曹輝慶 黃誠(chéng)梅 蔣勝理 羅海斌 鄧智年 吳凱朝 徐林 魏源文
摘要:蔗糖磷酸合成酶(SPS)是蔗糖合成途徑的關(guān)鍵限速酶,對(duì)蔗糖的合成和碳水化合物的分配具有重要的調(diào)控作用。采用染色體步移法技術(shù)克隆獲得了甘蔗SPSB基因5′端側(cè)翼序列,并對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。分離獲得了4 399 bp的5′側(cè)翼序列,該序列除具有啟動(dòng)子核心序列 TATA-box 和增強(qiáng)子元件 CAAT-box等典型的真核生物啟動(dòng)子基本元件外,還含有多種光應(yīng)答元件、激素響應(yīng)元件,以及與缺氧、干旱、低溫誘導(dǎo)有關(guān)的順式作用元件和一些組織調(diào)控表達(dá)有關(guān)的順式調(diào)控元件,表明ScSPSB啟動(dòng)子可能具有逆境應(yīng)答、激素應(yīng)答及組織特異表達(dá)特性,值得開(kāi)展進(jìn)一步的功能研究。
關(guān)鍵詞:甘蔗; ScSPSB基因;側(cè)翼序列;生物信息學(xué)分析
中圖分類號(hào): S566.101
文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A
文章編號(hào):1002-1302(2019)15-0094-05
甘蔗屬高光合效率C4植物,是我國(guó)主要的糖料作物,其蔗糖產(chǎn)量占我國(guó)食糖總量的90%以上。甘蔗蔗糖積累過(guò)程是甘蔗生長(zhǎng)發(fā)育中最重要的代謝途徑,與甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)形成密切相關(guān)。蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase,簡(jiǎn)稱SPS) 作為蔗糖代謝途徑中的關(guān)鍵限速酶,其活性不僅能影響蔗糖的合成能力,還影響光合產(chǎn)物的分配和糖分積累[1-6]。因此,研究甘蔗SPS基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制對(duì)提高甘蔗產(chǎn)量及蔗糖含量具有重要意義。
目前,已從擬南芥[7]、荔枝[8]、水稻[9]、玉米[10]、甘蔗[11]、狼尾草[12]等多種作物中克隆到SPS基因,并進(jìn)行了SPS基因家族的基因組鑒定和表達(dá)分析[7-12]。前期研究發(fā)現(xiàn),植物SPS基因可分為4個(gè)家族共5種類型:SPSA(Ⅱ類)、SPSB(Ⅴ類)、SPSC(Ⅰ類)、SPSD(Ⅲ類和Ⅳ類)[13-15],且不同植物體內(nèi)不同家族的SPS基因表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式和功能差異[16-21]。至今,在甘蔗中已經(jīng)鑒定出5個(gè)SPS基因家族,桂意云等對(duì)其中的4個(gè)家族SPS基因進(jìn)行了時(shí)空表達(dá)特性分析[18]。研究表明,在甘蔗伸長(zhǎng)期、蔗糖積累前期和蔗糖積累后期,SPSDⅢ基因在所有甘蔗品種的未成熟葉片、成熟葉片和莖中均高水平穩(wěn)定表達(dá);SPSB基因在成熟葉片中幾乎不表達(dá),而以莖中表達(dá)量最高; 在蔗糖積累后期,SPSA和SPSC基因在不同組織中的表達(dá)量比蔗糖積累前期均有所下降。Verma等采用半定量RT-PCR技術(shù),測(cè)定了不同發(fā)育階段的高、低糖甘蔗品種的節(jié)間SPS活性及轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)成熟節(jié)間中SPS活性和轉(zhuǎn)錄表達(dá)均高于未成熟節(jié)間;與低糖品種相比,高糖品種在所有發(fā)育階段均表現(xiàn)出更高的SPS轉(zhuǎn)錄表達(dá)和酶活性,SPS活性與蔗糖呈正相關(guān)關(guān)系,與己糖呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[19]。目前認(rèn)為SPS的活性受到植物生長(zhǎng)發(fā)育[18-19]、光照[7,22-23]、溫度[24-25]、代謝產(chǎn)物[26]、外源物質(zhì)如激素[27]等多種因素的復(fù)雜調(diào)控,但對(duì)于SPS基因的調(diào)控機(jī)制和功能特性尚未有清楚的解析,還有待進(jìn)一步深入研究。
基因的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平及蛋白質(zhì)加工水平等不同調(diào)節(jié)因素的控制,其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是主要的。位于基因5′上游的啟動(dòng)子被認(rèn)為是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的主要因素,對(duì)轉(zhuǎn)錄效率起到直接的調(diào)控作用。本研究以甘蔗新臺(tái)糖22(ROC22)為試驗(yàn)材料,在前期獲得甘蔗SPSB基因的基礎(chǔ)上,首次克隆了甘蔗SPSB基因(ScSPSB)5′側(cè)翼序列,并進(jìn)行了啟動(dòng)子區(qū)域分析,為進(jìn)一步研究SPSB啟動(dòng)子的生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)資料。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
