肖嵐 李誠(chéng) 程小平 杜昕

摘要：通過(guò)菌酶聯(lián)合法發(fā)酵制備牦牛血低聚肽（分子量<1 ku），研究其氨基酸組成、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、金屬離子穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性及對(duì)食品輔料的穩(wěn)定性;同時(shí)，運(yùn)用等輻射分析法評(píng)價(jià)3種食源性低聚肽按不同比例組合后組合肽的抗氧相互作用。結(jié)果表明，牦牛血低聚肽具有良好的熱穩(wěn)定性，100 ℃水浴熱處理5 h后的·OH清除活性仍有84.32%。牦牛血低聚肽在pH值為6～10，即高pH值下·OH清除活性幾乎沒(méi)有受到影響，而低pH值條件下的·OH清除能力較差。Zn2+、Cu2+對(duì)牦牛血低聚肽的·OH清除活性影響較大，當(dāng)二者濃度達(dá)到 500 mg/L 時(shí)，其·OH清除活性保持率僅為49.35%、46.15%;K+、Mg2+對(duì)其·OH清除活性影響較小。牦牛血低聚肽對(duì)·OH清除活性保持率隨凍融次數(shù)增多而降低。食品輔料NaCl對(duì)其·OH自由基清除活性有增效作用，特別是NaCl添加量為0.5%～1.5%時(shí)，而當(dāng)NaCl添加量為1.5%～2.5%時(shí)，增效作用不明顯;葡萄糖濃度為8%～10%時(shí)，對(duì)其·OH清除活性有明顯抑制作用;檸檬酸對(duì)其·OH清除活性有明顯抑制作用，但檸檬酸濃度變化對(duì)其·OH清除活性影響不大。牦牛血低聚肽的體外抗氧化活性?xún)?yōu)于商品化的大豆低聚肽以及魚(yú)膠原低聚肽，將3種食源性低聚肽按比例組合后，在DPPH模型和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力模型中，大部分組合低聚肽表現(xiàn)出較強(qiáng)的協(xié)同作用，組合低聚肽中的牦牛血低聚肽比例超過(guò)50%時(shí)表現(xiàn)出拮抗作用;在ABTS模型中組合低聚肽中的牦牛血低聚肽比例越高協(xié)同作用越低。

關(guān)鍵詞：牦牛血低聚肽;穩(wěn)定性;抗氧化互作作用;食源性低聚肽

中圖分類(lèi)號(hào)： TS251.93

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）15-0226-07

在日本、歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家，動(dòng)物屠宰血液（特別是豬血）用于開(kāi)發(fā)生物肽類(lèi)藥物、功能性食品與食品添加劑等的利用率已達(dá)到60%以上[1]，而我國(guó)對(duì)動(dòng)物屠宰血液的利用率卻非常低。牦牛是我國(guó)青藏高原的特殊家畜，牦牛血中蛋白質(zhì)含量明顯高于其他畜禽類(lèi)血液[2]。因此，利用牦牛血制備抗氧化低聚肽既能滿(mǎn)足人們對(duì)抗氧化劑安全性的要求[3]，又能解決牦牛血隨意排放對(duì)環(huán)境造成污染的問(wèn)題，提高牦牛血的附加值。筆者所在試驗(yàn)組以體外抗氧化指標(biāo)作為評(píng)價(jià)體系，采用枯草芽孢桿菌（SICC1.197）聯(lián)合堿性蛋白酶發(fā)酵，并采用超濾分級(jí)已制備出分子量<1 ku的牦牛血抗氧化低聚肽[1]。然而，關(guān)于牦牛血抗氧化低聚肽物理化學(xué)穩(wěn)定性的報(bào)道較少。王雪芹發(fā)現(xiàn)，鮐魚(yú)多肽在100 ℃條件下能保持一定的抗氧化活性，凍融次數(shù)和紫外線(xiàn)照射對(duì)多肽的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）和羥基自由基（·OH）清除能力無(wú)顯著性影響，pH值變化對(duì)其抗氧化活性影響較大[4];趙謀明等發(fā)現(xiàn)，藍(lán)圓鲹抗氧化肽具有較強(qiáng)耐熱性[5];劉丹發(fā)現(xiàn)，大豆抗氧化肽在溫度達(dá)到80 ℃時(shí)的活性明顯降低，Zn2+、Ca2+對(duì)大豆抗氧化肽的活性干擾較大[6]。為了方便牦牛血低聚肽作為配料在保健食品、化妝品以及醫(yī)藥行業(yè)中的廣泛應(yīng)用，本試驗(yàn)擬對(duì)牦牛血抗氧化低聚肽的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、金屬離子穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性以及作為食品輔料的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，以獲得相關(guān)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

