溫慧洋，焦 燕，楊銘德，谷 鵬，白曙光，楊 潔

鹽堿土壤N2O排放與和功能基因豐度的響應規(guī)律①

溫慧洋，焦 燕*，楊銘德，谷 鵬，白曙光，楊 潔

(內(nèi)蒙古師范大學化學與環(huán)境科學學院，呼和浩特 010022)

為揭示鹽堿土壤中參與氨氧化過程和硝酸鹽還原過程的和基因豐度與N2O排放的響應規(guī)律，本研究選取內(nèi)蒙古河套灌區(qū)3種不同鹽堿程度土壤(輕度鹽土SA、強度鹽土SB和鹽土SC)，通過控制室內(nèi)溫度和土壤質(zhì)量含水量進行室內(nèi)培養(yǎng)試驗，并運用熒光定量PCR(real-time PCR)技術研究了鹽堿土壤中N2O排放速率、氨氧化細菌和(膜結合型硝酸還原酶)型反硝化細菌豐度與土壤環(huán)境因子之間的偶聯(lián)關系。結果表明：SA、SB和SC3種鹽堿土壤中，N2O平均排放速率隨著土壤鹽堿程度的升高而升高，值分別為16.9、30.8、69.6 μg/(kg·d)；氨氧化細菌和型反硝化細菌豐度分別為0.415×104、6.91×104、9.44×104copies和2.61×104、5.36×104、13.5×104copies，表明在一定鹽分條件下，土壤中的鹽分能夠促進氨氧化細菌和型反硝化細菌豐度。RDA分析結果顯示，N2O平均排放速率與氨氧化細菌和型反硝化細菌豐度具有顯著的正相關(= 0.863、0.975，<0.01)；土壤pH、EC、速效鉀和有機碳是鹽堿土壤中影響N2O排放速率的主要環(huán)境因子，其中，土壤pH、EC、速效鉀和N2O排放速率存在顯著正相關(= 0.968、0.983、0.987，<0.01)，土壤有機碳和N2O排放速率存在負相關(= –0.800，<0.05)，土壤有效磷和總氮與N2O排放速率的相關性未達到顯著水平(0.05)。

鹽堿土壤；氧化亞氮；硝化；反硝化

全球變暖和土壤鹽堿化是目前國際關注的重要環(huán)境問題。N2O作為一種重要的溫室氣體，具有輻射活性強、增溫潛勢(GWP)高、破壞臭氧層等特點[1-2]。鹽堿土壤中高濃度的可溶性鹽分由于滲透壓和特異性離子對微生物細胞的毒性作用對土壤酶活性和微生物過程有重要影響[3]。農(nóng)田土壤是大氣中N2O的最重要排放源，而土壤中參與氮循環(huán)的微生物過程是N2O排放的主要驅(qū)動機制，其中起主導作用的過程為硝化作用和反硝化作用[4-5]。硝化作用包含兩個過程：分別為氨氧化過程和亞硝酸鹽氧化過程，而參與氨氧化過程的主要微生物為含有氨單加氧酶基因()的氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)或氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)，參與亞硝酸鹽氧化過程的微生物則以硝酸細菌屬(Nitrobacter)為主[6]，其中氨氧化過程作為整個硝化作用的限速步驟，該過程的中間產(chǎn)物(NO2–-N)部分會發(fā)生化學分解進而產(chǎn)生N2O[7-10]。2006年Costa等[11]根據(jù)新陳代謝途徑的動力學理論推測，環(huán)境中應存在單步硝化作用和全程氨氧化微生物(complete ammonia oxidizer, Comammox)，即由一種微生物獨立地完全氧化NH3為NO2–-N的過程。2015年Kessel等[12]和Daims等[13]分別研究發(fā)現(xiàn)3種經(jīng)過純培養(yǎng)的不同細菌(和)，Pinto等[14]團隊發(fā)現(xiàn)一種未經(jīng)過純培養(yǎng)的細菌(類)，均具備獨立將NH3氧化為NO2–-N的能力。趙偉燁等[15]在研究石灰性紫色土硝化作用及硝化微生物對不同氮源的響應時發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽氧化細菌占總微生物的比例高于氨氧化細菌和古菌，意味著石灰性紫色土中可能存在全程氨氧化微生物。因此，由全程氨氧化微生物驅(qū)動的單步硝化作用將成為微生物氮循環(huán)的重要組成部分，這對進一步了解環(huán)境中的硝化作用有重要意義。反硝化作用是在多種微生物的參與下，通過硝酸還原酶(nitrate reductase, Nar)、亞硝酸還原酶(nitrite reductase, Nir)、一氧化氮還原酶(nitric oxide reductase, Nor)和氧化亞氮還原酶(nitrous oxide reductase, Nos)的4步催化作用，最終將硝酸鹽還原為N2，并在中間過程釋放N2O[16]。

