tǒng)(基因公司),設(shè)立已知BAX和BCL-2陽性的大腦星型細(xì)胞瘤組織為陽性對照,用PBS替代一抗為陰性對照。BAX和BCL-2陽性出現(xiàn)棕黃色顆粒,主要陽性定位在細(xì)胞胞質(zhì)中。隨機(jī)選取5個(gè),置400倍顯微鏡下觀察大腦中細(xì)胞,計(jì)數(shù)其中500個(gè)細(xì)胞,其中陽性細(xì)胞除以5即為該例的平均陽性細(xì)胞數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)。多組間比較采用ANOVA分析,再用LSD進(jìn)行兩兩比較,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 通竅化栓顆粒對H2O2致PC12細(xì)胞損傷的影響

4.1.1 通竅化栓顆粒含藥血清最大無毒劑量的測定結(jié)果 結(jié)果表明,含藥血清最大無毒劑量以30%為宜,空白血清、陽性藥物血清以20%為宜。見表4。

圖4 各濃度H2O2下PC12細(xì)胞生長抑制率

表4 各含藥血清濃度下PC12細(xì)胞生長抑制率 (%)

4.1.2 H2O2濃度的篩選結(jié)果 采用MTT法檢測不同濃度H2O2對PC12細(xì)胞生長抑制情況的影響。H2O2對PC12細(xì)胞的影響抑制率從90%到3%,H2O2濃度越高,PC12細(xì)胞存活率逐漸下降。選用中位數(shù)以0.2 mmol/L濃度50%抑制率作為本研究中H2O2的干預(yù)濃度。見圖4。

4.1.3 通竅化栓顆粒含藥血清對PC12細(xì)胞的保護(hù)作用 與對照組相比,模型組細(xì)胞存活率顯著降低；與模型組相比,不同濃度(30%,20%,10%含藥血清)的通竅化栓顆粒組細(xì)胞存活率明顯增高。研究表明,含藥血清對H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。見圖5。

圖5 含藥血清細(xì)胞MTT吸光度

4.2 通竅化栓顆粒對腦缺血水腫的影響

研究結(jié)果表明,通竅化栓顆粒可減輕局灶性腦缺血大鼠的腦水腫狀況,與模型組比較,通竅化栓顆粒高、中、低劑量組的水腫指數(shù)顯著改善(P＜0.05)。說明通竅化栓顆粒可以減輕腦缺血導(dǎo)致的腦水腫。見表1。

表1 通竅化栓顆粒對局灶性腦缺血模型大鼠腦組織水腫的影響 (±s)

表1 通竅化栓顆粒對局灶性腦缺血模型大鼠腦組織水腫的影響 (±s)

注：與假手術(shù)組比較,?P＜0.05；與模型組比,＃P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)(n)劑量(g/kg) 水腫指數(shù)(/10g)假手術(shù)組 10 - 7.86±0.20模型組 10 - 8.17±0.19?陽性組 10 0.05 7.91±0.11＃高劑量組 10 7.00 7.99±0.11＃中劑量組 10 3.50 8.01±0.07＃低劑量組 10 1.75 8.09±0.16＃

4.3 HE觀察

除假手術(shù)組外,其余各組腦灶性區(qū)域細(xì)胞結(jié)構(gòu)均有損傷,光鏡下均可見腦灶性區(qū)域間質(zhì)水腫、血管充血、膠質(zhì)細(xì)胞增生,與假手術(shù)組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組相比,通竅化栓顆粒各給藥組及陽性對照組腦灶性區(qū)域HE組織切片上,均可觀察到神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)病理損傷減輕(P＜0.05)。見表2和圖1。

表2 通竅化栓顆粒對局灶性腦缺血模型大鼠腦組織病理損傷的影響 (±s)

表2 通竅化栓顆粒對局灶性腦缺血模型大鼠腦組織病理損傷的影響 (±s)

注：與假手術(shù)組比較,?P＜0.05；與模型組比,＃P＜0.05。

組別 評分假手術(shù)組(n＝6) 1.00±1.10模型組(n＝6) 10.50±0.55?陽性對照組(n＝6) 5.33±0.52?＃低劑量組(n＝6) 9.17±1.17?＃中劑量組(n＝6) 8.83±0.98?＃高劑量組(n＝6) 5.17±0.75?＃

