傅曉華 朱晶 舒靜

非酒精性脂肪肝是一種與胰島素抵抗、遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，不僅可以導(dǎo)致肝病性殘疾和死亡，也是2型糖尿病、心血管疾病的危險因素[1-2]。肝臟脂肪的合成和分泌增加，脂肪氧化和排出減少，可導(dǎo)致肝臟脂肪堆積過多[3]。研究表明，絕經(jīng)后女性非酒精性脂肪肝患病率明顯高于絕經(jīng)前女性，提示雌激素在非酒精性脂肪肝的發(fā)生、發(fā)展中可能具有一定的作用[4-5]。目前關(guān)于低水平雌激素導(dǎo)致脂肪肝的機(jī)制尚未清楚。有學(xué)者認(rèn)為，肝臟脂質(zhì)代謝失調(diào)是非酒精性脂肪肝發(fā)展的先決條件[6]。TG是甘油和游離脂肪酸反應(yīng)的產(chǎn)物，是肝脂質(zhì)的主要形式。肝內(nèi)TG的合成與分泌發(fā)生不平衡，可導(dǎo)致TG在肝細(xì)胞中累積，這是脂肪肝的主要特征[7]。水通道蛋白7（AQP7）是一種水-甘油轉(zhuǎn)運蛋白，與成人肥胖癥關(guān)系密切[8]。在脂肪細(xì)胞中，AQP7缺乏會增加甘油激酶活性，增強(qiáng)TG合成，最終導(dǎo)致肥胖[9]。本研究擬探討雌激素對人肝癌HepG2細(xì)胞脂肪變性的作用及AQP7表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器 HepG2細(xì)胞（中國科學(xué)院上海分院細(xì)胞庫）、FBS（批號 56987，中國碧云天公司）、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（批號632547，美國 GE Healthcare Life Sciences公司），青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺（批號4789、21047、54784，美國 Sigma公司），油酸（批號14596，中國碧云天公司），雌激素（批號XS5874，美國賽默飛世公司），噻唑藍(lán)（MTT，批號15487，美國賽默飛世公司），結(jié)晶紫（批號45642132，碧云天科技公司），油紅O溶液（批號20149，美國 Sigma-aldrich公司），蘇木素（批號 BG7895，美國Sigma Aldrich公司），混合-R型（Hybrid-R）試劑盒（批號 QA14789，韓國 Gene All公司），蛋白酶抑制劑混合物（批號154789，德國Roche Diagnostics公司），AQP7一抗（批號 21569，1∶3 000，美國Danvers公司），β-肌動蛋白（批號20165，美國Santa Cruz Biotechnology公司），電化學(xué)發(fā)光（ECL）溶液（批號6547，美國EMD Millipore Corporation公司）。Bio-Rad 680型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司），貝克曼AU-480全自動生化儀（美國貝克曼公司），LeGene VF789 cDNA合成系統(tǒng)（美國LeGene Bioscience公司），Step One軟件（美國Life Technologies公司），Davinch ChemiTM化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（韓國Davinch-K公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2細(xì)胞置于Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（含 10%FBS、100mg/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素、2mmol谷氨酰胺），在37℃、含混合氣體（95%O2+5%CO2）的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。隨后用0.25%胰蛋白酶消化。

1.3 細(xì)胞分組與處理 將HepG2細(xì)胞分為4組，各組每孔設(shè)6個平行樣，培養(yǎng)72h。（1）HepG2細(xì)胞組：取10ml HepG2細(xì)胞液（細(xì)胞濃度為5×106/ml）放入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、含混合氣體（5%CO2+2%O2+93%N2）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（2）脂肪變模型組：DMEM培養(yǎng)液中加入200μl濃度為2.0mM的油酸溶液，其余同（1）。（3）雌激素低劑量組：再加入 500μl濃度為 40.0μg/ml的雌激素，其余同（2）。（4）雌激素高劑量組：再加入500μl濃度為80.0μg/ml的雌激素，其余同（2）。

1.4 細(xì)胞存活率測定 采用MTT法。將各組培養(yǎng)結(jié)束的HepG2細(xì)胞按1.5×103個/孔的密度接種于96孔板中，孵育48h。然后加入100μl MTT溶液處理2h。4h后抽吸除去MTT溶液，將結(jié)晶紫溶解在二甲基亞砜（DMSO）中。使用Bio-Rad 680型酶標(biāo)儀在570nm處讀取吸光度（OD）。細(xì)胞存活率=（OD實驗組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）。