本研究分別選取AOB和含有基因的硝酸鹽還原菌作為硝化和反硝化過程中的研究對象，原因在于，在堿性土壤中，AOB比AOA活性更強，且AOB是土壤硝化作用的主要驅(qū)動者[17]。如Shen等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在pH為8.3 ~ 8.7范圍內(nèi)的堿性砂質(zhì)壤土中，AOB豐度與土壤pH和潛在硝化速率顯著相關。而對于反硝化過程中功能基因微生物的選擇則是考慮到目前國內(nèi)外多選擇含有亞硝酸鹽還原酶基因()的亞硝酸鹽還原菌為研究對象，而對于含有基因的硝酸鹽還原菌研究較少。

Zheng等[19]在河口沉積物中研究發(fā)現(xiàn)，β-AOB群落結構組成和沉積物中水溶性鹽離子顯著相關，而AOA群落結構組成與硝酸根濃度有關。Mosier和Santoro等[20-21]均研究發(fā)現(xiàn)，在河口沉積物中β-AOB中的基因豐度超過AOA，且在0 ~ 33實用鹽度單位(practical salinity unit, psu)范圍內(nèi)，隨著鹽度水平的增加而增加。含有基因的硝酸還原菌是反硝化作用中NO3–-N向NO2–-N轉(zhuǎn)化的主要驅(qū)動者，與N2O的排放有密切關系。而鹽分含量作為土壤中重要的環(huán)境因子，對型反硝化細菌的豐度和多樣性有重要影響。Yang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，由鹽水侵蝕導致的次生鹽漬化顯著改變了反硝化微生物的豐度和群落組成，其中型反硝化細菌的群落大小受到最大抑制。Wang等[23]在稻田土壤中通過室內(nèi)培養(yǎng)試驗并運用TRFLP和熒光定量PCR技術研究發(fā)現(xiàn)，外源高濃度硝酸鹽的添加顯著促進N2O排放速率，且該效應和型反硝化細菌豐度的增加密切相關。Yang等[24]在石灰性潮土中研究也發(fā)現(xiàn)N2O排放量和型反硝化細菌豐度顯著相關。

內(nèi)蒙古河套灌區(qū)位于我國西北黃河上中游地區(qū)的內(nèi)蒙古段北岸的沖積平原，地勢平坦，當?shù)剞r(nóng)業(yè)發(fā)展依賴引黃灌溉，其中引黃控制面積約116.2萬 hm2，有效灌溉面積57.4萬 hm2，面積居中國3個特大型灌區(qū)之首，長期過度灌溉導致灌區(qū)土壤次生鹽漬化形勢嚴峻[25-26]。內(nèi)蒙古河套灌區(qū)地處半干旱地區(qū)，迄今該區(qū)仍有鹽堿地34.53萬 hm2，鹽荒地27.50萬 hm2，土壤鹽堿化不僅制約著內(nèi)蒙古河套灌區(qū)的農(nóng)業(yè)發(fā)展，也對本地區(qū)的糧食安全構成了嚴重威脅[27-28]。

鹽堿土壤較普通農(nóng)田土壤中的環(huán)境條件更為復雜，其鹽分含量和土壤pH對土壤中的微生物群落結構、豐度和多樣性等有重要影響[29-31]。而鹽堿土壤中N2O排放在硝化及反硝化微生物驅(qū)動下的響應規(guī)律研究較少。因此，本研究選取內(nèi)蒙古河套灌區(qū)3種不同鹽堿程度土壤通過室內(nèi)培養(yǎng)試驗并利用分子生物學技術探究硝化和反硝化微生物豐度與N2O排放之間的響應規(guī)律，以期為鹽堿土壤中N2O排放的微生物學驅(qū)動機制的探究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