目前，關(guān)于食源性抗氧化低聚肽的制備及其抗氧化活性的研究報(bào)道較多，例如大豆蛋白抗氧化肽[7]、羅非魚(yú)皮膠原蛋白抗氧化肽[8]、棉籽粕抗氧化肽[9]、菜籽蛋白抗氧化肽[10]等，然而關(guān)于食源性抗氧化低聚肽的抗氧化互作報(bào)道較少。等輻射分析法是一種簡(jiǎn)單、精確分析藥物之間相互作用的方法[11]，本試驗(yàn)借鑒等輻射分析法，評(píng)價(jià)3種食源性抗氧化低聚肽按不同比例組合后，它們之間的抗氧化相互作用，以期為合理復(fù)配食源性抗氧化低聚肽以及通過(guò)天然動(dòng)物化學(xué)物之間的增效作用提高低聚肽的抗氧化能力提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 牦牛血，四川省大渡河食品有限公司生產(chǎn);堿性蛋白酶，活性為85.61 U/mg，上海楷洋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);枯草芽孢桿菌SICC1.197，四川省工業(yè)微生物資源平臺(tái)菌種保藏管理中心提供;其他化學(xué)試劑，國(guó)產(chǎn)分析純;大豆低聚肽，分子量 <1 ku，西安百川生物科技有限公司生產(chǎn);魚(yú)膠原低聚肽，分子量<1 ku，濟(jì)南東軒生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，H2050R型，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn);恒溫振蕩培養(yǎng)箱，QYC-2102C型，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn);紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，UV Power型，北京萊伯泰科儀器股份有限公司生產(chǎn);冷凍干燥機(jī)，LGJ-50F型，北京松源華興科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 菌酶聯(lián)合法制備牦牛血抗氧化低聚肽 采用筆者所在試驗(yàn)組前期研究的菌酶聯(lián)合法[1]制備牦牛血抗氧化低聚肽。將前期制備所得的枯草芽孢桿菌菌液（1×109 CFU/mL）以接種量為2.5 mL/100 mL加入底物濃度為75 g/L的高壓滅菌（121 ℃，15 min）牦牛血液中，在35 ℃、135 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)72 h，發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)高壓滅菌（121 ℃，15 min）得到牦牛血發(fā)酵液。待牦牛血發(fā)酵液冷卻后加入堿性蛋白酶，在酶底比為190 U/g、pH值為9.5、60 ℃的條件下進(jìn)行酶解3 h，酶解結(jié)束后用沸水水浴滅酶活10 min，得到牦牛血酶解液。將牦牛血酶解液在4 ℃、6 000 r/min條件下離心15 min，取上清液用0.45 μm水性微孔濾膜抽濾去除菌體殘?jiān)?，再將濾液置于5 ku超濾管中在4 ℃、4 000 r/min條件下離心10 min，取上清液得到分子量<5 ku的牦牛血低聚肽;進(jìn)一步將肽液置于1 ku超濾管中在4 ℃、4 000 r/min條件下離心30 min，得到分子量<1 ku的牦牛血低聚肽。

