支紹冊 鄭來贊 洪廣亮 陳隆望 李海嘯 倪菁晶 李萌芳 趙光舉 盧中秋

膿毒癥是宿主對感染反應失調(diào)而導致器官功能障礙的疾病狀態(tài)，已成為全球日益嚴重的健康問題[1-2]。盡管早期液體復蘇、新型抗生素和器官功能支持等治療措施使治療效果有了重大進步，但膿毒癥的死亡率仍然居高不下，達30%～50%[3-4]。姜黃素是姜黃的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗誘變等作用，并且對免疫系統(tǒng)有著重要調(diào)節(jié)作用，可降低脂多糖（LPS）誘導膿毒癥小鼠的病死率[5-8]。線粒體融合蛋白 2（mitofusin2，Mfn2）位于線粒體外膜中，在線粒體融合/分裂的動態(tài)平衡中及維持線粒體和細胞功能方面發(fā)揮重要作用，具有抗細胞凋亡作用，包括卵巢、神經(jīng)元和缺血/再灌注損傷后的心臟[9-13]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以明顯減少膿毒癥小鼠T淋巴細胞的凋亡，并且能夠上調(diào)T淋巴細胞Mfn2表達[14-15]。因此，本研究通過構建小鼠盲腸結扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）模型，利用腺相關病毒轉染調(diào)控Mfn2表達，觀察Mfn2在姜黃素干預膿毒癥T淋巴細胞凋亡中的作用，從線粒體融合和切割的角度揭示姜黃素在膿毒癥時對細胞免疫的調(diào)節(jié)機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 成年健康雄性Balb/c小鼠165只，體重20～25g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證編號：SYXK（浙）2015-0009。25°C 恒溫（濕度 50%）和12h光照/12h黑暗周期性變化條件下飼養(yǎng)。適應環(huán)境7d后，隨機分成以下8組：假手術組、膿毒癥組、姜黃素干預組、姜黃素對照組、Mfn2干擾膿毒癥組、Mfn2干擾姜黃素治療組、陰性對照病毒膿毒癥組、陰性對照病毒姜黃素組，每組15只；剩余小鼠隨機分為正常組、陰性病毒組、Mfn2干擾組，用于檢測病毒轉染效率，每組15只。通過CLP誘導小鼠膿毒癥模型[16]。給予水但不給食物過夜后，予戊巴比妥鈉40～80mg/kg麻醉小鼠。將暴露的盲腸從自由端1cm處結扎，并在中間用21G針刺破，糞便被壓出以確保穿刺的通暢性。然后返回腸環(huán)，關閉腹壁。此后，皮下給予0.9%氯化鈉注射液1ml進行液體復蘇。假手術組除了盲腸未結扎或穿刺外，對小鼠進行相同的手術。在最初6h內(nèi)，存活率為100%，且小鼠出現(xiàn)抑郁和腹瀉等典型癥狀，表明建模成功。CLP后72h的病死率約為40%～60%。姜黃素干預組及姜黃素對照組予灌胃姜黃素200mg/（kg·d）1周（姜黃素溶解在玉米油中），陰性病毒膿毒癥組及陰性病毒姜黃素組通過尾靜脈注射陰性腺相關病毒建立模型，Mfn2干擾膿毒癥組及Mfn2干擾姜黃素組通過尾靜脈注射攜帶Mfn2干擾序列腺相關病毒建立模型。

1.2 主要試劑和儀器 線粒體膜電位檢測試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）；姜黃素（美國Sigma公司）；玉米油（上海太陽能生物科技有限公司）。凋亡試劑盒（美國BD公司）；小鼠脾臟組織淋巴細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo Scientific公司）；兔抗小鼠Mfn2單抗（英國 Abcam 公司）；兔抗小鼠 Bcl-2、Bax、β-actin單抗、山羊抗兔二抗（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.3 方法

1.3.1 腺相關病毒的構建和轉染 攜帶Mfn2干擾序列的腺相關病毒載體由中國上海吉凱公司構建。根據(jù)制造商的說明，陰性病毒組小鼠將陰性病毒液通過尾靜脈注射滴度為1.38×1012g/ml的腺相關病毒，Mfn2干擾組用同樣方法注射攜帶eGFP的滴度為3.32×1012g/ml重組腺相關病毒。2周后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，固定、消毒后取小鼠脾臟，進行冰凍切片后于熒光顯微鏡下觀察脾臟組織熒光強弱。通過Western blot法檢測陰性病毒以及下調(diào)后脾臟淋巴細胞的Mfn2表達水平，Western blot法檢測步驟見1.3.3。通過以上方法檢測腺相關病毒的轉染效率。轉染成功后，取陰性病毒膿毒癥組、陰性病毒姜黃素組、Mfn2干擾組膿毒癥組、Mfn2干擾組姜黃素組小鼠脾淋巴細胞進行流式細胞術檢測細胞凋亡情況。