土壤樣品采集于內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市烏拉特前旗(40°28′ ~ 41°16′N，108°11′ ~ 109°54′E)，該地區(qū)屬于典型的溫帶大陸性氣候，該地處于我國西北黃河上中游地區(qū)，夏季高溫干旱、冬季嚴寒少雪，年均氣溫7.7 ℃，年均降水量213.5 mm，降水量最大值集中在8月，年均日照3 212.5 h，無霜期167 d，對于內(nèi)蒙古河套灌區(qū)的生態(tài)環(huán)境、氣候特征具有廣泛的代表性。該地區(qū)主要種植作物為小麥、玉米和向日葵。

1.2 樣品采集

土壤樣品采集時間為2015年6月中旬，選取該地區(qū)3種典型不同鹽堿程度農(nóng)田土壤，并測定其鹽分含量(表1)，測定方法參考《土壤農(nóng)業(yè)化學分析》[32]中的質(zhì)量法。按照土壤鹽化分級標準(表2)，將樣地(10 m×10 m)分別命名為輕度鹽土(SA)、強度鹽土(SB)、鹽土(SC)，按照鄰近原則采用“S”型布點法布置樣點，每塊樣地布設3個樣點，每個樣點用土鉆采集作物根區(qū)0 ~ 20 cm表層土壤，重復取樣3次?；旌闲迈r土樣去除碎石、秸稈及動植物殘體無菌聚乙烯自封袋帶回實驗室，將土樣分為兩份，其中一份風干土樣磨碎過2 mm篩用于土壤理化性質(zhì)的測定及室內(nèi)培養(yǎng)試驗，另一份土樣放入4℃冰盒內(nèi)保存，于實驗室內(nèi)裝于若干無菌離心管中–20 ℃保存用于土壤總DNA的提取。

表1 采樣點信息

表2 土壤鹽化分級標準[33]

注：①括號中數(shù)值指有的地區(qū)土壤質(zhì)量含鹽量標準采用該值；②“+”代表兩種鹽含量都高；③“–”代表一種鹽含量高，另一種鹽含量低。

1.3 樣品分析

1.3.1 土壤理化性質(zhì)的測定 土壤pH和EC值分別以1︰2.5和1︰1土水比，用土壤pH計和土壤便攜式電導儀測定；紫外分光光度計法測定土壤NO3–-N含量；凱氏定氮法測定土壤總氮(TN)含量；重鉻酸鉀容量法-外加熱法測定土壤有機碳(SOC)含量；流動分析儀測定土壤有效磷(AP)和速效鉀(AK)含量。

1.3.2 土壤總DNA的提取及PCR的擴增 稱取0.5 g土壤樣品，采用CTAB/SDS方法提取土壤總DNA，DNA樣品于–20 ℃冰箱保存待用。功能基因的定量分析采用SYBR-GREEN法，反硝化細菌的特有功能基因的定量分析引物為(TCGC CSATYCCGGCSATGTC)和(GAGTTGTACC AGTCRGCSGAYTCSG)[34]，氨氧化細菌的特有功能基因的定量分析引物為(GGGGTTTC TACTGGTGGT)和(CCCCTCKGSAAAGCC TTCTTC)[35]。

PCR擴增體系(25 μl)：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTP(2.5 mmol/L) 3.2 μl，Primer F/R(5 μmol/L) 1 μl，Taq(5 U/μl) 0.125 μl，補ddH2O至25 μl；模板DNA：2 μl。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用AXYGEN 公司DNA Gel Extraction Kit進行純化。純化連接到pEASY-T載體上，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，對插入的細菌DNA片段進行序列測定。采用M13F測序引物對陽性克隆進行測序驗證，依據(jù)測序結果驗證標準品是否構建合格。PCR儀為美國AB公司7 500 fast，凝膠成像儀為Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝膠成像系統(tǒng)。