4.4 通竅化栓顆粒對腦組織BAX、BCL-2陽性表達(dá)的影響

BAX免疫組織化學(xué)標(biāo)記顯示,各組均有膠質(zhì)細(xì)胞陽性表達(dá)。模型組腦組織Bax陽性細(xì)胞密度顯著增多,與假手術(shù)組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。通竅化栓顆粒各劑量組及陽性對照組Bax陽性細(xì)胞密度顯著減少,與模型組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3和圖2。BCL-2免疫組織化學(xué)標(biāo)記顯示,各組均有小膠質(zhì)細(xì)胞陽性表達(dá),模型組腦組織Bcl-2陽性的細(xì)胞密度均顯著減少,與假手術(shù)組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。通竅化栓顆粒各劑量組及陽性對照組腦組織Bcl-2陽性的細(xì)胞密度均顯著增多,與模型組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3和圖3。

圖1 HE觀察(×100)

圖3 通竅化栓顆粒對局灶性腦缺血模型大鼠腦組織BCL-2陽性表達(dá)的影響(×100)

表3 通竅化栓顆粒對局灶性腦缺血模型大鼠腦組織BAX、BCL-2陽性表達(dá)的影響 (±s)

表3 通竅化栓顆粒對局灶性腦缺血模型大鼠腦組織BAX、BCL-2陽性表達(dá)的影響 (±s)

注：與假手術(shù)組相比,?P＜0.05；與模型組相比,＃P＜0.05。

組別 Bax BCL-2假手術(shù)組(n＝6) 7.03±2.56 15.66±1.41模型組(n＝6) 60.03±10.73? 9.06±0.63?陽性對照組(n＝6) 33.26±2.02?＃ 58.87±0.73?＃低劑量組(n＝6) 46.93±5.88?＃ 50.53±1.28?＃中劑量組(n＝6) 47.07±5.90?＃ 50.57±1.32?＃高劑量組(n＝6) 33.93±1.13?＃ 59.27±1.81?＃

圖2 通竅化栓顆粒對局灶性腦缺血模型大鼠腦組織BAX陽性表達(dá)的影響(×100)

5 討論

腦血管疾病是指由多種原因?qū)е履X血管病變,從而引起腦部疾病,其中最常見的為腦缺血,占腦血管病變的70%以上[5-8]。流行病學(xué)研究顯示[9],國內(nèi)每年有超過150萬的急性腦卒中死亡病例,急性腦卒中的致死、致殘率高達(dá)80%[10]。腦缺血是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑損傷的酶促級聯(lián)反應(yīng),當(dāng)發(fā)生腦缺血后,由于腦組織缺氧,能量供給不足,導(dǎo)致谷氨酰胺等興奮性氨基遞質(zhì)生物功能增強(qiáng),引起線粒體功能異常；同時(shí)腦缺血促炎癥因子的釋放,激活免疫炎癥反應(yīng)等多種損傷機(jī)制最終共同啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡,導(dǎo)致腦組織細(xì)胞凋亡、損傷[2],出現(xiàn)腦水腫,直接影響患者的昏迷程度及病情轉(zhuǎn)歸[11]。現(xiàn)代研究表明,腦缺血損傷過程是由許多大分子物質(zhì)參與的一系列復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng),其中Bcl-2蛋白家族(包括促凋亡蛋白Bax,Bcl-XS,Bak,Bid和Bad和抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL系列)是腦缺血后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)器,參與腦缺血后細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié),其主要是通過Bcl-2蛋白家族和Caspase蛋白家族直接參與釋放CytC線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的調(diào)節(jié)[1],在此過程中,Bcl-2間接抑制促凋亡調(diào)控蛋白Caspase-3激活[12]、抑制Bax的細(xì)胞毒性,從而表現(xiàn)出對細(xì)胞凋亡的抑制作用[13]；Bax能夠破壞線粒體滲透性而導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放增加,激活Caspase-9,表現(xiàn)出對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用；此外,Bax表達(dá)可抑制Bcl-2的作用而促使細(xì)胞凋亡[14-18],因此腦缺血后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)主要是通過Bax和bcl-2兩者的拮抗作用實(shí)現(xiàn)的。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,通竅化栓顆粒能增加H2O2誘導(dǎo)的PC12損傷模型細(xì)胞活力,抑制損傷模型細(xì)胞的調(diào)亡,并能顯著降低局灶性腦缺血模型大鼠腦缺血組織含水量,改善大鼠神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)病理損傷狀況,提示通竅化栓顆粒對腦缺血后水腫癥狀有改善效果(呈濃度依賴性),能減輕腦缺血損傷,對缺血腦組織具有保護(hù)作用。研究還發(fā)現(xiàn),在腦缺血發(fā)生過程中,Bcl-2/Bax顯著降低,通竅化栓顆粒能升高Bcl-2蛋白表達(dá),降低Bax蛋白表達(dá),因此通竅化栓顆?？赡芡ㄟ^上調(diào)Bcl-2/Bax值,促進(jìn)組織神經(jīng)細(xì)胞存活,從而發(fā)揮對腦缺血損傷細(xì)胞的抗凋亡作用。