1.3.2 脾單個核細胞的分離 8組小鼠CLP建模后24h采用頸椎脫臼法處死，固定、消毒后取小鼠脾臟，置于含有預冷PBS的培養(yǎng)皿中，轉移到超凈臺，剝?nèi)テ⑴K被膜并放至大培養(yǎng)皿上的400目篩網(wǎng)上，輕輕研磨，用PBS沖洗、過濾，收集細胞懸浮液。1 500r/min離心10min，棄上清液。以4ml PBS重新懸浮細胞，加入4ml小鼠器官淋巴細胞分離液，差速離心機3 000r/min離心15min，取第二層霧化細胞層，以預冷的PBS洗滌2次，細胞計數(shù)板進行計數(shù)。

1.3.3 Western blot法檢測 Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白表達水平 細胞收集后，用預冷的裂解緩沖液裂解細胞，用超聲波細胞破碎機將細胞破碎3次，然后在4℃以14 000r/min離心20min。使用BCA方法檢測上清液中的蛋白質濃度后將蛋白質與適當?shù)腟DS上樣緩沖液混合，然后在95℃下煮沸5min。在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中分離蛋白質，隨后轉移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。在室溫下用5%脫脂乳封閉2h后，將膜與抗-Mfn2（1：1 000）和抗 β-actin（1∶1 000）抗體在4℃下過夜孵育。此外，孵育Caspase-3、Bcl-2、Bax抗體需要12%Tris-HCl十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠。然后，與辣根過氧化物酶-（HRP-）綴合的山羊抗兔二抗（1∶5 000）在室溫下孵育1h。TBST洗滌后，使用ECL顯影，用圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值。

1.3.4 流式細胞術分析細胞凋亡情況 通過離心收集的細胞（以1 000r/min離心8min）用PBS洗滌細胞2次（以1 000r/min離心8min），并收集約5×105個細胞。隨后，加入500μl 1×結合緩沖液懸浮細胞，然后加入5μl的膜聯(lián)蛋白V-FITC和5μl的 PI，在室溫下混合，避光，并孵育反應15min。在1h內(nèi)通過使用FACSCalibur（BD Biosciences，Mountain View，CA）流式細胞儀分析各組小鼠脾臟T淋巴細胞，計算細胞凋亡率。

1.3.5 線粒體膜電位 取5×105個細胞，重懸于0.5ml PBS中，加入0.5ml JC-1染色工作液，倒置數(shù)次混合，然后置于37℃的細胞培養(yǎng)箱中20min。孵育后，將細胞在4℃下以600g離心4min，沉淀細胞，除去上清液，用預冷的1×JC-1染色緩沖液洗滌細胞2次，然后重懸于適當?shù)腏C-1染色緩沖液。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，以單體存在時，流式細胞術可檢測到綠色熒光，而以多聚體存在時，流式細胞術可檢測到紅色熒光。JC-1單體和多聚體之間轉變可逆，當細胞凋亡增加時，多轉變?yōu)閱误w狀態(tài)。在1h內(nèi)通過使用FACSCalibur流式細胞儀分析各組小鼠脾臟T淋巴細胞。

圖1 腺相關病毒介導下調(diào)Mfn2（a：正常組；b：陰性病毒組；c：Mfn2干擾組）

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖2 3組小鼠脾臟淋巴細胞Mfn2表達水平的比較（與正常組比較，*P＜0.05；與陰性對照組比較，△P＜0.05）

2 結果

2.1 Mfn2干擾腺相關病毒轉染效率的驗證 小鼠尾靜脈注射攜帶eGFP的腺相關病毒后，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，Mfn2干擾組小鼠脾臟可見明顯的綠色熒光（圖1，插頁），提示病毒已轉染小鼠脾臟組織。提取小鼠脾臟淋巴細胞通過Western blot檢測Mfn2干擾組小鼠轉染效率為0.156±0.027，相對于正常組小鼠的0.423±0.113明顯降低（P＜0.01），下調(diào)程度＞60%，說明Mfn2下調(diào)有效，可用于后續(xù)實驗（圖2）。

