尚潔

摘要：錳過(guò)氧化物酶是環(huán)境工程研究領(lǐng)域廣泛關(guān)注的酶之一，它能夠促進(jìn)生物燃料合成，促使木質(zhì)素和污染物降解等工業(yè)生物過(guò)程更好進(jìn)行。研究木蹄層孔菌產(chǎn)錳過(guò)氧化酶的最適碳源和氮源，揭示錳過(guò)氧化物酶的培養(yǎng)方式、最適pH值和pH耐受性、最適溫度和溫度耐受性、金屬離子對(duì)其影響等特征。木蹄層孔菌在靜置培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)錳過(guò)氧化物酶顯著高于振蕩培養(yǎng)。小麥麩皮23 g/L和蛋白胨2 g/L是最佳組合的碳源和氮源。錳過(guò)氧化物酶在pH值為4.5或溫度為50 ℃時(shí)酶活力最高。酶在pH值4.0～4.5或溫度30 ℃以下處理24 h后，仍可保持80%以上的酶活力。底物為愈創(chuàng)木酚時(shí)，錳過(guò)氧化物酶的Km值為0.34 mmol/L，Vmax為0.12 mmol/L·min。當(dāng)添加的金屬離子濃度為1 mmol/L，與對(duì)照相比，K+、Ca2+、Ba2+、Co2+和Na+可極顯著抑制MnP活力。當(dāng)添加的金屬離子濃度為10 mmol/L，與對(duì)照相比，除Mg2+外，其他金屬離子均能極顯著抑制酶的活力。Mg2+ 1、10 mmol/L對(duì)酶的活力沒(méi)有影響。木蹄層孔菌適合在靜置培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)錳過(guò)氧化物酶，最適碳源和氮源分別為小麥麥麩和蛋白胨，酶在室溫和偏酸性環(huán)境中耐受性較好，并對(duì)Mg2+有較好耐受性。

關(guān)鍵詞：木蹄層孔菌;錳過(guò)氧化物酶;碳氮源;酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號(hào)： S182

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）15-0273-05

木質(zhì)素是自然界中在數(shù)量上僅次于纖維素的第二大生物高分子材料，在能源和日用化工品應(yīng)用方面具有巨大的潛在價(jià)值。錳過(guò)氧化物酶（MnP，E.C. 1.11.1.13）是一種含有血紅素和Mn2+結(jié)合部位的過(guò)氧化物酶，它在木質(zhì)素降解過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。MnP通過(guò)氧化Mn2+為Mn3+直接氧化木質(zhì)素，并將Mn3+分泌到胞外。除了解聚天然和合成木質(zhì)素，MnP還具有修復(fù)工業(yè)廢料的巨大潛能，如降解難處理的工業(yè)污染物。MnP能夠有效地進(jìn)行合成染料的脫色，如甲基橙[1]和三苯甲烷類染料[2]，這種潛在的能力已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。除了染料脫色，白腐真菌分泌的MnP還可以用于降解持久性有機(jī)污染物，如多環(huán)芳烴[3]、2，4，6-三硝基甲苯[4]和聯(lián)苯中間代謝物[5]。如何提高白腐真菌MnP產(chǎn)量，提高酶的活性成為人們?nèi)找骊P(guān)心的問(wèn)題。因此，產(chǎn)酶條件的優(yōu)化和酶學(xué)特性的研究，將有助于MnP的產(chǎn)量增加，酶活力的提高，使MnP能夠在未來(lái)更好地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。木蹄層孔菌（Fomes fomentarius）是擔(dān)子菌門的一種白腐真菌，常見于樺樹和楊樹，廣泛存在于非洲、亞洲、歐洲和北美洲，在我國(guó)主要分布于東北地區(qū)、西北地區(qū)和西南地區(qū)。前期研究發(fā)現(xiàn)，木蹄層孔菌能夠有效降解白樺中的木質(zhì)素，保留較高含量的纖維素和較低含量的1% NaOH和苯醇抽出物[6]，在白樺生物轉(zhuǎn)化中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究進(jìn)行了木蹄層孔菌產(chǎn)MnP的碳氮源優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究，旨在為今后MnP的利用提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2013年9月至2014年3月在寧夏回族自治區(qū)北方民族大學(xué)進(jìn)行。木蹄層孔菌為北方民族大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，4 ℃生長(zhǎng)于木屑麥麩培養(yǎng)基（78%白樺木屑、20%麥麩、1% CaSO4·H2O、1%蔗糖）。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（1 L）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、pH值自然。基礎(chǔ)培養(yǎng)基[7]（1 L）：葡萄糖 10.0 g、酒石酸胺0.2 g、KH2PO4 2.0 g、MgSO4 0.5 g、CaCl2 0.1 g、琥珀酸（二）甲酯 1.3 mL、微量元素70.0 mL、硫胺素（維生素B1）1.0 mg。其中微量元素1 L：MgSO4 3.0 g、MnSO4 0.5 g、NaCl 1 g、FeSO4·7H2O 0.1 g、CaCl2 0.1 g、ZnSO4·7H2O 0.1 g、CuSO4 0.1 g、KAl（SO4）2·12H2O 10.0 mg、NaMoO4·2H2O 10.0 mg、次氮基三乙酸酯（NTA）1.5 g。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制備 將木蹄層孔菌接種到PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃避光培養(yǎng)約7 d待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。取2個(gè)直徑6 mm的菌餅接入裝有15 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶（100 mL）中，28 ℃避光靜置培養(yǎng)。另取6個(gè)直徑為6 mm的菌餅接入裝有45 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶（100 mL）中，28 ℃ 180 r/min 避光振蕩培養(yǎng)。取液體培養(yǎng)基，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液。