1.2.2 牦牛血低聚肽氨基酸組分分析 采用A300自動(dòng)氨基酸分析儀分析得到氨基酸組分分析譜圖。

1.2.3 牦牛血低聚肽體外抗氧化活性研究 （1）體外抗氧化活性采用·OH清除率表示，其測(cè)定參照Tian等的方法[12]，脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力的測(cè)定參照陳乃富的方法[13]，還原力的測(cè)定參照劉昭明等的方法[14]，2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺鹽自由基（ABTS+·）清除率的測(cè)定參照潘瑤等的方法[15]，DPPH·清除率的測(cè)定參照朱夕波的方法[16]，總抗氧化力的測(cè)定參照Yang等的方法[17]。（2）半抑制濃度值測(cè)定 分別測(cè)定其·OH清除率、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力、還原力、ABTS+·清除率、DPPH·清除率、總抗氧化力。參照杜昕的方法[1]，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制成圓滑曲線(xiàn)，根據(jù)曲線(xiàn)計(jì)算半抑制濃度（IC50）值。

1.2.4 牦牛血低聚肽穩(wěn)定性研究 （1）溫度對(duì)牦牛血低聚肽穩(wěn)定性的影響 將低聚肽粉配制成濃度為2 mg/mL溶液，分別在20、40、60、80、100 ℃條件下水浴保溫1～5 h，快速冷卻至室溫，測(cè)其·OH清除能力。（2）pH值對(duì)牦牛血低聚肽穩(wěn)定性的影響 取相同質(zhì)量的低聚肽粉分別溶解于pH值為2、4、6、8、10、12的磷酸緩沖液中，室溫靜置1～5 h，測(cè)其·OH清除能力。（3）金屬離子對(duì)牦牛血低聚肽穩(wěn)定性的影響 取2 mg/mL牦牛血低聚肽溶液，分別加入KCl、ZnSO4、CaCl2、MgSO4、CuSO4，使溶液中K+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+的濃度分別按5、10、50、100、500 mg/L順序遞增，混勻靜置2 h，測(cè)其·OH清除能力。（4）食品輔料對(duì)牦牛血低聚肽穩(wěn)定性的影響 取2 mg/mL牦牛血低聚肽溶液，分別加入適量的NaCl、葡萄糖、檸檬酸，使NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到 0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%;葡萄糖、檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2%、4%、6%、8%、10%，混勻靜置2 h，測(cè)其·OH清除能力。（5）凍融次數(shù)對(duì)牦牛血低聚肽穩(wěn)定性的影響 取2 mg/mL牦牛血低聚肽溶液，在-80 ℃條件下反復(fù)凍融10次，流動(dòng)水解凍，測(cè)其·OH清除能力。

1.2.5 牦牛血低聚肽與其他食源性低聚肽抗氧化相互作用的研究 根據(jù)“1.2.3”節(jié)（2）中的方法求得3種低聚肽的抗氧化指標(biāo)半抑制濃度（IC50）值，根據(jù)Luszczki等的方法[18]，由相加等效公式（1）分別計(jì)算理論值IC50 mix。

式中：IC50A為抗氧化劑A單獨(dú)作用時(shí)的IC50值;R為協(xié)同組合中2種抗氧化劑的效價(jià)比，R=IC50A/IC50B，其中IC50B為抗氧化劑及單獨(dú)作用時(shí)的IC50值;PA為抗氧化劑A在AB 2種抗氧化劑協(xié)同組合中的比例;PB為抗氧化劑B在AB 2種抗氧化劑協(xié)同組合中的比例。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)3次平行試驗(yàn)后得到，通過(guò)方差分析（ANOVA）來(lái)檢測(cè)數(shù)據(jù)之間的差異顯著性。統(tǒng)計(jì)分析使用Excel 2013、SPSS 160、Origin 8.1等軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛血低聚肽的氨基酸組成

對(duì)通過(guò)超濾分級(jí)得到的分子量<1 ku牦牛血低聚肽進(jìn)行氨基酸組分分析，分析結(jié)果見(jiàn)表1，可以看出，分子量<1 ku牦牛血低聚肽的氨基酸組成較為豐富，由12種氨基酸構(gòu)成，氨基酸含量為85.101%。研究結(jié)果表明，大部分抗氧化肽在N端包含疏水性氨基酸如纈氨酸（Val）或亮氨酸（Leu），并且序列中含有脯氨酸（Pro）、組氨酸（His）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）和半胱氨酸（Cys）等氨基酸[19]。牦牛血抗氧化低聚肽的抗氧化活性可能與高含量的Leu、Pro以及Tyr有關(guān)。當(dāng)然，除了氨基酸組成會(huì)影響抗氧化活性外，肽段序列、一級(jí)結(jié)構(gòu)以及活性位點(diǎn)也會(huì)影響其抗氧化活性[19]。

