王曉明，梁國(guó)棟，王巖，楊玉波，劉峰

吉林省腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸胃腹部外科，長(zhǎng)春130012

大腸癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，位居全球腫瘤發(fā)病率和病死率的第2位，全球每年新發(fā)大腸癌病例約140萬(wàn)例[1]，中國(guó)大腸癌的發(fā)病率和病死率增長(zhǎng)迅速，且發(fā)病年齡明顯提前[2-3]。結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多靶點(diǎn)參與的復(fù)雜過(guò)程。p62蛋白為原癌基因c2myc的表達(dá)產(chǎn)物，其作為一種腫瘤基因編碼的蛋白，調(diào)控著細(xì)胞周期、增殖、凋亡及自噬過(guò)程[4-6]，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7-9]。然而，關(guān)于p62蛋白在大腸癌中作用及具體作用機(jī)制的生物學(xué)研究鮮有報(bào)道。本研究探討了60例大腸癌患者大腸癌組織和細(xì)胞中p62蛋白的表達(dá)情況及其在大腸癌細(xì)胞中的生物學(xué)特性，分析了p62蛋白在大腸癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用，旨在為大腸癌患者的臨床個(gè)體化治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2016年1月吉林省腫瘤醫(yī)院收治的大腸癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)檢查確診為大腸癌；術(shù)前未接受過(guò)放療、化療等抗腫瘤治療；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他部位惡性腫瘤；因其他原因在隨訪3個(gè)月內(nèi)死亡。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入60例大腸癌患者，其中，男29例，女31例；年齡為42～60歲，中位年齡為52歲；臨床分期：I期11例，Ⅱ期14例，Ⅲ期20例，Ⅳ期15例。收集60例大腸癌患者的大腸癌組織及癌旁組織石蠟標(biāo)本。

1.2 細(xì)胞與試劑

人大腸癌HT29和SW480細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）；胎牛血清、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Hy-Clone公司；鼠抗人p62單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze公司；即用型免疫組化試劑盒、枸櫞酸鹽緩沖液、通用型二抗、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液及一抗稀釋液均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）由上海生工生物工程股份有限公司合成；電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將人大腸癌HT29和SW480細(xì)胞接種于含20%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的IMDM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3天傳代一次。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29細(xì)胞按照每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右時(shí)，選擇p62蛋白表達(dá)水平高的HT29細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將轉(zhuǎn)染72 h的HT29細(xì)胞分為3組：siRNA/p62組，轉(zhuǎn)染p62特異性siRNA；陰性對(duì)照組，不做任何處理；siRNA/SCR組，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列，即UU序列——5'-AUGUUUGCCAUGAGUAUUA-3'。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)不同組織中p62蛋白的表達(dá)情況及結(jié)果判定

將石蠟切片置于65℃烤箱內(nèi)烘烤6～8 h，待脫蠟返水后，采用枸櫞酸鹽緩沖液（pH=7.4）高壓抗原修復(fù)2 min，待溫度降至室溫后，采用3%過(guò)氧化氫室溫封閉30 min，去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，4℃孵育一抗過(guò)夜，室溫復(fù)溫后加入通用型二抗，37℃孵育30 min，采用DAB進(jìn)行顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片后于顯微鏡下觀察并拍照。采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）作為陰性對(duì)照代替一抗。p62蛋白主要定位于細(xì)胞核，以細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色顆粒判定為細(xì)胞陽(yáng)性。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例和染色強(qiáng)度判定免疫組織化學(xué)染色結(jié)果[10]。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）檢測(cè)不同細(xì)胞中p 62蛋白的表達(dá)情況

采用RIPA裂解液分別提取HT29和SW480細(xì)胞總蛋白，篩選出p62蛋白表達(dá)水平高的細(xì)胞系，提取3組HT29細(xì)胞的總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上；在5%脫脂奶粉中封閉1 h；加入鼠抗人p62單克隆抗體（稀釋濃度為1∶1000），4℃孵育過(guò)夜，采用三乙醇胺緩沖鹽水溶液（tris buffered saline tween，TBST）清洗3次，每次10 min；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗（稀釋濃度為1∶500），室溫輕度振蕩1 h，應(yīng)用ECL法于暗室顯色，曝光膠片并掃描。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.6 MTT法檢測(cè)HT29細(xì)胞增殖率