1.2.2 MnP活力測(cè)定 MnP酶活定義為1 min內(nèi)催化氧化 1 μmol/L 愈創(chuàng)木酚所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。酶活測(cè)定體系包括500 μL的粗酶液，300 μL的4 mmol/L的愈創(chuàng)木酚溶液，1 500 μL的酒石酸鈉緩沖溶液（0.1 mol/L，pH值5），60 μL的10 mmol/L的MnSO4溶液，60 μL的5 mmol/L H2O2，580 μL的H2O。測(cè)定溫度為30 ℃時(shí)，465 nm[ε=1.21×104 L/（mol·cm）]波長(zhǎng)處2 min內(nèi)吸光度的變化。

1.2.3 碳源和氮源的優(yōu)化 試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)，考察不同碳源和氮源對(duì)木蹄層孔菌產(chǎn)MnP的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)最佳碳源和氮源進(jìn)行2個(gè)因素4個(gè)水平正交試驗(yàn)，以獲得碳源和氮源的最佳濃度。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

1.2.4 酶反應(yīng)的最適pH值和pH值耐受性 分別在溫度 4 ℃，pH值為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的緩沖液中測(cè)定粗酶液中MnP活力。同時(shí)，將粗酶液和pH值為3.0、3.5、4.0、45、5.0、5.5、6.0的緩沖液混合溫度為在4 ℃保持1 h和 24 h，測(cè)定粗酶液中MnP活力。試驗(yàn)中的最高酶活定義為100%。

1.2.5 酶反應(yīng)的最適溫度和熱耐受性 在最適pH值，溫度為20、30、40、50、60、70、80 ℃條件下分別測(cè)定粗酶液中MnP活力。同時(shí)，分別在溫度為20、30、40、50、60 ℃條件下將粗酶液保溫1 h和24 h，測(cè)定粗酶液中MnP活力。試驗(yàn)中的最高酶活力定義為100%。