2.2 牦牛血低聚肽的體外抗氧化活性及與其他低聚肽的相互作用

2.2.1 牦牛血低聚肽的體外抗氧化活性 不同來(lái)源低聚肽體外抗氧化活性的IC50值見(jiàn)表2，可以看出，牦牛血低聚肽的總抗氧化能力極顯著優(yōu)于大豆低聚肽以及魚(yú)膠原低聚肽;牦牛血低聚肽的還原力顯著優(yōu)于大豆低聚肽，與魚(yú)膠原低聚肽差異不顯著;牦牛血低聚肽的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力極顯著優(yōu)于大豆低聚肽，與魚(yú)膠原低聚肽差異不顯著;牦牛血低聚肽對(duì)·OH自由基的清除能力極顯著優(yōu)于大豆低聚肽以及魚(yú)膠原低聚肽;牦牛血低聚肽對(duì)DPPH·自由基的清除能力極顯著優(yōu)于大豆低聚肽，顯著優(yōu)于魚(yú)膠原低聚肽;但是，牦牛血低聚肽對(duì)ABTS+·自由基的清除能力弱于大豆低聚肽和魚(yú)膠原低聚肽。表明本試驗(yàn)制備的牦牛血低聚肽的抗氧化活性?xún)?yōu)于商品化的大豆低聚肽以及魚(yú)膠原低聚肽，牦牛血低聚肽具有作為天然抗氧化劑開(kāi)發(fā)的潛力。

2.2.2 牦牛血低聚肽與其他低聚肽的相互作用 DPPH模型中不同來(lái)源低聚肽組合的理論值和試驗(yàn)值見(jiàn)表3。從表2、表3可以看出，在DPPH模型中，大部分組合低聚肽均表現(xiàn)出協(xié)同作用。如牦牛血低聚肽-大豆低聚肽比例為1 ∶ 9時(shí)，IC50 mix為3.65 mg/mL，而大豆低聚肽的IC50為4.10 mg/mL，表現(xiàn)為協(xié)同作用; 牦牛血低聚肽-魚(yú)膠原低聚肽比例為1 ∶ 9時(shí)，IC50 mix為 2.40 mg/mL，而魚(yú)膠原低聚肽的IC50為 2.49 mg/mL，也表現(xiàn)出協(xié)同作用。同時(shí)，也有部分表現(xiàn)為拮抗作用，如牦牛血低聚肽-大豆低聚肽比例為9 ∶ 1時(shí)，IC50 mix為1.95 mg/mL，而牦牛血低聚肽的IC50為1.84 mg/mL;牦牛血低聚肽-魚(yú)膠原低聚肽比例為9 ∶ 1時(shí)，IC50 mix為 1.89 mg/mL，而牦牛血低聚肽的IC50為1.84 mg/mL。雖然牦牛血低聚肽在組合低聚肽中的比例增加會(huì)引起拮抗作用，但是卻降低了組合低聚肽的IC50 mix，即組合低聚肽的DPPH·清除能力隨牦牛血低聚肽比例的增加而增大。為了驗(yàn)證IC50 mix可靠性，測(cè)定不同比例組合的低聚肽DPPH·清除率，如牦牛血低聚肽-大豆低聚肽比例為1 ∶ 9時(shí)，DPPH·清除率為6255%，而大豆低聚肽（3 mg/mL）的清除率為59.90%，表現(xiàn)為協(xié)同作用;牦牛血低聚肽-魚(yú)膠原低聚肽比例為1 ∶ 9時(shí)，DPPH·清除率為70.40%，而魚(yú)膠原低聚肽（3 mg/mL）的DPPH·清除率為67.14%，也表現(xiàn)出協(xié)同作用。而牦牛血低聚肽-大豆低聚肽比例為9 ∶ 1時(shí)，DPPH·清除率為8257%，牦牛血低聚肽（3 mg/mL）DPPH·清除率為9141%;牦牛血低聚肽-魚(yú)膠原低聚肽比例為9 ∶ 1時(shí)，DPPH·清除率為88.88%，牦牛血低聚肽（3 mg/mL）的清除率為91.41%，表現(xiàn)為抗氧化拮抗作用。