分別取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3組細(xì)胞，加入培養(yǎng)板中培養(yǎng)5 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，24、48、72 h后每孔加入MTT，檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的光密度（optical density，OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HT29細(xì)胞的遷移能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3組細(xì)胞，采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，在6孔板中分別輕劃2條垂直線，應(yīng)用PBS清洗未貼壁的細(xì)胞。熒光顯微鏡下分別記錄不同時(shí)間點(diǎn)（12、24 h）的細(xì)胞遷移距離，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取其平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 隨訪

采用電話隨訪的方式對(duì)所有大腸癌患者進(jìn)行隨訪，每月進(jìn)行1次電話隨訪，隨訪時(shí)間為0～12個(gè)月，隨訪內(nèi)容為患者的生存情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p62蛋白在不同組織中表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，大腸癌組織細(xì)胞核中的棕黃色顆粒較多。大腸癌組織中p62蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為66.7%（40/60），明顯高于癌旁組織的36.7%（22/60），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.812，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征大腸癌患者大腸癌組織中p62蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況

不同遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況的大腸癌患者大腸癌組織中p62蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；不同年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度和臨床分期的大腸癌患者大腸癌組織中p62蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

2.3 p62蛋白表達(dá)與大腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

p62陽(yáng)性表達(dá)的大腸癌患者的1年累積生存率為22.9%，p62陰性表達(dá)的大腸癌患者的1年累積生存率為72.0%。p62陽(yáng)性表達(dá)和p62陰性表達(dá)的大腸癌患者的生存情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.525，P＜0.01）。（圖1）

2.4 p62蛋白在大腸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，p62蛋白在SW480和HT29細(xì)胞中均表達(dá)，HT29細(xì)胞中p62蛋白的表達(dá)水平為（0.73±0.06），明顯高于SW480細(xì)胞的（0.43±0.09），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.684，P＜0.01）（圖2A）。HT29細(xì)胞中轉(zhuǎn)染p62蛋白72 h后，siRNA/p62組HT29細(xì)胞中p62蛋白的表達(dá)水平為（0.323±0.024），siRNA/SCR組HT29細(xì)胞中p62蛋白的表達(dá)水平為（1.510±0.216），陰性對(duì)照組HT29細(xì)胞中p62蛋白的表達(dá)水平為（1.730±0.114），3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=85.561，P＜0.01）。siRNA/p62組HT29細(xì)胞中p62蛋白的表達(dá)水平明顯低于siRNA/SCR組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.281、17.035，P＜0.01）（圖2B）。

表1 不同臨床特征大腸癌患者大腸癌組織中 p62蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況

圖1 p62蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者（n=40）與陰性表達(dá)（n=20）患者的生存曲線

圖2 Western blot法檢測(cè)p62蛋白在大腸癌HT29和SW480細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.5 p62蛋白對(duì)HT29細(xì)胞增殖能力的影響

隨著時(shí)間的增加，3組HT29細(xì)胞的OD值不斷升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F時(shí)間=1.644，P時(shí)間＜0.01）；組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間=65.016，P組間＜0.01）。0 h時(shí)，3組HT29細(xì)胞的OD值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；72 h時(shí)，3組HT29細(xì)胞的OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.27，P＜0.01）。24～72 h時(shí)，siRNA/p62組HT29細(xì)胞的OD值均明顯低于陰性對(duì)照組和siRNA/SCR組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.047、7.047、5.774，P＜0.01）。（表2）

表2 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn) 3組HT29細(xì)胞的OD值（±s）

表2 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn) 3組HT29細(xì)胞的OD值（±s）

時(shí)間0 h 24 h 48 h 0.20±0.01 0.58±0.10 0.97±0.14 0.20±0.02 0.51±0.18 0.75±0.17 0.20±0.01 0.61±0.14 0.95±0.19 72 h陰性對(duì)照組1.25±0.05 siRNA/p62組0.90±0.07 siRNA/SCR組1.23±0.07