1.3.3 標準曲線的建立 利用核算定量儀測定質(zhì)粒質(zhì)量濃度得到氨氧化細菌基因片段質(zhì)量濃度為356 ng/μl，反硝化細菌基因片段質(zhì)量濃度為110 ng/μl。將制備好的質(zhì)粒標準品按照104~ 1010進行10倍系列稀釋得到4個濃度梯度的標準模板，各取2 μl稀釋標準品，每個稀釋模板質(zhì)量濃度取3個平行樣，記錄結果并取平均值，繪制熔點曲線，以不同模板拷貝數(shù)的對數(shù)值為縱坐標，以qPCR反應的循環(huán)數(shù)(Ct)為橫坐標，繪制標準曲線。其中氨氧化細菌標準曲線為：(lg濃度值)=-0.425 7 Ct + 5.280 2，相關系數(shù)2=0.983 7；反硝化細菌標準曲線為：(lg濃度值)=-0.365 6 Ct + 4.510 4，相關系數(shù)2=0.997 8。同時將各樣本基因組10倍稀釋后取2 μl作模板，均用目的基因引物進行擴增，同時在60 ~ 95 ℃進行熔點曲線分析。

1.3.4 土壤N2O排放速率的測定 稱取SA-1~ SC-3共9份土壤樣品100 g于310 ml培養(yǎng)瓶中，預培養(yǎng)實驗：將5 ml滅菌去離子水分別加入9個培養(yǎng)瓶中，于(25±1)℃下培養(yǎng)7 d以激活土壤微生物。培養(yǎng)實驗：用去離子水調(diào)節(jié)土壤質(zhì)量含水量為25%，并用T型硅膠塞封口，于(25±1) ℃下恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)21d，取樣時間分別為第1、2、3、4、7、10、13、16、21天，用連接三通閥的注射器抽取氣體樣品，并用Agilent6820型氣相色譜儀測定氣體樣品的N2O質(zhì)量濃度，取樣結束后敞口通氣2 h，重新加蓋培養(yǎng)，同時利用稱重法每隔2 ~ 3 d補充土壤水分以保證土壤含水量一致。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

N2O排放速率：

式中：代表N2O排放速率(μg/(kg·d))；為培養(yǎng)瓶中氣體有效體積(ml)；單位時間內(nèi)氣體濃度變化值(nl/(L·d))；為N2O的摩爾質(zhì)量(44)；為培養(yǎng)箱的溫度(K)；為培養(yǎng)的天數(shù)(d)；為培養(yǎng)瓶內(nèi)的干土重(100 g)；22.4為273 K(絕對零度)時N2O的摩爾體積(L/mol)。

微生物豐度：

式中：MA為微生物豐度(copies)；為DNA總體積(μl)；為DNA的物質(zhì)的量(個/mol)；為樣品中檢測目標的質(zhì)量濃度：依據(jù)標準曲線，PCR反應的Ct值可通過換算得到樣品片段的質(zhì)量濃度(ng/μl)；為pEASY-T堿基數(shù)為載體構建的標準品堿基對的數(shù)量(個)；為脫氧核糖核苷酸平均分子量(607.4 g/mol)。

本研究采用Microsoft Excel 2010處理試驗數(shù)據(jù)。采用SPSS 22.0軟件對各數(shù)據(jù)組間的顯著差異進行單因素方差分析(AVNOA)。采用Microsoft Excel 2010以及Orign pro 9.0軟件作圖，利用CANOCO 4.5 for windows軟件進行除趨勢對應分析(detrended correspondence，DCA)，采用線性擬合模型對N2O排放速率、及功能基因豐度和環(huán)境因子進行冗余分析(RDA)。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)的多重比較

對3種不同鹽堿程度土壤pH、EC、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、總氮、有機碳、有效磷和速效鉀進行多重比較，結果如表3所示。土壤銨態(tài)氮和有效磷含量無顯著性差異(>0.05)；土壤pH、硝態(tài)氮、總氮和有機質(zhì)呈顯著性差異(<0.05)；土壤EC和速效鉀呈極顯著差異(<0.01)，二者均表現(xiàn)為輕度鹽土<強度鹽土<鹽土。