甘蔗(Saccharum officinarum)栽培品種新臺(tái)糖22(ROC22)為廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室基地種植。菌種與質(zhì)粒:克隆載體pMDTM19T和大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109均購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。主要試劑:TaKaRa Tks Gfles DNA Polymerase、TaKaRa Genome Walking kit、DNA連接酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。
1.2 甘蔗SPSB DNA序列的克隆
以甘蔗ROC22 SPSB基因mRNA 序列(JN584485.1)作為參考序列,甘蔗基因組DNA為模板,設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物擴(kuò)增SPSB DNA序列。其中正反向引物:F1:5′-GGGAAC GAGTGGATCAATGG-3′;R1:5′-GTCAGACCAGACGGTAAG GT-3′。F2:5′-AATGGGTACCTGGAGGCGAT-3′; R2:5′-TGACAGATCCTCGGCCAGGT-3′。使用50 μL反應(yīng)體系,各反應(yīng)物配比參照TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase說(shuō)明書(shū)。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性1 min;98 ℃變性10 s,55 ℃ 退火15 s,68 ℃ 延伸60 s,30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
采用膠回收劑盒TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化。純化回收目的片段與pMD19-T載體連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。熱挑取陽(yáng)性菌落,提取質(zhì)粒,由寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序。
1.3 SPSB基因5′側(cè)翼序列的克隆
采用染色體步移法技術(shù)PCR擴(kuò)增甘蔗SPSB基因5′端未知側(cè)翼序列,具體操作方法參照TaKaRa Genome Walking kit說(shuō)明書(shū)。根據(jù)已經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的序列設(shè)計(jì)3個(gè)特異性引物SP1(5′-CAAGCAGCGAGAGATTAACCGA-3′)、SP2(5′-GCCAGATCCGCCAGCACATGTT-3′)和SP3(5′-CCTCCTCG ACGAAGTAGTGCGA-3′)作為下游引物;試劑盒提供兼并引物AP1、AP2和AP3作為上游引物,甘蔗基因組DNA為模板,進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)。取第一、二、三次的PCR產(chǎn)物5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。
采用TaKaRa公司的膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化。膠回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽(yáng)性菌落,提取質(zhì)粒,由寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序。
1.4 側(cè)翼獲取序列驗(yàn)證
根據(jù)獲取的側(cè)翼序列,設(shè)計(jì)引物F3:5′-CCGCGTGTGAATCGTAGAAG-3′,作為上游引物。SP1作為下游引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性 1 min;98 ℃變性 10 s,55 ℃ 15 s,68 ℃ 60 s,30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
1.5 序列分析