ABTS模型中不同來(lái)源低聚肽組合的理論值和試驗(yàn)值見(jiàn)表4。從表2、表4可以看出，在ABTS模型中，大部分組合低聚肽均表現(xiàn)出協(xié)同作用，與DPPH模型不同，組合低聚肽中的牦牛血低聚肽的比例越高協(xié)同作用越低，如牦牛血低聚肽-大豆低聚肽比例為9 ∶ 1、7 ∶ 3、1 ∶ 1時(shí)，IC50 mix均低于牦牛血低聚肽的IC50，表現(xiàn)為協(xié)同作用;牦牛血低聚肽-魚(yú)膠原低聚肽比例為9 ∶ 1、7 ∶ 3、1 ∶ 1）時(shí)，IC50 mix均低于牦牛血低聚肽的IC50，也表現(xiàn)為協(xié)同作用。但是，牦牛血低聚肽-大豆低聚肽比例為3 ∶ 7、1 ∶ 9時(shí)，IC50 mix均高于大豆低聚肽的IC50，牦牛血低聚肽-魚(yú)膠原低聚肽比例為3 ∶ 7、1 ∶ 9時(shí)， IC50 mix均高于魚(yú)膠原低聚肽的IC50值，表現(xiàn)為拮抗作用。在牦牛血低聚肽-大豆低聚肽組合中，1 ∶ 9組合和 9 ∶ 1 組合的IC50 mix差異極顯著;3 ∶ 7組合和9 ∶ 1組合的IC50 mix差異顯著;1 ∶ 1組合、7 ∶ 3組合和9 ∶ 1組合的IC50 mix差不顯著，說(shuō)明在牦牛血低聚肽中添加一定比例的大豆低聚肽可顯著提高其對(duì)ABTS+·的清除能力。在牦牛血低聚肽-魚(yú)膠原低聚肽組合中，所有組合之間的IC50 mix差異均不顯著，說(shuō)明大豆低聚肽較魚(yú)膠原低聚肽對(duì)牦牛血低聚肽的協(xié)同作用更顯著。試驗(yàn)測(cè)得的ABTS+·清除率結(jié)果與IC50 mix結(jié)論一致。

脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力模型中不同來(lái)源低聚肽組合的理論值和試驗(yàn)值見(jiàn)表5。從表2、表5可以看出，在脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力模型中，大部分組合低聚肽均表現(xiàn)協(xié)同作用，如牦牛血低聚肽-大豆低聚肽比例為1 ∶ 9時(shí)，IC50 mix為5.31 mg/mL，較大豆低聚肽的IC50低;牦牛血低聚肽-魚(yú)膠原低聚肽比例為1 ∶ 9時(shí)IC50 mix為2.68 mg/mL，而魚(yú)膠原低聚肽的IC50為273 mg/mL，也表現(xiàn)出協(xié)同作用。與DPPH模型類(lèi)似，牦牛血低聚肽-大豆低聚肽比例為1 ∶ 1時(shí)，IC50 mix為 3.36 mg/mL，遠(yuǎn)低于大豆低聚肽的IC50（6.21 mg/mL），但是高于牦牛血低聚肽的IC50（2.30 mg/mL），從大豆低聚肽的角度考慮表現(xiàn)為協(xié)同作用，從牦牛血低聚肽的角度考慮表現(xiàn)為拮抗作用;隨著牦牛血低聚肽所占比例的增加，混合低聚肽的IC50 mix降低，其中1 ∶ 1混合低聚肽和7 ∶ 3混合低聚肽差異顯著，1 ∶ 1混合低聚肽和9 ∶ 1混合低聚肽差異極顯著;7 ∶ 3混合低聚肽和9 ∶ 1混合低聚肽差異不顯著，說(shuō)明增加牦牛血低聚肽的比例可增加協(xié)同作用。混合低聚肽的DPPH·清除率驗(yàn)證試驗(yàn)也得出了相似的結(jié)論。

