袁航 屠世良

結(jié)直腸癌是常見、多發(fā)的惡性腫瘤之一。近年來(lái)，總發(fā)病率呈明顯遞增趨勢(shì)。一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告顯示，結(jié)直腸癌發(fā)病率位居所有腫瘤的第5位，5年生存率較低[1]。因此，早期發(fā)現(xiàn)并給予個(gè)體化綜合治療具有重要意義[2]。microRNA（以下簡(jiǎn)稱miRNA）是一類20～25個(gè)堿基的小分子非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中。目前發(fā)現(xiàn)miRNA異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系。關(guān)于miRNA的作用機(jī)制研究成為當(dāng)前腫瘤發(fā)生機(jī)制研究的熱點(diǎn)。與其他基因一樣，腫瘤細(xì)胞中miRNA的表達(dá)受到包括DNA甲基化修飾在內(nèi)的表觀修飾等多種機(jī)制的調(diào)控，且在多種腫瘤中miRNA基因甲基化狀態(tài)的改變與腫瘤臨床表型及預(yù)后有關(guān)。由于不同組織來(lái)源的腫瘤存在特征性的miRNA表達(dá)譜，其甲基化狀態(tài)也存在特異性[3]。目前關(guān)于結(jié)直腸癌中相關(guān)miRNA的CpG島甲基化狀態(tài)的研究仍較為少見。miR-34a是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的、具有抑癌基因樣功能的重要調(diào)控因子[4]。有研究對(duì)結(jié)直腸癌組織中表達(dá)有差異的miRNA基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-34a的啟動(dòng)子區(qū)域或周圍有CpG島[5]。本研究對(duì)結(jié)直腸癌組織miR-34a啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)的臨床意義作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2011年7月至2012年7月在本院行根治性切除術(shù)的48例結(jié)直腸癌患者為研究對(duì)象，收集其結(jié)直腸癌組織及癌旁5cm以上的正常黏膜組織。其中男28 例，女 20 例；年齡 29～75[62.5（54.3，72.0）]歲。所有患者術(shù)前未行放化療；其病理診斷經(jīng)2位病理科醫(yī)生獨(dú)立診斷明確，病理分期依據(jù)美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南公布的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織離體后盡快分塊，每塊150～200mg，液氮冷凍后置-80℃冰箱內(nèi)備用。按照組織DNA抽提試劑盒說明書（北京天根生化公司）抽提結(jié)直腸組織基因組DNA，并測(cè)定濃度。

1.2.2 miR34-a啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè) 采用甲基化特異性PCR（MSP）法。通過在線Meth-Primer軟件（http://www.urogene.org/methprimer/）設(shè)計(jì)甲基化、非甲基化序列的引物（其信息見表1[5]），以亞硫酸氫鈉修飾后的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃預(yù)變性10min，94℃15s，共40個(gè)循環(huán)；55℃ 30s，72℃ 40s，再 72℃延伸 10min。非甲基化擴(kuò)增體系的退火溫度提高至56℃，其他步驟相同。擴(kuò)增產(chǎn)物為2.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光照射顯帶。RT-PCR：取1～2μl甲基化修飾型DNA進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物為2.5%瓊脂糖凝膠電泳，然后紫外光照射顯帶，確定與引物互補(bǔ)的DNA序列甲基化狀態(tài)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并根據(jù)電泳條帶情況進(jìn)行判定：（1）甲基化特異性引物擴(kuò)增出目的條帶，而非甲基化特異性引物未擴(kuò)增出條帶，為甲基化；（2）非甲基化特異性引物擴(kuò)增出目的條帶，而甲基化引物未擴(kuò)增出條帶，為非甲基化；（2）對(duì)引物均能擴(kuò)增出目的條帶的半甲基化，判斷為甲基化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用log-rank法比較不同miR-34a啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的結(jié)直腸癌患者總生存率、無(wú)病生存率。結(jié)直腸癌預(yù)后危險(xiǎn)因素的分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 miR-34a甲基化引物信息

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織中miR34-a啟動(dòng)子區(qū)甲基化率比較 結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織中miR34-a啟動(dòng)子區(qū)甲基化率分別為47.9%（23/48）、43.8%（21/48），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），檢測(cè)所得電泳圖見圖1。

圖1 結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織中miR34-a啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)檢測(cè)電泳圖（M：甲基化；U：非甲基化）

2.2 結(jié)直腸癌組織miR34a啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與患者臨床特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織miR34a啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤最大直徑、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等無(wú)關(guān)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表 2。

2.3 結(jié)直腸癌組織miR34a啟動(dòng)子區(qū)甲基化與患者預(yù)后的關(guān)系 本組患者隨訪時(shí)間15～100[52（42，79）]個(gè)月。23例結(jié)直腸癌組織甲基化患者1、3、5年生存率分別為100.0%、69.6%和 34.8%，25例非甲基化患者 1、3、5年生存率分別為100.00%、88.0%和72.0%。甲基化患者總生存率、無(wú)病生存率均低于非甲基化患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖 2-3。

