古力米熱·布然江，阿衣西布衛(wèi)·庫(kù)爾班，李小文

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科腫瘤放療科，烏魯木齊830011

宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，且病理類(lèi)型多為鱗狀細(xì)胞癌，發(fā)病早期缺乏典型性臨床癥狀，導(dǎo)致多數(shù)患者確診時(shí)已是中晚期，喪失了最佳診療時(shí)機(jī)[1]。臨床研究表明，乏氧細(xì)胞的存在不僅是腫瘤放療敏感性下降的重要原因之一，同時(shí)與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，細(xì)胞凋亡被抑制時(shí)，異常細(xì)胞分裂增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，故乏氧細(xì)胞的存在和凋亡過(guò)程受抑制是導(dǎo)致腫瘤難治愈、易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移的重要因素之一[2]。在乏氧條件下，低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）可以與細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)乏氧反應(yīng)的元件結(jié)合，增強(qiáng)HIF-1α表達(dá)水平，可促進(jìn)腫瘤血管生成、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲能力、增強(qiáng)腫瘤對(duì)放化療抵抗[3]。存活蛋白（survivin）是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的成員。survivin在分化成熟的組織中不表達(dá)或低表達(dá)，在胚胎組織中表達(dá)，而在大多數(shù)腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)[4]。survivin可以抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，并與腫瘤細(xì)胞放療或化療敏感性有關(guān)，有望成為宮頸癌新的治療靶點(diǎn)[5]。本研究以宮頸鱗狀細(xì)胞癌SiHa細(xì)胞[6]作為研究對(duì)象，探討在乏氧條件下，HIF-1α和survivin在宮頸鱗狀細(xì)胞癌SiHa細(xì)胞中的表達(dá)，及兩種基因沉默后與宮頸鱗狀細(xì)胞癌SiHa細(xì)胞的放射敏感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人宮頸鱗狀細(xì)胞癌SiHa細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HIF-1α小干擾RNA（small inteferirng RNA，siRNA）的干擾細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。羊抗兔二抗購(gòu)自精美（北京）科技有限公司，辣根過(guò)氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自Rockland公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜均購(gòu)自上海羅氏制藥公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Pierce公司。轉(zhuǎn)染試劑選擇ON-TARGETplusHIF-1αsiRNA、ON-TARGETplussurvivinsiRNA，陰性對(duì)照選擇ON-TARGETplus Non-targeting Pool，轉(zhuǎn)染指示劑選擇DharmaFECT 1 Transfection Reagent，均購(gòu)自上海帛龍生物科技有限公司。蛋白提取選用凱基蛋白提取試劑盒，購(gòu)自美國(guó)SONICS公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 宮頸鱗狀細(xì)胞癌SiHa細(xì)胞的培養(yǎng)及乏氧狀態(tài)建立

宮頸鱗狀細(xì)胞癌SiHa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，放在孵育箱中以5%CO2、37℃培養(yǎng)，每1～2天換一次培養(yǎng)基。在細(xì)胞布滿(mǎn)70%～80%瓶底時(shí)以0.25%胰蛋白酶消化傳代。細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后使用二氯化鈷模擬細(xì)胞缺氧環(huán)境，二氯化鈷濃度選取200 μmol/L，細(xì)胞密度1×106/L，乏氧培育24 h后使用CCK-8法檢測(cè)吸光度值，在96孔板邊緣一圈培養(yǎng)箱中加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）100 μl作為陰性對(duì)照，評(píng)估細(xì)胞活性。

1.3 蛋白表達(dá)情況檢測(cè)

采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）對(duì)在二氯化鈷模擬乏氧環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞株（陽(yáng)性對(duì)照組）和未進(jìn)行乏氧培養(yǎng)的細(xì)胞株（空白對(duì)照組）進(jìn)行HIF-1α和survivin檢測(cè)，蛋白提取選用凱基蛋白提取試劑盒，蛋白測(cè)定選用凱基蛋白測(cè)定試劑盒，HIF-1α抗體濃度為1∶1000，survivin抗體濃度為1∶5000，內(nèi)參選用anti-β-actin ab8227，抗體濃度為1∶1000。按照常規(guī)Western blot電泳后記錄電泳圖像。

1.4 基因沉默細(xì)胞株的建立及鑒定

1.4.1 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞株本研究采用靶向HIF-1α和survivin的siRNA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宮頸鱗狀細(xì)胞癌SiHa細(xì)胞株，下調(diào)基因表達(dá)。轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，并收集細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量為3×106個(gè)。鏡下觀察可確定siRNA轉(zhuǎn)染是否有效?？瞻讓?duì)照組：未進(jìn)行乏氧培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞；陰性對(duì)照組：乏氧培養(yǎng)后未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的SiHa細(xì)胞；HIF-1αsiRNA組：乏氧培養(yǎng)后進(jìn)行HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染的SiHa細(xì)胞；survivinsiRNA組：乏氧培養(yǎng)后進(jìn)行survivinsiRNA轉(zhuǎn)染的SiHa細(xì)胞。