1.5 細(xì)胞脂滴面積比測定 采用油紅O溶液染色法。細(xì)胞用PBS洗滌3次，10%甲醛溶液固定1h，用蒸餾水洗滌3次，60%異丙醇洗滌2次，60%過濾的油紅O溶液（0.7g/200ml異丙醇）在室溫下孵育30min。再用水洗滌1次，蘇木精染色，加入異丙醇后室溫下振蕩5min。使用Bio-Rad 680型酶標(biāo)儀在510nm處讀取OD，并計算HepG2細(xì)胞脂滴面積比。脂滴面積比=（OD實驗組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）。

1.6 TG水平檢測 收集HepG2細(xì)胞上清液，使用貝克曼AU-480全自動生化儀測定HepG2細(xì)胞TG水平。采用尼羅紅染色法，觀察各組HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴顆粒堆積情況。

1.7 AQP7 mRNA表達(dá)檢測 采用RT-PCR法。使用Hybrid-R試劑盒從HepG2細(xì)胞中分離總RNA。再用LeGene第一鏈cDNA合成系統(tǒng)將cDNA與1μg總RNA雜交。使用RT-PCR儀測定AQP7mRNA相對表達(dá)量。使用Step One軟件測定樣品的2-ΔΔCt值。設(shè)GAPDH為內(nèi)源對照。GAPDH基因的正向引物序列：5′-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3′，反向引物序列：5′-GCGGCACGTCAGATCCA-3′；AQP7基因的正向引物序列：5′-GACGACCTCAACGCACAGTA-3′，反向引物序列：5′-AGGAGTCCCATGATGAGATTGT-3′。

1.8 AQP7蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法。洗滌細(xì)胞并用PBS刮擦，在含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解液中溫育。在12%十二烷基硫酸鈉-丙烯酰胺凝膠中分離相同量的總蛋白質(zhì)（20μg）并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。使用AQP7一抗孵育，隨后將膜與第二抗體（1∶10 000稀釋）一同溫育，β-肌動蛋白作為內(nèi)參。使用DavinchChemi TM化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、ECL溶液檢測蛋白印跡。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組HepG2細(xì)胞存活率比較 HepG2細(xì)胞組、脂肪變模型組、雌激素低劑量組、雌激素高劑量組細(xì)胞存活率分別為（99.12±0.03）%、（22.63±9.65）%、（48.69±8.63）%、（61.63±9.69）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與HepG2細(xì)胞組比較，脂肪變模型組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05）；與脂肪變模型組比較，雌激素低、高劑量組細(xì)胞存活率均明顯升高（P＜0.05）；雌激素高劑量組細(xì)胞存活率明顯高于雌激素低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 4組HepG2細(xì)胞脂滴面積比比較 HepG2細(xì)胞組、脂肪變模型組、雌激素低劑量組、雌激素高劑量組脂滴面積比分別為（2.65±0.69）%、（12.65±1.21）%、（7.54±1.63）%、（3.69±1.65）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與HepG2細(xì)胞組比較，脂肪變模型組脂滴面積比升高（P＜0.05）；與脂肪變模型組比較，雌激素低、高劑量組脂滴面積比均明顯降低（均P＜0.05）；雌激素高劑量組脂滴面積比明顯低于雌激素低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 4組HepG2細(xì)胞脂滴面積比較（a：HepG2細(xì)胞組；b：脂肪變模型組；c：雌激素低劑量組；d：雌激素高劑量組；蘇木素染色法，×200）

2.3 4組HepG2細(xì)胞TG水平比較 HepG2細(xì)胞組、脂肪變模型組、雌激素低劑量組、雌激素高劑量組TG水平分別為（0.87±0.33）、（5.99±0.32）、（3.32±0.32）、（1.34±0.32）mmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與HepG2細(xì)胞組比較，脂肪變模型組TG水平明顯升高（P＜0.05）；與脂肪變模型組比較，雌激素低、高劑量組TG水平均明顯降低（均P＜0.05）；雌激素高劑量組TG水平明顯低于雌激素低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。各組HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴顆粒堆積情況，見圖2（插頁）。

圖2 4組HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴顆粒堆積情況比較（a：HepG2細(xì)胞組；b：脂肪變模型組；c：雌激素低劑量組；d：雌激素高劑量組；尼羅紅染色法，×200）

2.4 4組HepG2細(xì)胞AQP7 mRNA及蛋白表達(dá)比較 4組HepG2細(xì)胞AQP7 mRNA及蛋白相對表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與HepG2細(xì)胞組比較，脂肪變模型組AQP7 mRNA及蛋白相對表達(dá)量均明顯降低（均P＜0.05）；與脂肪變模型組比較，雌激素低、高劑量組AQP7 mRNA及蛋白相對表達(dá)量均明顯升高（均P＜0.05）；雌激素高劑量組AQP7 mRNA及蛋白相對表達(dá)量均明顯高于雌激素低劑量組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。4組HepG2細(xì)胞AQP7蛋白表達(dá)的電泳圖，見圖3。