1.2.6 金屬離子對(duì)酶反應(yīng)的影響 在粗酶液中分別添加終濃度為1 mmol/L和10 mmol/L的鈣（Ca2+）、鐵（Fe2+）、鎂（Mg2+）、銅（Cu2+）、鋇（Ba2+）、錳（Mn2+）、鋅（Zn2+）、鈉（Na+）、鈷（Co2+）、鉀（K+）。最適pH值條件下，溫度為 30 ℃ 保溫1 h后測(cè)定粗酶液中MnP活力。試驗(yàn)中未添加金屬離子的酶活定義為100%。

1.2.7 MnP的動(dòng)力學(xué)研究 當(dāng)愈創(chuàng)木酚濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 mmol/L時(shí)，測(cè)定粗酶液中的MnP活力。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 本試驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均平行重復(fù)3次，結(jié)果為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。結(jié)果使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS進(jìn)行鄧肯多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)方式對(duì)木蹄層孔菌產(chǎn)MnP的影響

振蕩培養(yǎng)和靜置培養(yǎng)對(duì)木蹄層孔菌MnP活力的影響，結(jié)果見圖1。將木蹄層孔菌在液體培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)6、9、12 d后，靜置培養(yǎng)產(chǎn)生的MnP活力均顯著高于振蕩培養(yǎng)。其中，靜置培養(yǎng)9 d產(chǎn)生的MnP活力最大，達(dá)到89.16 U/L，相同條件下靜置培養(yǎng)是振蕩培養(yǎng)（21.04 U/L）的4.2倍。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，靜置培養(yǎng)9 d與靜置培養(yǎng)12 d的酶活力差異不顯著。

2.2 碳源和氮源的選擇

2.2.1 不同碳源的選擇 在培養(yǎng)基中分別添加10 g/L的可溶性淀粉、麥芽糖、玉米粉、白樺木屑、麥麩作為碳源，研究不同碳源對(duì)木蹄層孔菌MnP活力的影響。試驗(yàn)結(jié)果見圖2，以麥麩作為碳源時(shí)，在10、12、14 d產(chǎn)生的MnP活力均顯著高于以玉米粉、白樺木屑作為碳源產(chǎn)生的酶活力。以麥麩作為碳源時(shí)，在12、14 d所產(chǎn)生的MnP活力無(wú)顯著差異。以可溶性淀粉、麥芽糖作為碳源時(shí)，在整個(gè)培養(yǎng)期間，均未測(cè)得酶活。結(jié)果表明，以麥麩作為碳源，可以有效促進(jìn)木蹄層孔菌MnP的產(chǎn)生，而可溶性淀粉和麥芽糖作為碳源不利于MnP的分泌。

2.2.2 不同氮源的選擇 在培養(yǎng)基中添加10 g/L麥麩為碳源，分別添加0.2 g/L的酵母浸膏、酒石酸銨、牛肉膏、蛋白胨作為氮源，研究對(duì)木蹄層孔菌MnP活力的影響。試驗(yàn)結(jié)果見圖3，4種不同的氮源處理所產(chǎn)MnP的活力，均在10～14 d內(nèi)達(dá)到最大值，其中以蛋白胨作為氮源時(shí)，在10、12 d測(cè)得的MnP活力最高，均顯著高于其他氮源測(cè)得的酶活。研究發(fā)現(xiàn)以蛋白胨為氮源時(shí)，10、12 d所產(chǎn)MnP活力并無(wú)顯著差異。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)可以作為木蹄層孔菌產(chǎn)MnP的有效氮源，培養(yǎng)10 d即可獲得理想的MnP產(chǎn)量，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間不利于MnP的有效積累。

2.3 碳源和氮源正交試驗(yàn)

基于上述碳源和氮源不同濃度的影響結(jié)果，設(shè)計(jì)2個(gè)因素4個(gè)水平正交表優(yōu)化木蹄層孔菌產(chǎn)MnP的碳源和氮源濃度（表2）。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，碳源對(duì)木蹄層孔菌MnP活力的影響最明顯，氮源其次。本試驗(yàn)以培養(yǎng)10 d的MnP活力為主要指標(biāo)，確定最佳MnP活力條件為麥麩23 g/L，蛋白胨 2 g/L。在此條件下MnP活力可達(dá)123.51 U/L，比優(yōu)化前MnP活力提高了38.52%。