2.6 下調(diào)p62的表達(dá)對(duì)HT29細(xì)胞遷移能力的影響

隨著時(shí)間的增加，3組HT29細(xì)胞的遷移距離逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F時(shí)間=35810.143，P時(shí)間＜0.01）；組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間=318.778，P組間＜0.01）。12 h時(shí)，3組HT29細(xì)胞的遷移距離比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。24 h時(shí)，siRNA/p62組HT29細(xì)胞的遷移距離均短于陰性對(duì)照組和siRNA/SCR組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.852、8.154，P＜0.01）；siRNA/SCR組和陰性對(duì)照組HT29細(xì)胞的遷移距離比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

表3 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn) 3組HT29細(xì)胞的遷移距離（mm，±s）

表3 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn) 3組HT29細(xì)胞的遷移距離（mm，±s）

時(shí)間陰性對(duì)照組siRNA/p62組siRNA/SCR組12 h 24 h 0.64±0.13 2.08±0.12 0.57±0.12 1.53±0.11 0.60±0.08 2.05±0.10

3 討論

p62蛋白是一種參與自噬、凋亡和腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵蛋白，深入研究p62蛋白以及自噬與大腸癌的關(guān)系，對(duì)闡明大腸癌的發(fā)病機(jī)制以及尋找新的大腸癌的治療策略具有積極意義。研究發(fā)現(xiàn)，p62蛋白在啟動(dòng)細(xì)胞存活信號(hào)以及細(xì)胞的增殖、分化和抗凋亡基因誘導(dǎo)方面發(fā)揮著重要的作用，并且在多種腫瘤中異常表達(dá)[11-13]。Inoue等[14]采用免疫組織化學(xué)染色法分析p62蛋白在109例非小細(xì)胞肺癌患者中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p62在37%的非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)，并與非小細(xì)胞肺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)，提示p62蛋白可能是影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的重要因素。Schl?fli等[15]、吳文涌等[16]分別通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)人肝細(xì)胞癌中p62蛋白的表達(dá)情況，均發(fā)現(xiàn)其與肝細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大腸癌組織中p62蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，且p62陽(yáng)性表達(dá)患者與p62陰性表達(dá)大腸癌患者的生存情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示p62蛋白在大腸癌中的表達(dá)水平較高，且p62蛋白的表達(dá)情況與患者的預(yù)后密切相關(guān)。本研究還探討了大腸癌組織中p62蛋白的表達(dá)情況與患者臨床特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況的大腸癌患者大腸癌組織中p62蛋白的表達(dá)情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；不同年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度和臨床分期的大腸癌患者大腸癌組織中p62蛋白的表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示大腸癌的發(fā)生可能與大腸癌患者的年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度和臨床分期無(wú)關(guān)，這為臨床大腸癌的治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。相關(guān)研究結(jié)果顯示，p62蛋白在結(jié)腸癌化療耐藥機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用，下調(diào)p62的表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的體外增殖和體內(nèi)生長(zhǎng)[17]，這與本研究的結(jié)果基本一致，本研究結(jié)果顯示，p62蛋白在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平較高，且p62蛋白在HT29細(xì)胞中的表達(dá)水平高于SW480細(xì)胞，并證實(shí)了下調(diào)p62蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞的增殖具有抑制作用，表明p62蛋白可能參與調(diào)控大腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步探討p62蛋白與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，本研究下調(diào)p62蛋白的表達(dá)后應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示，下調(diào)p62蛋白的表達(dá)后，HT29細(xì)胞的遷移能力受損，表明p62蛋白不僅參與大腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，還參與大腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

綜上所述，p62蛋白參與大腸癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，可能成為大腸癌進(jìn)展和預(yù)后不良的潛在標(biāo)志物之一。但本研究的不足之處在于納入的樣本量不足，因此，在后續(xù)的研究中將進(jìn)一步補(bǔ)充臨床資料、擴(kuò)大樣本量，深入研究p62蛋白在磷脂酰肌醇3-羥激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路中的作用，以進(jìn)一步闡明大腸癌發(fā)生、發(fā)展的潛在分子機(jī)制。