表3 供試土壤理化性質(zhì)

注：同列數(shù)據(jù)小寫字母不同表示不同鹽堿土壤間差異顯著(<0.05)。

2.2 不同鹽堿程度土壤中N2O排放速率

由單因素ANVOA方差分析可知，不同鹽堿程度土壤之間N2O平均排放速率具有明顯差異性(=107,<0.01，圖1)，3種不同鹽堿土壤(SA、SB、SC)N2O平均排放速率分別為：16.9、30.8、69.6 μg/(kg·d)，即SA

(圖中小寫字母不同表示不同鹽堿土壤間差異顯著(P<0.01)，下圖同)

2.3 不同鹽堿程度土壤中硝化及反硝化微生物功能基因豐度

由單因素ANVOA方差分析可知，3種不同鹽堿程度土壤之間AOB和型反硝化細菌豐度具有明顯差異性(=158，<0.01；=352，<0.01，圖2)。不同鹽堿程度土壤之間(SA、SB、SC)AOB豐度分別為：0.415×104、6.91×104、9.44×104copies，表現(xiàn)為：SA

2.4 土壤理化性質(zhì)與微生物基因豐度及N2O排放速率的相關性分析

利用CANOCO軟件RDA分析方法分析土壤理化性質(zhì)對微生物基因豐度及N2O排放速率的影響，結果如圖3所示，其中第一主成分軸(94.5%)和第二主成分軸(5.2%)共解釋環(huán)境變量的99.7%。由Monte Carlo法檢驗可知，土壤N2O平均排放速率與AOB和型反硝化細菌豐度具有顯著的相關性(= 0.863，<0.01；= 0.975，<0.01)。土壤N2O平均排放速率分別與pH、EC、速效鉀呈顯著正相關(= 0.968、0.983、0.987，<0.01)，土壤N2O排放速率與土壤有機碳(SOC)呈負相關(= –0.800,<0.05)，土壤N2O平均排放速率與總氮和有效磷無明顯相關性(>0.05)。

3 討論

本研究通過控制培養(yǎng)試驗的室內(nèi)溫度和土壤質(zhì)量含水量探究不同鹽堿程度土壤N2O排放特征，研究發(fā)現(xiàn)，N2O排放速率隨土壤鹽堿程度升高而升高，即SA

圖2 不同鹽堿程度土壤amoA和narG基因豐度

(SOC：土壤有機碳，TN：總氮，AK：速效鉀，AP：有效磷)

N2O是在微生物驅(qū)動下硝化過程和反硝化過程的中間產(chǎn)物，其中硝化過程中的氨氧化過程作為硝化作用中重要的限速步驟，其所涉及的主要微生物AOB在土壤氮素生物地球化學循環(huán)中具有重要作用，而反硝化過程中的NO3–-N還原為NO2–-N的過程是區(qū)分硝酸鹽的異化作用和呼吸作用的關鍵步驟。因此，氨氧化過程對應的主要微生物AOB和反硝化過程中硝酸還原菌豐度對鹽分的響應規(guī)律具有重要的研究意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，3種不同鹽堿土壤中，鹽土中和基因豐度最高。表明，在一定的鹽分條件下，土壤中的鹽分對硝化作用和驅(qū)動該過程的AOB豐度有促進作用。這一變化關系與Mosier和Francis[20]以及Santoro等[21]的研究結果相同。WANG等[38]利用膜生物反應器處理高鹽高銨廢水中研究發(fā)現(xiàn)，1% ~ 4%的鹽度(NaCl)范圍對硝化過程中NH4+-N向NO2–-N轉(zhuǎn)化幾乎沒有影響，高通量測序顯示，高的含鹽量對AOB群落結構有選擇效應，耐鹽氨氧化微生物的生存導致微生物豐富度和多樣性升高。Cortés-Lorenzo等[39]在水下固定床生物反應器中研究也發(fā)現(xiàn)，廢水中的NaCl質(zhì)量濃度低于3.7 g/L(EC = 12 mS/cm)時硝化過程不會被抑制。Sorokin等[40]在蒙古蘇打鹽湖中研究發(fā)現(xiàn)，AOB在0.1 ~ 1.0 mol/L總Na+鹽度范圍內(nèi)能夠生存，且最適宜鹽度為0.3 mol/L。本研究所選3種不同鹽堿程度土壤鹽分分別為1.2、8.3和16.9 g/kg，其對應電導率分別為0.45、0.90和2.92 mS/cm，鹽度范圍均低于以上研究結果。因此，在適度鹽度范圍內(nèi)，鹽分的增加對AOB會產(chǎn)生選擇效應進而導致該微生物豐度發(fā)生變化。鹽分對型反硝化細菌豐度的影響主要是通過對硝酸鹽還原過程對應酶活性的影響發(fā)揮作用。李小平等[41]通過對東湖沉積物中異化硝酸還原酶活性()與硝酸還原菌數(shù)量關系發(fā)現(xiàn)，硝酸還原菌數(shù)量與活性呈顯著正相關(<0.01)。劉浩榮等[42]利用土壤培養(yǎng)試驗研究發(fā)現(xiàn)，噴施KCl可以增強小白菜葉片內(nèi)硝酸還原酶活性。程玉靜等[43]采用營養(yǎng)液栽培試驗研究發(fā)現(xiàn)，外源Ca(NO3)2通過提高黃瓜幼苗體內(nèi)NO3–-N含量，進而誘導硝酸還原酶(NR)活性升高。因此，在一定鹽分條件下，土壤中的鹽分通過增強硝酸還原酶活性進而增加硝酸還原菌的豐度。