2.4 酶反應(yīng)的最適pH值和pH耐受性

取靜置培養(yǎng)10 d的粗酶液，以愈創(chuàng)木酚作為底物，在pH值3.5～6.0范圍內(nèi)，測(cè)定木蹄層孔菌MnP的最適pH值。結(jié)果顯示，隨著pH值的增加，MnP的活力逐漸增加，在pH值4.5時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著pH值的進(jìn)一步升高，酶活力逐漸降低。其中，在pH值為4～5之間時(shí)，MnP均具有較高的酶活力，相對(duì)酶活均大于80%。在pH值4.5時(shí)MnP酶活力與pH值4和pH值5時(shí)相比差異顯著，結(jié)果表明，木蹄層孔菌MnP的最適pH值為4.5（圖4-A）。

在溫度為4 ℃時(shí)，分別將粗酶液置于pH值為3～6的緩沖液中處理1 h和24 h，研究木蹄層孔菌pH值耐受性。結(jié)果顯示，在pH值4.5和pH值5.0條件下分別處理 1 h 和24 h后，木蹄層孔菌MnP相對(duì)酶活力均能保持在89%以上，2種條件下測(cè)得的酶活力差異不顯著。結(jié)果表明，木蹄層孔菌MnP在pH值4.5～5.0之間具有較好的耐受性（圖4-B）。

2.5 酶反應(yīng)的最適溫度和溫度耐受性

取粗酶液在溫度為20～80 ℃條件下測(cè)定木蹄層孔菌MnP活力，研究其最適溫度，結(jié)果見圖5-A。隨著溫度的升高，MnP活力逐漸增加，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)MnP活力達(dá)到最大，隨著溫度的進(jìn)一步升高，MnP活力逐漸降低。其中，在溫度為50、60 ℃條件下測(cè)得的MnP活力差異不顯著，因此，確定木蹄層孔菌MnP的最適反應(yīng)溫度在50～60 ℃之間。

取粗酶液分別在溫度為20～60 ℃條件下保溫1 h和 24 h，研究木蹄層孔菌MnP的溫度耐受性。結(jié)果見圖5-B，當(dāng)溫度超過(guò)30 ℃時(shí)，粗酶液在保溫1 h和24 h以后，酶活均開始降低。同一溫度下MnP保溫時(shí)間越長(zhǎng)，酶活喪失越多。保溫 1 h 時(shí)，溫度為30、40 ℃的相對(duì)酶活幾乎都保持在90%以上，并且2個(gè)溫度的酶活變化差異不顯著。保溫24 h時(shí)，溫度為20、30 ℃的酶活都保持在87%以上，但是溫度超過(guò) 30 ℃ 時(shí)，酶活急劇喪失，當(dāng)溫度達(dá)40 ℃時(shí)，相對(duì)酶活只有63.92%。

2.6 金屬離子對(duì)酶活力的影響

選取10種金屬離子，研究1、10 mmol/L金屬離子對(duì)木蹄層孔菌MnP活力的影響，結(jié)果見圖6。當(dāng)金屬離子濃度為 1 mmol/L 時(shí)，與對(duì)照相比，粗酶液中添加Ba2+、K+、Ca2+、Co2+和Na+對(duì)木蹄層孔菌MnP活力具有顯著抑制作用;而添加Zn2+、Cu2+和Fe2+對(duì)MnP活力無(wú)顯著影響。當(dāng)金屬離子濃度為10 mmol/L時(shí)，除了Mg2+與對(duì)照無(wú)顯著差異外，其他金屬離子均表現(xiàn)出對(duì)MnP活力具有極顯著的抑制作用，其中Mn2+和Co2+對(duì)酶活的抑制作用最大，相對(duì)酶活分別降低至20.92%和29.93%。在反應(yīng)液中Mg2+濃度為1 mmol/L和10 mmol/L時(shí)，MnP相對(duì)酶活分別為93.76%和97.72%，表明Mg2+對(duì)MnP酶活幾乎沒(méi)有影響，差異不顯著。

