潘曉曦 關(guān)一鳴 李美佳 張亞玉

摘要：從人參根部分離出4株內(nèi)生細(xì)菌，以灰葡萄孢菌為靶向病原菌，采用平板對峙法篩選出1株拮抗細(xì)菌 GS-1，并結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征對其進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，GS-1為多黏類芽孢桿菌，其活菌體能夠抑制病原菌菌絲的生長;發(fā)酵液對病原菌孢子萌發(fā)有抑制作用，抑制率達(dá)62.47%。由此判斷菌株GS-1是一株具有生防潛力的內(nèi)生細(xì)菌，值得進(jìn)一步開發(fā)利用。

關(guān)鍵詞：人參灰霉病;灰葡萄孢菌;內(nèi)生細(xì)菌;拮抗作用;多黏類芽孢桿菌

中圖分類號： S435.675

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）15-0148-03

灰霉病由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers）引起，該病作為一種常見的真菌病害對全球幾百種作物造成嚴(yán)重?fù)p失[1]。我國于1984年首次發(fā)現(xiàn)灰霉病原菌能夠侵染藥用植物人參，侵染部位以根部為主。由于病原菌孢子通過空氣傳播，在適宜的環(huán)境條件下，短時間內(nèi)便可造成栽培人參大面積感染病害。目前，我國人參灰霉病發(fā)生率依然偏高，已成為影響人參質(zhì)量、產(chǎn)量的主要病害之一。農(nóng)業(yè)上主要采取化學(xué)藥劑來控制人參灰霉病，但化學(xué)防治不僅會對生態(tài)環(huán)境造成污染，增加人參中農(nóng)藥殘留量及病原菌的耐藥性，還會威脅施藥者的身體健康[2-4]。因此，探索新的方法來控制和解決人參灰霉病備受關(guān)注，其中微生物農(nóng)藥由于其低毒性和不受病原菌抗性影響的特點，被研究并開發(fā)利用[5]。近年來，從植物內(nèi)生菌中尋找生防菌資源逐漸成為研究熱點[6]。

植物內(nèi)生菌生活在植物體內(nèi)，它們數(shù)量眾多，種類多樣，在整個或部分生長周期中不僅不會引起宿主植物的病害癥狀，還會與宿主共同抵御外界病害的侵染，它們與病原菌競爭生長位置、營養(yǎng)物質(zhì)和微量元素，一些內(nèi)生菌可以通過產(chǎn)生抗生素等活性物質(zhì)直接殺死病原菌或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生激素間接提高其抗病性[7-8]。綜上所述，開發(fā)內(nèi)生菌作為生防菌株發(fā)展前景廣闊，筆者從人參根部篩選拮抗內(nèi)生細(xì)菌，以灰葡萄孢菌為靶向病原菌進(jìn)行拮抗試驗，并通過形態(tài)學(xué)鑒定明確篩選出菌株的種屬分類地位，以期為進(jìn)一步開發(fā)利用篩選出的生防菌株提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試病原菌：人參灰霉病菌（分離自人參灰霉病病株，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所藥用植物研究室分離鑒定）;培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、水瓊脂（WA）培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 人參內(nèi)生細(xì)菌的分離 取4年生健康園參（來源于吉林省白山市撫松縣：127°40′28″E，42°13′16″N），用清水洗凈，室溫放置干燥后，進(jìn)行表面消毒，驗證表面消毒徹底后，切成1 cm左右的小段，置于WA培養(yǎng)基中，于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d后挑取菌落并不斷劃線培養(yǎng)得到單一菌落[9-10]。

1.2.2 拮抗細(xì)菌的篩選 采用平板對峙法[11-12]篩選拮抗細(xì)菌：在直徑為85 mm的PDA平板中央接種直徑為5 mm的病原菌菌餅，在距菌餅20 mm處點接供試內(nèi)生細(xì)菌，以只接種病原菌的PDA平板作為空白對照，于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d后觀察供試組是否產(chǎn)生抑菌圈。

1.2.3 體外拮抗效果測定 （1）檢測拮抗菌活菌體對病原菌菌絲生長的影響：采集抑菌圈邊緣病原菌菌絲及空白對照組菌絲，置于顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。（2）拮抗菌發(fā)酵液拮抗性能測定：用無菌水配制病原菌孢子懸浮液，濃度為1×105 CFU/mL。將拮抗內(nèi)生細(xì)菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中（接種量為0.5%），于35 ℃、170 r/min下振蕩培養(yǎng)48 h，得發(fā)酵液原液并對其進(jìn)行稀釋。將發(fā)酵液原液及50.0%、25.0%、12.5%發(fā)酵液稀釋液與等體積的灰霉病菌孢子懸浮液混合，用載玻片懸滴法[13]于25 ℃下培養(yǎng)，每個處理設(shè)3個重復(fù)，以加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的病原菌孢子懸浮液為對照。當(dāng)對照組孢子萌發(fā)率達(dá)90%以上時，檢查各處理孢子萌發(fā)情況，每個處理各重復(fù)隨機(jī)觀察3個視野，分別記錄孢子總數(shù)和萌發(fā)數(shù)，并計算孢子萌發(fā)率及孢子萌發(fā)相對抑制率。