RDA分析結果顯示，N2O排放速率分別與AOB的基因拷貝數(shù)及反硝化細菌的基因拷貝數(shù)呈顯著正相關(= 0.863，<0.01；= 0.975，<0.01)，即在鹽堿土壤中，N2O排放速率隨和基因豐度的升高而升高。陳晨等[44]研究發(fā)現(xiàn)，菜地土壤通過施加生物炭增加基因豐度進而間接促進N2O排放。本研究發(fā)現(xiàn)硝酸還原菌中的基因豐度與N2O排放存在顯著正相關，該研究結果與鄭燕等[45]研究結果相似。盧靜等[46]在研究水稻土短期落干過程對N2O排放通量和反硝化微生物豐度的影響時也發(fā)現(xiàn)，N2O排放通量與基因豐度呈極顯著相關(＜0.01)。雖然本研究結果有據(jù)可循，但是從DNA水平出發(fā)，研究基因和基因豐度與N2O排放之間的關系有一定局限性。原因在于微生物功能基因豐度僅能反映該類微生物的多寡，另外，靶標基因可能并不全部參與表達，微生物功能基因豐度僅僅代表其潛在生理功能，并不能代表該類微生物活性[45]。而信使RNA(mRNA)作為生命活動重要承擔者，在微生物活性的研究中常用于表征某一特定代謝過程的活躍程度[47]，因此需進一步從mRNA水平系統(tǒng)研究基因和基因豐度與N2O排放之間的關系。土壤有機碳(SOC)對土壤的氮循環(huán)過程有重要影響進而間接影響N2O的排放。楊艷菊等[48]通過室內(nèi)模擬試驗，在25 ℃和60% 田間持水量條件下研究SOC含量對水稻土N2O排放的影響發(fā)現(xiàn)，土壤N2O累積排放量與SOC含量呈正相關。蘭宇等[49]通過田間試驗，利用靜態(tài)箱-氣相色譜法研究秸稈還田方式對N2O排放和土壤理化性質(zhì)的影響時發(fā)現(xiàn)，SOC促進土壤中的反硝化作用。SOC間接增加基因豐度進而促進N2O還原為N2釋放到大氣中，減少土壤N2O排放[50]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[51]，反硝化過程是鹽堿土壤中N2O排放的主要途徑，該過程N2O排放貢獻率為60.35% ~ 72.46%。而pH對土壤的反硝化過程有重要影響，F(xiàn)eng等[52]在酸性礦質(zhì)土壤中研究發(fā)現(xiàn)，反硝化過程中N2O排放量隨土壤pH的增加而顯著增加。目前，關于土壤速效鉀含量對N2O排放的影響還未見直接報道，但速效鉀作為土壤中重要的環(huán)境因子，其對SOC含量有重要影響。王霖嬌等[53]研究發(fā)現(xiàn)，喀斯特石漠化生態(tài)系統(tǒng)土壤中SOC與速效鉀存在極顯著正相關(<0.001)。貢璐等[54]在研究塔里木盆地南緣典型綠洲土壤有機碳與環(huán)境因子的相關性時也發(fā)現(xiàn)，速效鉀對SOC含量有顯著影響(<0.05)。因此，土壤速效鉀可以通過影響土壤SOC的含量間接影響N2O排放。