采用NCBI的Blastn在線軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析;采用在線啟動(dòng)子分析軟件Neural Nerwork Promoter Predition(http://www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl)進(jìn)行核心啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測(cè);采用Plant CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析啟動(dòng)子區(qū)域包含的啟動(dòng)子區(qū)的核心元件。PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) 對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 甘蔗SPSB DNA序列的克隆
電泳結(jié)果(圖1)顯示,可以明顯擴(kuò)增到G1-PCR產(chǎn)物條帶。切膠回收G1擴(kuò)增產(chǎn)物條帶,純化目的條帶連接T載體,篩選克隆測(cè)序,測(cè)序結(jié)果顯示片段大小1 388 bp,可以找到擴(kuò)增引物F1和R1,以及測(cè)序引物P1的反向互補(bǔ)序列。將片段進(jìn)行BLASTn比對(duì),發(fā)現(xiàn)該序列與已知序列的部分區(qū)域具有96.79%相似性,表明所克隆片段為甘蔗SPSB DNA片段。
2.2 染色體步移法PCR擴(kuò)增甘蔗SPSB基因5′側(cè)翼序列
采用染色體步移法技術(shù)PCR擴(kuò)增克隆甘蔗SPSB基因5′端未知側(cè)翼序列(圖2)。切膠回收第2次巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物 AP3大小約700 bp和600 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶;第3次巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物AP3大小約5 000 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶;第3次PCR反應(yīng)產(chǎn)物 AP4大小約1 200 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶,分別使用引物SP2、SP3純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,將與已知序列有相關(guān)性的擴(kuò)增片段回收,連接pMDTM19T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109,篩選陽(yáng)性菌落,提取質(zhì)粒,進(jìn)行克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示片段大小為4 367 bp和 4 368 bp,可以找到擴(kuò)增引物SP3,并且測(cè)序結(jié)果的3′端具有引物SP3上游SPSB基因組序列,說(shuō)明該片段是ScSPSB 5′端上游特異目的片段。將該片段進(jìn)行BLASTn比對(duì),發(fā)現(xiàn)其與已知甘蔗ROC22 SPSB基因mRNA序列部分區(qū)域具有9780%相似性,表明5′端獲得的未知序列是根據(jù)已知序列得到的。
2.3 側(cè)翼獲取序列驗(yàn)證及序列分析
電泳檢測(cè)結(jié)果表明,可以明顯擴(kuò)增到與預(yù)計(jì)長(zhǎng)度大小一致的目的片段(圖3)。所擴(kuò)增片段的3′端與前述克隆的甘蔗SPSB基因DNA片段5′端序列是連續(xù)存在的。采用染色體步移法分離到了甘蔗SPSB基因5′側(cè)翼序列,序列提交GenBank,查詢登錄號(hào)MH074882,為公共數(shù)據(jù)庫(kù)首次提交的甘蔗SPSB基因5′側(cè)翼序列。
利用http://www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl進(jìn)行核心啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在序列270~320 bp、2 458~2 508 bp、2 466~2 516 bp、3 201~3 251 bp、3 853~3 903 bp、3 990~4 040 bp、4 252~4 302 bp 處,預(yù)測(cè)值分別為0.97、0.84、0.98、1.00、1.00、097、0.84,預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的堿基分別是A、C、T、C、G、A、G,3 201~3 251 bp、3 853~3 903 bp處為最有可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。
使用Plant CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行甘蔗SPSB基因啟動(dòng)子區(qū)域分析,結(jié)果見(jiàn)圖4。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示甘蔗SPSB啟動(dòng)子除包含核心啟動(dòng)子元件TATA-box和CAAT-box外,還含有多種光應(yīng)答元件Sp1、MNF1、TCCC-motif、G-Box,多種激素響應(yīng)元件TGACG-motif、CGTCA-motif、ABRE,與缺氧誘導(dǎo)有關(guān)的順式作用元件GC-motif,低溫響應(yīng)元件LIR,種子特異性調(diào)控的順式調(diào)控元件RY-element,此外還包含干旱誘導(dǎo)MYB和MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)。