1.4.2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)基因表達(dá)情況將siRNA轉(zhuǎn)染后的SiHa細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染48 h后，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測(cè)HIF-1α、survivin基因表達(dá)情況。為防止RNA降解，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA在-20℃保存。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系：5×PrimeScript RT Master Mix 2 μl，總RNA最大量 500 ng，RNase free DH2O 10 μl；反轉(zhuǎn)錄條件：37℃15 min，85℃5 s，4℃保持。根據(jù)GeneBank查詢(xún)基因序列號(hào)，設(shè)計(jì)基因引物序列。HIF-1α反義：5'-TGCAACATGGAAGGTATTGC-3'，HIF-1α正義 ：5'-GGTTCACAAATCAGCACCAA-3'；survivin反義：5'-CCCTGCCTGGCAGCCCTTTC-3'，survivin正義：5'-CTGGCTCCCAGCCTTCCA-3'。

RT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）12.5 μl，PCR Forward Primer 10 μmol/L 1.0 μl，PCR Reverse Primer 10 μmol/L 1.0 μl，RT 反應(yīng)液（cDNA）2 μl，DH2O 8.5 μl，總量 25 μl。RTPCR 條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，58℃30 s，72℃1 min，連續(xù)進(jìn)行70個(gè)循環(huán)；72℃10 min。

1.5 細(xì)胞放射后狀態(tài)變化及放射敏感性檢測(cè)

采用經(jīng)上述方法培養(yǎng)后的基因沉默細(xì)胞株進(jìn)行照射。照射方法：直線加速器VARIAN，機(jī)架角度180°，6-MV射線，劑量率200 cGy/min，照射野10cm×10cm，垂直源皮距100cm，室溫下照射。照射時(shí)選擇厚度為2cm的有機(jī)玻璃板在細(xì)胞培養(yǎng)板下，在每組相同劑量點(diǎn)進(jìn)行同野同時(shí)照射，對(duì)劑量點(diǎn)進(jìn)行單次照射。分別對(duì)每組細(xì)胞進(jìn)行照射，照射劑量根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定為0、2、4 Gy 3組。

1.5.1 HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)按照預(yù)先設(shè)定的實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行照射，照射后將細(xì)胞放回37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h后進(jìn)行HE染色。

1.5.2 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)放射敏感性細(xì)胞克隆形成率是指接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活以及形成的克隆數(shù)量，可以表示細(xì)胞群體的依賴(lài)性、增殖能力。本實(shí)驗(yàn)采用放射增敏比（sensitivity enhanced ratio，SER）、集落形成率（plating efficiency，PE）、細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)（survival fraction，SF）描述放射敏感性相關(guān)指標(biāo)。SF=實(shí)驗(yàn)組集落形成數(shù)/陰性對(duì)照組集落形成數(shù)×100%。PE=形成集落數(shù)/細(xì)胞接種數(shù)×100%。SER=空白對(duì)照組SF/陰性對(duì)照組或基因處理組SF。分別對(duì)每組細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，并檢測(cè)0、2、4 Gy劑量照射后的情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Westernblot法檢測(cè)乏氧培養(yǎng)前后SiHa細(xì)胞中HIF-1 α、survivin表達(dá)情況

Western blot法檢測(cè)乏氧培養(yǎng)后SiHa細(xì)胞中HIF-1α和survivin蛋白表達(dá)均升高，其中HIF-1α在未乏氧時(shí)明顯低表達(dá)，乏氧后表達(dá)明顯升高。（圖1）

圖1 Western blot法檢測(cè)乏氧培養(yǎng)前和乏氧培養(yǎng)24h后HIF-1 α及survivin的表達(dá)情況

2.2 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果

在乏氧狀態(tài)下，陰性對(duì)照組HIF-1α的相對(duì)表達(dá)量為（6.68±1.32），高于HIF-1αsiRNA 組的（0.58±0.13），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.144，P＜0.05）；陰性對(duì)照組survivin相對(duì)表達(dá)量為（1.16±0.03），高于survivinsiRNA組的（0.10±0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.144，P＜0.05）。

2.3 放射后細(xì)胞形態(tài)變化及放射敏感性比較

2.3.1 細(xì)胞形態(tài)觀察HE染色結(jié)果顯示，HIF-1αsiRNA組、survivinsiRNA組細(xì)胞放療后形態(tài)發(fā)生明顯改變。2 Gy劑量照射后細(xì)胞出現(xiàn)明顯水腫樣改變，即細(xì)胞體積明顯增大，部分透明淡染呈氣球樣改變，少部分細(xì)胞出現(xiàn)脂肪樣變性，即出現(xiàn)脂滴，HE染色可見(jiàn)空泡狀；4 Gy劑量照射后細(xì)胞出現(xiàn)明顯脂肪樣變性，部分細(xì)胞出現(xiàn)核濃縮改變，細(xì)胞間隙可見(jiàn)點(diǎn)狀紅染提示發(fā)生纖維素樣變性。而陰性對(duì)照組細(xì)胞在2 Gy和4 Gy劑量照射后細(xì)胞形態(tài)變化均不明顯，僅部分細(xì)胞出現(xiàn)包漿淡染現(xiàn)象。（圖 2）