2.2 姜黃素干預對膿毒癥T淋巴細胞凋亡的影響 假手術組、膿毒癥組、姜黃素干預組以及姜黃素對照組T淋巴細胞凋亡率分別為（21.017±8.564）%、（50.733±6.802）%、（29.020±0.563）%、（29.810±1.745）%，4 組凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，膿毒癥組淋巴細胞凋亡率較假手術組明顯增加（P＜0.01）；與膿毒癥組相比，姜黃素干預組淋巴細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），而姜黃素對照組與假手術組的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖3）。

2.3 姜黃素干預對膿毒癥T淋巴細胞線粒體膜電位的影響 經(jīng)CLP造模后，脾臟淋巴細胞從原先的紅光多聚體慢慢釋放為綠光單體，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而姜黃素干預后發(fā)現(xiàn)，JC-1重新轉化為紅光多聚體，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明姜黃素干預后，造模后小鼠脾臟淋巴細胞凋亡明顯減少（圖4，插頁）。

2.4 姜黃素對膿毒癥小鼠T淋巴細胞Mfn2表達的影響 膿毒癥組小鼠在造模24h后取脾臟T淋巴細胞，Mfn2表達（0.473±0.579）較假手術組（2.576±1.139）明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；姜黃素干預后，膿毒癥組小鼠脾臟T淋巴細胞的Mfn2表達（2.489±0.874）較膿毒癥組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而姜黃素對照組（2.034±1.337）小鼠脾臟T淋巴細胞的Mfn2表達與假手術組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖 5）。

圖3 流式細胞術AnnexinV/PI雙染法檢測淋巴細胞凋亡（采取右上象限以及右下象限之和來比較各組間的凋亡差異；與假手術組比較，*P＜0.05；與膿毒癥組比較，△P＜0.05）

圖4 流式細胞術線粒體膜電位的檢測（右下角數(shù)值代表膜電位降低率；與假手術組相比，*P＜0.05；與膿毒癥組相比，△P＜0.05）

圖5 各組小鼠脾臟淋巴細胞的Mfn2表達水平（與假手術組比較，*P＜0.05；與膿毒癥組比較，**P＜0.05）

2.5 下調(diào)Mfn2后，姜黃素對膿毒癥中淋巴細胞凋亡作用的影響 陰性病毒姜黃素組（25.347±4.099）與陰性病毒膿毒癥組（45.507±4.527）比較仍有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。而 Mfn2干擾姜黃素組（33.010±3.721）較 Mfn2干擾膿毒癥組（27.490±1.595）高，但差異無統(tǒng)計學意義。與陰性病毒膿毒癥組比較，Mfn2干擾膿毒癥組無統(tǒng)計學差異（圖6），說明下調(diào)Mfn2后，姜黃素對膿毒癥小鼠淋巴細胞凋亡作用的影響降低或者消失。陰性病毒姜黃素組線粒體膜電位降低率較陰性病毒膿毒癥組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而Mfn2干擾姜黃素組線粒體膜電位較Mfn2干擾膿毒癥組稍有降低，但差異無統(tǒng)計學意義（圖7，插頁）。

2.6 下調(diào)Mfn2后，姜黃素對膿毒癥小鼠Caspase-3、Bcl-2/Bax表達的影響 與假手術組Caspase-3（0.615±0.146）相比，膿毒癥組（1.935±0.145）小鼠脾臟淋巴細胞的明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），姜黃素干預組（0.868±0.202）較膿毒癥組明顯升高（P＜0.05）。當Mfn2下調(diào)后，與Mfn2干擾膿毒癥組（1.954±0.770）相比，Mfn2干擾姜黃素干預組 Caspase-3（1.816±0.075）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與假手術組Bcl-2/Bax（1.397±0.272）相比，膿毒癥組（0.269±0.101）小鼠脾臟淋巴細胞的明顯降低（P＜0.05），姜黃素干預組（2.060±1.217）較膿毒癥組明顯升高（P＜0.05）。當Mfn2下調(diào)后，與Mfn2干擾膿毒癥組（1.014±0.601）相比，Mfn2干擾姜黃素干預組（0.963±0.276）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖 8）。

