謝媚媚 蘇震 羅勝男

腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是多種病因?qū)е碌穆阅I臟病進(jìn)展為腎功能衰竭過程中腎組織發(fā)生的主要病理改變[1]。RIF的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，至今仍未完全明確。microRNA（miRNA）是一類非編碼單鏈小RNA，長約18～24個核苷酸，與靶基因配對引起其降解或抑制其翻譯，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[2]。miRNA參與細(xì)胞凋亡、增殖、分化及炎癥、免疫反應(yīng)等重要的生理病理過程[3]。單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）能很好地模擬RIF過程，是經(jīng)典的RIF造模方法。高通量測序又稱下一代測序（next generation sequencing，NGS）[4]，常用于研究 miRNA。本研究使用NGS和實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測miR-132在UUO大鼠腎臟中的表達(dá)情況，并進(jìn)行Gene Ontology（GO）分析和Pathway分析預(yù)測其靶基因，探討miR-132是否參與RIF的發(fā)生、發(fā)展，為臨床治療RIF提供新的靶點。

1 材料和方法

1.1 材料 SD大鼠購于上海中科院；Trizol試劑購于美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒（SYBR Green I）購于日本東洋紡公司；RT-qPCR引物由上海Invitrogen公司設(shè)計并提供；PCR儀購于德國艾本德公司；RT-qPCR儀購于美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 UUO模型的建立及病理檢查 將24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)對照（sham）組，每組12只。采用10%水合氯醛0.4g/kg腹腔注射麻醉大鼠，游離左側(cè)輸尿管至腎盂處，模型組建立UUO模型，即在近腎盂處和輸尿管上1/3水平處用0號線結(jié)扎并切斷輸尿管，sham組僅游離左側(cè)輸尿管而不結(jié)扎、切斷輸尿管，逐層縫合腹壁。術(shù)后兩組大鼠在相同條件下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食以及飲水，于術(shù)后第1、3天采用頸椎脫臼法分批（每批6只）處死獲取腎臟組織標(biāo)本。大鼠腎組織行Masson染色評估RIF程度。

1.2.2 NGS及小RNA分析 術(shù)后第1、3天模型組大鼠采用Trizol法提取手術(shù)側(cè)和對側(cè)腎組織的總RNA（確定RNA濃度及鑒定純度采用紫外分光光度法），兩側(cè)分別取等量RNA進(jìn)行混合，從中分離出小RNA，再逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后制成文庫，使用Solexa測序法，采用Illumina Hiseq 2000測序儀測序。測序后的序列使用miRBase15.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，將miR-132表達(dá)量歸一化后計算fold-change值，公式為log2手術(shù)側(cè)/非手術(shù)側(cè)。本步驟委托華大基因中心完成。

1.2.3 RT-qPCR檢測miR-132的相對表達(dá)量 采用Trizol法提取術(shù)后1、3d模型組和sham組的總RNA，使用特異性莖環(huán)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系20μl，包括總 RNA 3μg、Oligo（dT）18 2μl、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1μl、RNase inhibitor 1μl、dNTP 1μl、DEPC 水加至20μl。反應(yīng)條件為 16℃ 30min，42℃ 30min，70℃ 15min，結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物于-20℃保存。RT-qPCR采用SYBR Green 法，反應(yīng)體系 20μl，其中前向引物 1.5μl、反向引物 1.5μl、 逆 轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 1μl、plus solution 2μl、SYBR Green I Master mix 10μl、雙蒸水加至 20μl。反應(yīng)條件為95℃ 120s預(yù)變性，95℃ 15s變性，60℃ 60s退火延伸，40個循環(huán)，所有樣品均作3個復(fù)孔。采用2－ΔΔCt法計算相對表達(dá)量[5]，miR-132以U6為內(nèi)參。ΔΔCt=[Ct miR-132（模型組）－Ct內(nèi)參（模型組）]－[Ct miR-132（sham 組）-Ct內(nèi)參（sham 組）]，sham 組的 ΔΔCt為 0[6]。