圖2 不同劑量照射后各組細(xì)胞的形態(tài)觀察（HE染色，×400）

2.3.2 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PE、SF、SER 各組細(xì)胞隨著照射劑量增加，PF、SF、SER值均下降。在放射劑量為2 Gy和4 Gy時(shí)，HIF-1αsiRNA組與survivinsiRNA組的SER均高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。（表1）

表1 4組細(xì)胞在不同劑量照射下的PF、SF、SER值

3 討論

宮頸癌是婦女最常見(jiàn)的惡性腫瘤，而由于醫(yī)療條件限制，大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是局部晚期，喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，而放療是中晚期宮頸癌最主要的治療手段。但放療后腫瘤消退及局部控制率明顯不同，主要原因在于腫瘤放射敏感性存在很大的個(gè)體差異。隨著研究的不斷深入及研究方法的不斷發(fā)展，從最初的大體組織細(xì)胞水平到目前的分子基因水平，人們認(rèn)識(shí)到放射敏感性差異與細(xì)胞乏氧、細(xì)胞周期、增殖活性、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)。

HIF-1能夠激活多種低氧反應(yīng)性基因的表達(dá)，由α、β兩個(gè)亞基組成，HIF-1α為氧調(diào)節(jié)性蛋白。而乏氧條件下腫瘤細(xì)胞的放療抵抗和細(xì)胞增殖與凋亡、損傷修復(fù)、周期分布等有很大的相關(guān)性。HIF-1α與腫瘤細(xì)胞放射治療的敏感性也存在一定的聯(lián)系，在氧含量的敏感性反應(yīng)研究中是利用HIF-1α亞基完成的，它對(duì)細(xì)胞的損傷修復(fù)、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、增殖與凋亡、血管形成、細(xì)胞周期分布、能量代謝等方面也有影響[7]。survivin為凋亡抑制基因，只在腫瘤和胚胎組織中表達(dá)，具有顯著的腫瘤特異性，與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、分化增殖有著很大的關(guān)系，在G2/M期高表達(dá)，在G1期低表達(dá)，與腫瘤凋亡密切相關(guān)[8]。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)是研究基因功能中非常重要的工具[9-11]。其主要原理：在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中體外導(dǎo)入siRNA模擬雙鏈RNA的體內(nèi)切割產(chǎn)物，使雙鏈RNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致相應(yīng)的基因沉默。本研究即采用siRNA轉(zhuǎn)染方式，轉(zhuǎn)染后基因沉默明顯，可持續(xù)性傳代。

在本研究中，未乏氧狀態(tài)下HIF-1α及survivin處于低表達(dá)狀態(tài)，乏氧是促進(jìn)基因表達(dá)的原因之一，乏氧狀態(tài)下二者表達(dá)均升高，這與survivin主要在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，乏氧可使其表達(dá)狀態(tài)提高的結(jié)論相一致[12-13]。而HIF-1α基因表達(dá)下調(diào)后，survivin的表達(dá)亦下調(diào)，說(shuō)明HIF-1α表達(dá)與survivin基因有關(guān)[14-15]。

作為HIF-1唯一的氧調(diào)節(jié)亞單位，在乏氧情況下，HIF-1α的表達(dá)增強(qiáng)，可以與細(xì)胞核內(nèi)乏氧反應(yīng)元件相互結(jié)合，對(duì)其下游基因的表達(dá)起到上調(diào)作用，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等，增加腫瘤的血管生成率，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，增加放化療抵抗。通過(guò)抑制其表達(dá)可以對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的有絲分裂產(chǎn)生干擾，影響腫瘤細(xì)胞的增殖。survivin是凋亡抑制蛋白家族中的成員，是凋亡抑制因子中最強(qiáng)的一種，在腫瘤細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)調(diào)節(jié)中起到重要的參與作用。本研究通過(guò)HE染色可以直接觀察細(xì)胞形態(tài)。對(duì)未進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的乏氧細(xì)胞進(jìn)行放射干預(yù)24 h后，細(xì)胞變性程度不明顯，提示乏氧環(huán)境可以促使細(xì)胞抵抗放射，而對(duì)HIF-1α、survivin基因干預(yù)后，細(xì)胞放射損傷反應(yīng)明顯增強(qiáng)。

綜上所述，通過(guò)本研究可以證實(shí)乏氧環(huán)境可以提高宮頸癌SiHa細(xì)胞中HIF-1α和survivin的表達(dá)，通過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)可以下調(diào)乏氧SiHa細(xì)胞中HIF-1α和survivin的表達(dá)。乏氧后細(xì)胞SER較低，而抑制HIF-1α和survivin可以提高SER，可以認(rèn)為HIF-1α和survivin基因是影響SER的關(guān)鍵基因。