本研究運用熒光定量PCR技術定量不同鹽堿程度土壤中參與氨氧化過程和硝酸鹽的還原過程的AOB的基因豐度和反硝化細菌的基因豐度，進而探究AOB和型反硝化細菌豐度與土壤中N2O排放之間的關系。該研究結果對從DNA水平揭示鹽堿土壤N2O排放的微生物學機理具有一定意義，還需進一步通過與N2O排放實時相關的能反映氨氧化過程和硝酸鹽的還原過程微生物活性的mRNA水平進行深入研究。

4 結論

1) 不同鹽堿程度土壤N2O平均排放速率表現(xiàn)為：輕度鹽化土壤<強度鹽化土壤<鹽化土壤，隨著鹽堿程度的增加，N2O平均排放速率呈增加趨勢。

2) 不同鹽堿程度土壤中氨氧化細菌和型反硝化細菌豐度與N2O平均排放速率呈顯著正相關(<0.01)，且隨著鹽堿程度(EC)的增加而增加。

3) 鹽堿土壤N2O排放速率與土壤環(huán)境因子的冗余分析結果顯示，土壤pH、EC、速效鉀和N2O排放速率存在顯著正相關關系(<0.01)，土壤有機碳和N2O排放速率存在負相關關系(<0.05)，土壤有效磷和總氮對N2O排放速率影響較小，未達到顯著水平(>0.05)。

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The Response Rule of Functional Gene Abundance ofandon Nitrous Oxide Emissions in Saline-alkali Soils

WEN Huiyang, JIAO Yan*, YANG Mingde, GU Peng, BAI Shuguang, YANG Jie

(College of Chemistry & Environmental Science, Inner Mongolia Normal University, Hohhot 010022, China)

To reveal the response of N2O emission to the abundances of ammonia-oxidizing bacteria () and(membrane-bound nitrate reductase) genes, a culture experiment was conducted with light saline soil (SA), heavy saline soil (SB) and saline soil (SC) under controlled temperature and moisture to study the effects of soil environmental factors on N2O emission rates and the abundances ofandgenes by real-time PCR. Average N2O emission rates were 16.9, 30.8 and 69.6 μg/(kg·d) for SA, SBand SC, respectively, significantly increased with the degree of salinization. The abundances of AOB were 0.415×104copies (SA), 6.91×104copies (SB) and 9.44×104copies (SC), while the abundances ofwere 2.61×104copies (SA), 5.36×104copies (SB) and 13.4×104copies (SC), respectively, indicating that the salinity stimulates the abundances of AOB and-type denitrifying bacteria. The RDA analysis showed that the average N2O emission rate positively correlated with the abundances of AOB (0.8630.01) and(0.9750.01). pH, conductivity, available potassium and soil organic carbon are the main environmental factors affecting N2O emission rate, they significantly correlated with N2O emission rate with the coefficients of 0.968, 0.983, 0.987 (0.01) and –0.800 (0.05), respectively. The correlations between N2O emission rate and soil available phosphorus and total nitrogen contents were not significant (0.05).

Saline-alkali soils; N2O; Nitrification; Denitrification

國家自然科學基金項目(41565009，41765010)資助。

(jiaoyan@imnu.edu.cn)

溫慧洋（1990—），男，河南駐馬店人，碩士研究生，主要從事鹽堿土壤溫室氣體排放的研究。E-mail: 1102853450@qq.com

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A

10.13758/j.cnki.tr.2019.04.013