2.7 MnP的酶動(dòng)力學(xué)研究

以愈創(chuàng)木酚作為底物的Lineweaver-Burk見圖7，木蹄層孔菌MnP的米氏常數(shù)（Km）是0.34 mmol/L，最大速度（vmax）是0.12 mmol/（L·min）。Km值的大小一般能夠體現(xiàn)酶對(duì)底物的親和力大小。以愈創(chuàng)木酚作為底物，木蹄層孔菌MnP測(cè)得的Km較小，說(shuō)明木蹄層孔菌MnP對(duì)愈創(chuàng)木酚親和力較大。

3 討論與結(jié)論

已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，白腐真菌產(chǎn)木質(zhì)素酶的培養(yǎng)方式多選擇振蕩培養(yǎng)[8-9]，可能因?yàn)檎駝?dòng)培養(yǎng)可以增加細(xì)胞和培養(yǎng)基之間氧的傳遞，同時(shí)增加生物量以及酶的產(chǎn)量。但是在木蹄層孔菌中發(fā)現(xiàn)，振蕩培養(yǎng)測(cè)得的MnP酶活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于靜置

培養(yǎng)時(shí)，可能因?yàn)檎袷幣囵B(yǎng)會(huì)使木蹄層孔菌形成菌絲球，不利于分泌MnP，也可能振蕩培養(yǎng)會(huì)使部分MnP因機(jī)械損傷失去活力。在對(duì)Pleurotus ostreatus的研究中也發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)生的木質(zhì)素酶漆酶在靜置培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)量明顯高于振蕩培養(yǎng)[10]。

木蹄層孔菌MnP活力的最適pH值是4.5，在pH值 4.5～5.0之間時(shí)的耐受性最好，這與大多數(shù)研究報(bào)道的真菌[8，11-13]MnP相同，也介于4.0～5.5之間。木蹄層孔菌MnP的最適反應(yīng)溫度是50 ℃，溫度為20～30 ℃時(shí)MnP的穩(wěn)定性較好，在木質(zhì)層孔菌和Echinodontium taxodii 2538中發(fā)現(xiàn)的MnP的最適溫度分別為52、55 ℃[9]。

Mg2+（1、10 mmol/L）對(duì)木蹄層孔菌MnP活力沒(méi)有影響，本結(jié)果與對(duì)木質(zhì)層孔菌MnP酶的研究結(jié)果[13]相同。數(shù)據(jù)顯示，1 mmol/L的Mn2+對(duì)木蹄層孔菌MnP活力沒(méi)有顯著影響，10 mmol/L Mn2+顯著抑制MnP活力。盡管已有研究表明，金屬離子Mn2+在很多白腐真菌中被認(rèn)為是一種強(qiáng)有力的產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑[14-15]，但是在木蹄層孔菌中卻表現(xiàn)了對(duì)錳過(guò)氧化物酶產(chǎn)生抑制作用，具體原因還有待于進(jìn)一步研究闡明。

本研究獲得了木蹄層孔菌產(chǎn)MnP的最適培養(yǎng)方式為靜止淺層培養(yǎng)，最佳碳源和氮源組合為小麥麩皮23 g/L、蛋白胨2 g/L。同時(shí)發(fā)現(xiàn)含木質(zhì)纖維素的碳源有利于MnP的合成。木蹄層孔菌MnP的pH值耐受范圍位于酸性區(qū)域，室溫條件下穩(wěn)定性較好，對(duì)Mg2+具有較好的耐受性。

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