3 討論與結(jié)論
蔗糖磷酸合成酶是植物體內(nèi)控制蔗糖生物合成的關(guān)鍵酶,起著調(diào)節(jié)蔗糖生物合成的作用。啟動(dòng)子作為基因編碼區(qū)域上游的非編碼DNA序列,在植物基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程中起著重要作用[28-29]。本研究采用染色體步移法首次分離克隆了甘蔗SPSB基因5′側(cè)翼序列,通過(guò)對(duì)SPS啟動(dòng)子區(qū)域分析,確定甘蔗SPSB啟動(dòng)子除包含核心啟動(dòng)子元件TATA-box和增強(qiáng)子元件CAAT-box外,還含有光應(yīng)答元件GT1-motif、MNF1、Sp1、TCCC-motif、G-Box,多種激素響應(yīng)元件ABRE、P-box、CGTCA-motif、TGACG-motif、TCA-element,以及與缺氧、干旱、低溫誘導(dǎo)有關(guān)的順式作用元件和一些組織調(diào)控表達(dá)有關(guān)的順式調(diào)控元件。
目前,SPS啟動(dòng)子已在擬南芥[7,16]、水稻[30-31]、甘蔗[32-33]、番茄[34]、棉花[35]等植物中被分離并進(jìn)行功能研究。研究表明,植物SPS啟動(dòng)子上存在多種順式調(diào)控元件,如ACE、AE-box、G-Box、AT1-motif、I-box、TGACG-motif、GT1-motif和MBS等,位于SPS啟動(dòng)子區(qū)的特異調(diào)控元件調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。如SPS啟動(dòng)子上存在I-box和G-box,這是光調(diào)控基因啟動(dòng)子所必需的重要功能調(diào)控元件[36]。擬南芥SPS啟動(dòng)子研究表明光照對(duì)SPS基因的表達(dá)以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控至關(guān)重要[30]。與干旱誘導(dǎo)有關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)(MBS)也存在于SPS啟動(dòng)子中,這在擬南芥滲透脅迫誘導(dǎo)SPS基因研究中已有報(bào)道[16]。番茄SPS啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測(cè)存在多種順式調(diào)控元件:光響應(yīng)元件ACE、G-box、AE-box、as-2-box,參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件TC-rich repeats、HSE,激素反應(yīng)元件ABRE、GARE-motif等,通過(guò)啟動(dòng)子活性的瞬時(shí)表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子在番茄的所有組織中均有表達(dá),并受光照、應(yīng)激和激素反應(yīng)的調(diào)控[34]。
SPS是一個(gè)多基因家族,植物體內(nèi)不同家族SPS基因的表達(dá)模式和調(diào)控模式各不相同[20-21,37]。關(guān)于甘蔗SPS基因啟動(dòng)子研究主要集中于SPSⅢ(A家族)啟動(dòng)子的研究。在甘蔗SPSⅢ(A家族)啟動(dòng)子研究中發(fā)現(xiàn)SPSⅢ啟動(dòng)子區(qū)上除了存在典型啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)外,還存在多種光響應(yīng)元件ATCT-motif、ACE、AE-box、G-Box和一些與分生組織、芽組織特異性表達(dá)相關(guān)的順式調(diào)控元件CAT-box、as-2-box,但未見(jiàn)本研究SPSB啟動(dòng)子所包含的激素響應(yīng)元件和干旱、低溫誘導(dǎo)有關(guān)的順式作用元件[32-33]。這可能在一定程度上詮釋了同一植物不同家族SPS基因表達(dá)模式及調(diào)控機(jī)制不同。
本研究首次分離克隆了甘蔗SPSB基因5′側(cè)翼序列,并進(jìn)行了啟動(dòng)子區(qū)域分析。分析表明甘蔗SPSB基因5′側(cè)翼序列含有典型的啟動(dòng)子核心元件和多種順式調(diào)控元件。結(jié)合已有研究基礎(chǔ),根據(jù)分析結(jié)果推測(cè)甘蔗SPSB基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可能在一定程度上受組織生長(zhǎng)發(fā)育、光照、激素、逆境脅迫等多種因素調(diào)控。要弄清SPSB基因的調(diào)控機(jī)制和功能,還須進(jìn)一步研究論證。
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