萌發(fā)率=孢子萌發(fā)數(shù)孢子總數(shù)×100%;

孢子萌發(fā)相對抑制率=對照孢子萌發(fā)數(shù)-處理孢子萌發(fā)數(shù)對照孢子萌發(fā)數(shù)×100%。

1.2.4 拮抗菌株的鑒定 （1）形態(tài)特征觀察：將待測內(nèi)生細(xì)菌劃線接種于NA培養(yǎng)基上，于35 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后觀察其形態(tài)特征。（2）生理生化特征測定：采用氧化酶和接觸酶試驗、厭氧生長試驗、V-P試驗、糖發(fā)酵試驗、水解淀粉、尿素試驗及耐鹽性等測定待測內(nèi)生細(xì)菌的生理生化特征[14-15]。（3）基因組DNA按照生工生物工程（上海）股份有限公司的細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒說明書提取。以提取的DNA為模板，分別以引物7F（5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′）和1 540R（5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′），引物27F（5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1 492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）來擴(kuò)增16S rDNA基因。測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。將所得的16S rDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行Blast比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離與拮抗菌株篩選

從四年生園參根部的224個樣品組織中分離出27株內(nèi)生細(xì)菌，通過平板對峙試驗篩選得到1株有較強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌，命名為GS-1。

2.2 拮抗細(xì)菌體外拮抗效果

菌株GS-1與病原菌對峙培養(yǎng)7 d后，在生防菌周圍形成透明抑菌圈，抑菌圈大小不隨時間的推移而改變（圖1）。挑取2組菌絲在同倍顯微鏡下觀察可見，空白對照組病原菌菌絲生長正常;處理組抑菌圈周圍菌絲細(xì)弱、生長緩慢，部分菌絲頂端膨大，并且細(xì)胞壁受到破壞，原生質(zhì)體外泄，表現(xiàn)出溶菌現(xiàn)象（圖2）。拮抗菌發(fā)酵液拮抗性能測定結(jié)果（表1）表明，菌株GS-1發(fā)酵液原液及50.0%發(fā)酵液稀釋液對病原菌孢子萌發(fā)抑制作用較大，抑制率分別為62.47%、56.18%，25.0%與12.5%發(fā)酵液稀釋液抑制率未達(dá)到50.00%，抑制作用較小。

2.3 菌株GS-1的鑒定

將菌株GS-1種子液稀釋后（10-7）涂布于平板上，置于35 ℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)48 h獲得單菌落，挑取少量菌落進(jìn)行單細(xì)胞形態(tài)觀察與革蘭氏染色。觀察結(jié)果顯示，其菌落形態(tài)較小，呈不規(guī)則形邊緣開裂，表面黏稠且有光澤，顏色為乳白色;革蘭氏染色結(jié)果為陽性。依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[16]中第2部分常見細(xì)菌的鑒定方法，對菌株GS-1進(jìn)行生理生化特性檢測。試驗結(jié)果（表2）表明，該菌株可厭氧生長，其接觸酶反應(yīng)為陽性;氧化酶反應(yīng)為陰性;硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性;V-P反應(yīng)陽性;不產(chǎn)生吲哚，能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、甘露醇和D-木糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣;可水解淀粉，不水解尿素;不降解幾丁質(zhì)但能降解果膠;溫度50 ℃時不生長;5% NaCl濃度下不生長。根據(jù)上述結(jié)果可初步鑒定菌株GS-1屬于類芽孢桿菌屬，其模式菌株為多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）。測序結(jié)果顯示，菌株GS-1的16S rDNA序列大小為1 373 bp，進(jìn)入GenBank進(jìn)行相關(guān)序列Blast比對分析，結(jié)果顯示，該菌株與多黏類芽孢桿菌親緣性為100%。最終鑒定菌株GS-1（登錄號：MH043130）為多黏類芽孢桿菌。

3 結(jié)論與討論

目前研究已表明，某些人參內(nèi)生菌對植物病原菌有抑制作用，例如李勇等從40株人參內(nèi)生細(xì)菌中篩選出2株對人參菌核病菌、銹腐病菌與黑斑病菌有較強(qiáng)抑制作用的菌株[17]。姜云等發(fā)現(xiàn)一株人參內(nèi)生細(xì)菌（營養(yǎng)型芽孢桿菌NJ13）對23種植物病原菌均具有抑制作用[18]。離體拮抗試驗在很大程度上可以預(yù)示生物防治的效果，是田間試驗的基礎(chǔ)。在室內(nèi)利用平皿法及凹玻片法[19-20]篩選拮抗菌株是最常用且最簡便的方法，但拮抗菌株在實際應(yīng)用中能否保持穩(wěn)定高效還需進(jìn)一步的田間試驗驗證。

植物內(nèi)生菌是生物防治植物病害的天然資源，具有廣闊的應(yīng)用前景，本研究從人參根部分離出的多粘類芽孢桿菌 GS-1 對人參灰霉病病原菌的菌絲生長及孢子萌發(fā)有較強(qiáng)抑制作用，試驗結(jié)果為灰霉病防治工作提供了新的思路，為生物農(nóng)藥的研發(fā)提供了重要理論依據(jù)。

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