2.3 牦牛血低聚肽穩(wěn)定性

2.3.1 處理環(huán)境對(duì)牦牛血低聚肽穩(wěn)定性影響 溫度對(duì)牦牛血低聚肽穩(wěn)定性影響的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-A。溫度為20～60 ℃ 時(shí)，牦牛血低聚肽對(duì)·OH清除活性保持率隨水浴加熱時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)明顯變化;而溫度為80～100 ℃時(shí)，牦牛血低聚肽的·OH清除活性保持率隨水浴加熱時(shí)間的延長(zhǎng)呈明顯降低趨勢(shì);然而，100 ℃水浴熱處理5 h后的牦牛血低聚肽仍有84.32%的·OH清除活性，說(shuō)明熱處理在一定程度上破壞了牦牛血低聚肽的抗氧化活性，可能因?yàn)榧訜釋?dǎo)致肽鏈斷裂[20]，但有報(bào)道認(rèn)為，加熱可能使多肽中羰基與氨基縮合發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成一些抗氧化活性更強(qiáng)的物質(zhì)[21]。總之，牦牛血低聚肽具有一定程度的熱耐受性，與劉丹等對(duì)秋刀魚(yú)蛋白抗氧化肽以及鰱魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白抗氧化肽的研究結(jié)果[22-23]一致。

pH值對(duì)牦牛血低聚肽穩(wěn)定性影響的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-B。當(dāng)pH值為6、8、10時(shí)，即高pH值下牦牛血低聚肽的 ·OH 清除活性保持率隨pH值升高和處理時(shí)間延長(zhǎng)變化不大;而低pH值條件下的·OH清除能力較差，隨著pH值的下降以及處理時(shí)間的延長(zhǎng)，牦牛血低聚肽的·OH清除活性保持率總體呈下降趨勢(shì)?？傊笈Ｑ途垭膶?duì)堿的耐受程度優(yōu)于酸。這與河蜆[24]、秋刀魚(yú)[22]抗氧化肽耐酸不耐堿的性質(zhì)不符，可能是由于枯草芽孢桿菌的發(fā)酵使具有耐堿能力的抗氧化肽得以保留。

不同金屬離子對(duì)牦牛血低聚肽穩(wěn)定性的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-C，各金屬離子濃度為5～500 mg/L時(shí)，隨著金屬離子濃度的增加，牦牛血低聚肽抗氧化活性均總體呈下降趨勢(shì)，對(duì)牦牛血低聚肽抗氧化活性影響較大的是Zn2+、Cu2+，當(dāng)二者濃度達(dá)到500 mg/L時(shí)，·OH清除活性保持率僅為49.35%、46.15%。對(duì)牦牛血低聚肽抗氧化活性影響較小的是K+、Mg2+，當(dāng)二者濃度達(dá)到500 mg/L時(shí)，·OH清除活性保持率為87.92%、66.14%。因此，在食品加工與貯藏過(guò)程中應(yīng)盡量減少與銅、鋅接觸。

從圖1-D可以看出，牦牛血低聚肽的·OH清除活性保持率隨凍融次數(shù)增多而降低，可能與反復(fù)凍融誘發(fā)的蛋白質(zhì)變性有關(guān)，有研究報(bào)道，牦牛血低聚肽反復(fù)凍融后出現(xiàn)輕微渾濁現(xiàn)象，離心后有少量白色沉淀物，可能是蛋白質(zhì)變性析出所致[25]。