2.5 HepG2細(xì)胞AQP7 mRNA及蛋白表達(dá)與脂滴面積比、TG水平的相關(guān)性 4組HepG2細(xì)胞AQP7 mRNA及蛋白相對表達(dá)量與脂滴面積比、TG水平均呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05），見表 2。

表1 4組HepG2細(xì)胞AQP7mRNA及蛋白表達(dá)比較

圖3 4組HepG2細(xì)胞AQP7蛋白表達(dá)的電泳圖（a：HepG2細(xì)胞組；b：脂肪變模型組；c：雌激素低劑量組；d：雌激素高劑量組）

表2 HepG2細(xì)胞AQP7 mRNA及蛋白表達(dá)與脂滴面積比、TG水平的相關(guān)性（r值）

3 討論

絕經(jīng)是女性生命周期中發(fā)生的自然過程。絕經(jīng)期間發(fā)生的卵巢分泌雌激素減少，被認(rèn)為是骨質(zhì)疏松癥、卒中、肝臟疾病等多種疾病的主要原因。女性絕經(jīng)狀況與非酒精性脂肪肝風(fēng)險升高有關(guān)，但其潛在的分子機(jī)制仍未清楚。有實驗建立大鼠卵巢切除術(shù)（OVX）模型來評估雌激素耗竭對肝脂肪變性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)相關(guān)的雌激素減少與骨丟失風(fēng)險增加、內(nèi)臟肥胖、肝臟脂肪變性等相關(guān)[10]。然而，在雌激素拮抗劑處理小鼠的肝臟標(biāo)本中可觀察到脂肪變性，同時脂肪生成基因乙酰輔酶A羧化酶、脂肪酸合成酶、甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶等表達(dá)上調(diào)；但雌激素補(bǔ)充可減輕OVX誘導(dǎo)的肝脂肪變性，降低脂肪生成基因的表達(dá)水平[11]。本實驗從細(xì)胞水平探討了雌激素對HepG2細(xì)胞脂肪變性的影響。結(jié)果顯示，與HepG2細(xì)胞組比較，脂肪變模型組細(xì)胞存活率降低，脂滴面積比、TG水平均升高；與脂肪變模型組比較，雌激素低、高劑量組細(xì)胞存活率升高，脂滴面積比、TG水平均降低；與雌激素低劑量組比較，雌激素高劑量組細(xì)胞存活率升高，脂滴面積比、TG水平均降低。同時還發(fā)現(xiàn)，雌激素能抑制油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變性的程度。

相關(guān)研究表明，雌激素通過細(xì)胞內(nèi)激素特異性雌激素受體的信號來調(diào)節(jié)人體生理學(xué)[12-14]。在AQP中檢測到的功能性雌激素反應(yīng)元件，包括AQP5、AQP2、AQP7[15-16]。研究表明，AQP7能調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞甘油滲透性，從而控制TG積累和脂肪細(xì)胞大小[17-18]。本研究假設(shè)AQP7可能作為雌激素的靶基因，并在油酸誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性中發(fā)揮作用。結(jié)果表明，油酸處理能下調(diào)肝臟中AQP7的表達(dá)，提示AQP7參與低雌激素誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累。為進(jìn)一步研究AQP7在雌激素耗竭誘導(dǎo)脂質(zhì)積累過程中的功能，筆者分析了高、低劑量雌激素對HepG2細(xì)胞AQP7 mRNA及蛋白表達(dá)的影響；結(jié)果顯示，與HepG2細(xì)胞組比較，脂肪變模型組AQP7 mRNA及蛋白相對表達(dá)量均降低；與脂肪變模型組比較，雌激素低、高劑量組AQP7 mRNA及蛋白相對表達(dá)量均升高；與雌激素低劑量組比較，雌激素高劑量組AQP7 mRNA及蛋白相對表達(dá)量均升高。以上結(jié)果表明雌激素能通過上調(diào)AQP7表達(dá)來減少脂肪生成。

綜上所述，雌激素能抑制油酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂肪變性，其機(jī)制可能與雌激素能上調(diào)AQP7表達(dá)有關(guān)。但本研究僅為單純的體外細(xì)胞實驗，雌激素誘導(dǎo)AQP7轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制需要進(jìn)一步研究證實。