3 討論

膿毒癥是一種由感染引起的全身炎癥反應綜合征，其發(fā)病率及病死率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅著人類生命健康。大量研究表明，大多數(shù)晚期膿毒癥患者死于免疫抑制而非僅限于炎癥反應[17-18]。在膿毒癥期間，存在大量T淋巴細胞凋亡，免疫功能紊亂，是組織器官功能障礙和死亡的重要原因[19-20]。迄今為止，膿毒癥治療仍缺乏特效的藥物[21]。姜黃素是一種姜科植物姜黃中提取的多酚類物質，是姜黃的主要活性成分之一[22-23]。已被許多研究證實用于治療膿毒癥，但其具體機制尚不清楚。Rana等[24]證明姜黃素提取物可以調(diào)節(jié)IPAK-MAPK信號通路發(fā)揮抗炎作用。而Siddiqui等[25]在一項前瞻性研究中也指出姜黃素可能是通過過氧化物酶體增殖物激活受體-γ的上調(diào)對膿毒癥小鼠有治療作用。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能抑制膿毒癥T淋巴細胞凋亡，預先給予姜黃素保護則顯著上調(diào)調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的比例，進而降低膿毒癥炎癥反應和器官損傷[26]。

圖6 流式細胞術AnnexinV/PI雙染法檢測淋巴細胞凋亡（與陰性病毒膿毒癥組比較，*P＜0.05）

圖7 流式細胞術線粒體膜電位的檢測（與陰性病毒膿毒癥組相比，*P＜0.05）

圖8 Western blot法檢測Caspase-3、Bcl-2/Bax表達水平（與假手術組比較，*P＜0.05；與膿毒癥組比較，**P＜0.05；與陰性病毒姜黃素干預組比較，***P＜0.05）

早在2008年Weber等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥中，T淋巴細胞在循環(huán)系統(tǒng)中表現(xiàn)出廣泛的細胞凋亡，并提出該細胞在膿毒癥中起重要作用。細胞凋亡主要通過死亡受體活化途徑、線粒體途徑以及內(nèi)質網(wǎng)途徑3條途徑調(diào)控，其中線粒體途徑在細胞凋亡過程中最為重要。線粒體是一種動態(tài)細胞器，根據(jù)細胞的需要，不斷移動，融合和分裂，形成動態(tài)平衡[28-29]。越來越多的證據(jù)表明，這種線粒體穩(wěn)態(tài)對先天免疫反應和T細胞功能有重要影響[30-31]。膿毒癥期間，線粒體穩(wěn)態(tài)失衡是其導致細胞凋亡及器官衰竭的重要原因之一。其中Mfn2是治療許多疾病的靶基因，也是維持線粒體穩(wěn)態(tài)的關鍵蛋白[32-33]。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥小鼠的Mfn2表達較假手術組明顯降低，而姜黃素干預后，Mfn2表達較膿毒癥組升高，符合姜黃素改善線粒體重塑的研究[34]。

本研究中同樣發(fā)現(xiàn)姜黃素可有效抑制膿毒癥小鼠淋巴細胞線粒體途徑凋亡，而T淋巴細胞凋亡的減少可以降低膿毒癥小鼠的死亡率，從而增強機體的免疫功能，并對膿毒癥起到保護作用[35-36]。Bcl-2是凋亡抑制蛋白，而Bax是凋亡促進蛋白，主要存在于細胞質中，在細胞受到凋亡刺激的情況下，細胞質中Bax蛋白轉移到線粒體中。Bcl-2/Bax變化能準確的反映細胞凋亡情況，膿毒癥組較正常組明顯降低，而姜黃素組該比值較膿毒癥組升高；Caspase-3是一種經(jīng)常被激活的死亡蛋白酶，催化許多關鍵細胞蛋白的特異性切割，對于細胞的解體和凋亡小體的形成相關的某些過程是必需，本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以降低膿毒癥Caspase-3的高表達，流式細胞術和線粒體膜電位也進一步明確了姜黃素的作用。而下調(diào)Mfn2后，姜黃素的上述作用較上調(diào)前明顯降低，說明姜黃素是通過Mfn2來降低淋巴細胞凋亡。此外，還需要進一步研究以提高其生物利用度，如納米粒子12或環(huán)孢菌素納米乳劑[37]，或通過藥物和其他方法的組合來提高姜黃素的療效[38]。

總之，姜黃素可通過Mfn2導致淋巴細胞凋亡減少，從而增強膿毒癥小鼠的免疫功能。本研究表明，姜黃素干預對膿毒癥小鼠有保護作用，并且該作用依賴于Mfn2。雖然已經(jīng)證實Mfn2在這方面發(fā)揮了作用，但仍有必要進一步研究其確切的機制。