2.3.2 食品配制 對(duì)牦牛血低聚肽活性的影響從圖2-A可以看出，隨著NaCl添加量的增加，牦牛血低聚肽的·OH自由基清除活性保持率增高，說(shuō)明NaCl對(duì)牦牛血低聚肽的 ·OH 自由基清除活性有增效作用，特別是NaCl添加量為05%～1.5%時(shí);而當(dāng)NaCl添加量為1.5%～2.5%時(shí)，增效作用不明顯。這與唐寧等的研究結(jié)果[26]一致，可能因?yàn)镹aCl吸附了低聚肽表面的部分電荷導(dǎo)致水化膜被破壞，使低聚肽的供氫體或供質(zhì)子體充分暴露而更易與自由基結(jié)合，進(jìn)而提高了對(duì)·OH的清除能力。

從圖2-B可以看出，牦牛血低聚肽的·OH自由基清除活性保持率隨葡萄糖濃度的增加總體呈下降趨勢(shì)，當(dāng)葡萄糖濃度為2%～6%時(shí)，對(duì)·OH清除能力的影響不明顯;當(dāng)葡萄糖濃度為8%～10%時(shí)，對(duì)·OH清除能力的影響明顯。葡萄糖濃度為10%時(shí)，·OH活性保持率僅為65.11%，與陳日春等的研究結(jié)果[23-24]一致。檸檬酸對(duì)牦牛血低聚肽的·OH清除活性有明顯抑制作用，但檸檬酸濃度變化對(duì)低聚肽的 ·OH 清除活性影響不大?？赡芤?yàn)闄幟仕岬奶砑訉?dǎo)致溶液pH值降低，酸性條件抑制了牦牛血低聚肽對(duì)·OH自由基的清除能力，與前述得到的牦牛血低聚肽對(duì)酸不穩(wěn)定的結(jié)論一致。

3 討論與結(jié)論

3.1 牦牛血低聚肽的體外抗氧化活性

牦牛血低聚肽在總抗氧化能力、對(duì)·OH以及DPPH·的清除能力、還原能力、對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力方面均優(yōu)于大豆低聚肽以及魚(yú)膠原低聚肽。牦牛血低聚肽具有良好的抗氧化活性，可能與牦牛血的高蛋白含量、菌酶聯(lián)合發(fā)酵關(guān)鍵技術(shù)以及牦牛血低聚肽的氨基酸組成、肽序列、肽的結(jié)構(gòu)等有關(guān)。You等研究發(fā)現(xiàn)，ABTS·清除率和DPPH·清除率相關(guān)性可能較低[27]。 這與本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)牦牛血低聚肽對(duì)ABTS+· 的清除能力較弱，而對(duì)DPPH·的清除能力較好的結(jié)果一致。本試驗(yàn)采用體外化學(xué)評(píng)價(jià)方法進(jìn)行抗氧化活性分析，而生物體內(nèi)氧化過(guò)程極其復(fù)雜，因而化學(xué)評(píng)價(jià)顯示的抗氧化活性較高的低聚肽未必在生物體內(nèi)能取得良好的抗氧化效果。因此，需在化學(xué)評(píng)價(jià)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步結(jié)合生物試驗(yàn)對(duì)牦牛血低聚肽的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為將牦牛血低聚肽開(kāi)發(fā)成商品化的保健食品及配料提供數(shù)據(jù)支持。