2.4 結(jié)直腸癌預(yù)后危險(xiǎn)因素分析 經(jīng)單因素分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、miR-34a啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與患者預(yù)后有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；性別、年齡、腫瘤最大直徑、病理組織學(xué)類型、分化程度、浸潤(rùn)深度與預(yù)后均無(wú)關(guān)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。將上述單因素分析結(jié)果P＜0.05的因素納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析，結(jié)果顯示遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），miR-34a啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)不是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＞0.05），見表3。

表2 結(jié)直腸癌組織miR34a啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與患者臨床特征的關(guān)系[例（%）]

表3 結(jié)直腸癌預(yù)后危險(xiǎn)因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析

3 討論

miRNA主要通過促進(jìn)靶mRNA的降解或抑制其翻譯過程來(lái)發(fā)揮調(diào)控作用，廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡、代謝及分化等過程。Monzo等[6]首次研究表明，結(jié)直腸癌及腺瘤性息肉組織中miR-143、miR-145表達(dá)明顯下調(diào)，并提出結(jié)直腸癌組織中存在特異性miRNA表達(dá)譜。隨后，結(jié)直腸癌組織特異性miRNA表達(dá)譜的測(cè)定以及其與患者臨床特征的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)。miR-34a位于人染色體1p36.23，該位點(diǎn)多伴隨著多個(gè)基因的缺失或突變，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。在乳腺癌、肺癌組織中，miR-34a表達(dá)常下降或缺失；但關(guān)于其在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，各研究結(jié)果尚不統(tǒng)一[4，7-9]。最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a在其啟動(dòng)子區(qū)具有p53蛋白結(jié)合位點(diǎn)，是p53直接下游靶基因，受p53激活轉(zhuǎn)錄，通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（cyclinE2、cdk6等）的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，或通過抑制下游BCL-2靶基因來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[10]。Hiroshi等[9]在大腸癌細(xì)胞系HCT116和RKO中，觀察到miR-34a有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

圖2 結(jié)直腸癌組織miR34a啟動(dòng)子區(qū)甲基化與非甲基化患者總生存率的曲線

圖3 結(jié)直腸癌組織miR34a啟動(dòng)子區(qū)甲基化與非甲基化患者無(wú)病生存率的曲線

甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式之一。DNA甲基化在調(diào)控細(xì)胞正常發(fā)育、基因表達(dá)模式及基因組的穩(wěn)定性中起著重要作用。DNA甲基化主要發(fā)生于CpG二核苷酸的胞嘧啶上。這些常在基因上游調(diào)控區(qū)的啟動(dòng)子區(qū)高度聚集的CpG二核苷酸，稱為CpG島。在人類許多腫瘤中，都能發(fā)現(xiàn)不同程度的CpG島異常甲基化現(xiàn)象，表現(xiàn)為基因組整體甲基化下調(diào)，抑癌基因調(diào)控區(qū)域甲基化上調(diào)[11]。本研究檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分患者結(jié)直腸癌組織miR-34a甲基化較高，但與癌旁正常組織比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與本研究樣本量較小有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中miR-34a基因CpG島甲基化狀態(tài)與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)，與患者預(yù)后無(wú)關(guān)。甲基化狀態(tài)與預(yù)后呈相關(guān)性，提示甲基化狀態(tài)的改變可能參與腫瘤增殖轉(zhuǎn)移過程，并影響預(yù)后。DNA甲基化修飾可能調(diào)控腫瘤細(xì)胞中相關(guān)miRNA的表達(dá)。Satio等[12]較早發(fā)現(xiàn)DNA甲基化可能會(huì)影響miRNA的表達(dá)，同時(shí)指出DNA甲基化和組蛋白修飾調(diào)控miR-127的表達(dá)，且甲基化與組蛋白修飾間存在一定的協(xié)同作用；miRNA不僅參與表觀遺傳的調(diào)控（DNA甲基化），還受到DNA甲基化等表觀遺傳影響。有研究報(bào)道m(xù)iR-34a在宮頸癌、食管癌、肝癌等多種腫瘤組織中呈CpG島高甲基化狀態(tài)，且高甲基化所致的表達(dá)沉默或下調(diào)可能導(dǎo)致下游靶標(biāo)增殖或凋亡相關(guān)癌蛋白高表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5，13-16]。有研究在結(jié)直腸癌中也發(fā)現(xiàn)了一些相關(guān)miRNA存在甲基化調(diào)節(jié)機(jī)制[17]。某研究表明，結(jié)直腸癌中miR-34a低表達(dá)者，其啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平較高，兩者呈負(fù)相關(guān)[18]。本研究Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示，僅遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，miR-34a啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)尚不能作為獨(dú)立預(yù)測(cè)因子；這可能與樣本量較小有關(guān)，也可能是miR-34a與下游靶分子形成交叉網(wǎng)絡(luò)作用，而非獨(dú)立作用。以上猜想仍需后續(xù)機(jī)制研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，miR-34a啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及預(yù)后有關(guān)，可能參與腫瘤進(jìn)展轉(zhuǎn)移過程的調(diào)控。