3.2 牦牛血低聚肽與其他食源性低聚肽的相互作用

食源性蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)生的低聚肽是一種肽的混合物，李艷伏研究發(fā)現(xiàn)，核桃粕蛋白酶解物對(duì) O-2? 清除率比對(duì) OH 清除率高，而酶解物提純后則相反[28]，說(shuō)明混合肽之間可能存在相互作用，從而影響其抗氧化性。關(guān)于食源性低聚肽之間是否有相互作用的研究較少，本試驗(yàn)研究了3種不同來(lái)源食源性低聚肽的抗氧化相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一比例組合在不同抗氧化模型中表現(xiàn)出的相互作用不同，如牦牛血低聚肽-大豆低聚肽的1 ∶ 9和3 ∶ 7組合和牦牛血低聚肽-魚(yú)膠原低聚肽的1 ∶ 9和3 ∶ 7組合在DPPH模型和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力模型中均表現(xiàn)為抗氧化協(xié)同作用，而牦牛血低聚肽-大豆低聚肽的1 ∶ 9和3 ∶ 7組合和牦牛血低聚肽-魚(yú)膠原低聚肽（1 ∶ 9和3 ∶ 7）組合在ABTS模型中表現(xiàn)為抗氧化拮抗作用。這可能是由于3種不同的抗氧化模型其原理不同導(dǎo)致的[29]。3種低聚肽兩兩組合的相互作用及抗氧化活性強(qiáng)弱受組合比例的影響，可能與主抗氧化劑（其中抗氧化活性較強(qiáng)的低聚肽）在組合中的比例有關(guān)，相互作用受組合中不同肽的比例含量影響[30]。有研究報(bào)道，多種抗氧化活性成分可形成氧化還原循環(huán)系統(tǒng)，從而使抗氧化效果明顯強(qiáng)于單一抗氧化劑[31]。在ABTS+自由基體系中，胡曉赟研究發(fā)現(xiàn)，甘氨酰-L-酪氨酸與脯氨酸-組氨酸-組氨酸、甘氨酰-L- 酪氨酸和L-丙氨酰-谷氨酰胺、谷胱甘肽（GSH）和雙甘氨肽在不同濃度比下均有微弱的協(xié)同增效作用（P<0.05），L-肌肽與其他小肽之間有微弱的拮抗作用，通過(guò)改變溫度和添加溶劑，初步判斷肽之間的相互作用可能是氫鍵和疏水鍵相互作用共同影響的結(jié)果[32]。

3.3 牦牛血低聚肽的穩(wěn)定性

生物活性肽在制備、貯藏運(yùn)輸和應(yīng)用過(guò)程中可能因?yàn)橥庠刺砑游?、共存物、環(huán)境pH值、加熱等原因，發(fā)生一系列的物理化學(xué)變化，導(dǎo)致其生物活性下降甚至完全喪失，嚴(yán)重影響肽類(lèi)產(chǎn)品的商品價(jià)值。因此，研究溫度、pH值、凍融次數(shù)、金屬離子以及添加物對(duì)牦牛血低聚肽穩(wěn)定性的影響就非常有必要[33]。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，高濃度的Zn2+、Cu2+會(huì)抑制牦牛血低聚肽抗氧化活性，葡萄糖和檸檬酸的共存會(huì)降低其抗氧化活性，因此不宜作為抗氧化劑用于果蔬罐頭類(lèi)食品。

3.4 結(jié)論

牦牛血低聚肽的·OH清除活性對(duì)溫度有較好的穩(wěn)定性;在弱酸以及堿性條件比較穩(wěn)定;少次的凍融對(duì)其活性影響不大;高濃度的Zn2+、Cu2+會(huì)抑制其活性;NaCl對(duì)其活性有增效作用，葡萄糖、檸檬酸對(duì)其活性有明顯抑制作用。牦牛血低聚肽具有較好的理化穩(wěn)定性，可用作常規(guī)食品的抗氧化劑或功能食品配料。

不同食源性低聚肽的體外抗氧化活性不同，牦牛血低聚肽的抗氧化活性最強(qiáng)，優(yōu)于魚(yú)膠原低聚肽與大豆低聚肽。由于抗氧化模型原理不同，相同的食源性低聚肽組合在不同的體外抗氧化模型中的相互作用存在差異。3種不同來(lái)源低聚肽兩兩組合后，大多數(shù)組合表現(xiàn)出抗氧化協(xié)同作用，且協(xié)同作用的強(qiáng)弱受不同低聚肽比例的影響;部分組合表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化拮抗作用。在牦牛血低聚肽體系中加入適當(dāng)比例的大豆低聚肽和魚(yú)膠原低聚肽，在DPPH模型和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力模型中并不能提高牦牛血低聚肽的抗氧化活性，在ABTS模型中卻能提高其抗氧化活性，究其產(chǎn)生協(xié)同作用或拮抗作用的具體原因有待今后進(jìn)一步研究闡明。

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