1.2.4 GO和Pathway分析 選擇Targetsan 5.1數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-132的靶基因?；贕O和KEGG數(shù)據(jù)庫，對預(yù)測的靶基因分別進(jìn)行GO注釋（功能注釋）和Pathway（信號通路）注釋，而后采用 χ2檢驗和 Fisher’s精確檢驗，計算GO以及Pathway的顯著性水平（標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05），得到具有顯著性意義的GO和Pathway注釋，然后從中挑選出可能與RIF有關(guān)的GO和Pathway注釋，取兩者所屬靶基因的交集，獲得具有顯著性意義的靶基因。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以表示，方差不齊者比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎組織Masson染色結(jié)果 sham組術(shù)后第1、3天腎組織未見異常。模型組術(shù)后第1天腎單位和間質(zhì)基本正常，術(shù)后第3天腎小管管腔輕度擴(kuò)張，間質(zhì)輕度水腫，可見散在間質(zhì)單個核細(xì)胞浸潤，腎小球結(jié)構(gòu)尚正常，見圖 1（插頁）。

2.2 NGS分析miR-132差異表達(dá) 與非手術(shù)側(cè)相比，手術(shù)側(cè)術(shù)后第1、3天均表達(dá)上調(diào)（均P＜0.01），術(shù)后第3天上調(diào)幅度較術(shù)后第1天大，見表1。

表1 NGS分析miR-132差異表達(dá)

2.3 RT-qPCR檢測miR-132的相對表達(dá)量 術(shù)后第1天模型組miR-132相對表達(dá)量為6.17±0.67，sham組為1±0；術(shù)后第3天模型組miR-132相對表達(dá)量為8.21±0.54，sham 組為 1±0；與 sham 組相比，術(shù)后第 1、3天模型組miR-132表達(dá)均明顯上調(diào)（均P＜0.05），且術(shù)后第3天上調(diào)幅度較術(shù)后第1天大。

2.4 GO和Pathway分析結(jié)果 經(jīng)Targetsan 5.1數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因后，得到226個靶基因，對其進(jìn)行GO和Pathway注釋取交集后，得到9個有顯著性意義的靶基因，分別為 Ep300、Ⅱ1a、Rras2、Ppp2r5e、Ccng1、Capn2、Ccl25、Ocln、Nrcam。

3 討論

近年來miRNA成為研究臟器纖維化的熱點，包括肝臟纖維化[7-8]、心臟纖維化[9-10]、肺纖維化[11-12]等。Mann等[13]發(fā)現(xiàn)miR-132作為甲基化CpG結(jié)合蛋白2（methyl-CpG binding protein 2，MeCP2）的翻譯抑制物而參與肝臟纖維化發(fā)生，目前鮮有文獻(xiàn)報道m(xù)iR-132與RIF之間的關(guān)系。

本研究中模型組術(shù)后第1天腎組織結(jié)構(gòu)未見明顯病變，術(shù)后第3天被認(rèn)為處于RIF早期階段，sham組未見異常。與sham組相比，術(shù)后1、3d模型組miR-132表達(dá)上調(diào)，相同時間點與非手術(shù)側(cè)相比，手術(shù)側(cè)miR-132表達(dá)上調(diào)，兩項結(jié)果都顯示術(shù)后第3天的上調(diào)幅度較術(shù)后第1天大，提示miR-132表達(dá)上調(diào)可能參與早期RIF的發(fā)生、發(fā)展。

本研究中miR-132經(jīng)預(yù)測、分析得到9個靶基因，其中Ep300在小鼠視交叉上核中證實是miR-132的靶基因[14]。Ep300是E-鈣黏附蛋白的轉(zhuǎn)錄激活因子，Ep300下調(diào)可以使E-鈣黏附蛋白表達(dá)下調(diào)，激活上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程[15]，而EMT是腎臟間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Ⅱ1a所編碼的是IL-1，涉及多種炎癥、免疫反應(yīng)，IL-1通過調(diào)節(jié)TGF-β表達(dá)與生物活性而調(diào)控EMT[16]。Rras2編碼的蛋白在控制細(xì)胞增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著重要的作用。Sharma等[17]報道Rras2通過激活Raf/MAPK通路介導(dǎo)NIH3T3成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

Ppp2r5e是調(diào)節(jié)細(xì)胞調(diào)亡的重要因子。Ppp2r5e在人胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，被認(rèn)為是miR-23a的靶基因，通過促進(jìn)凋亡來抑制胃癌細(xì)胞的生長。Ccng1編碼的細(xì)胞周期蛋白G1參與細(xì)胞凋亡與增殖、DNA損傷修復(fù)等多種生理過程，Li等[18]發(fā)現(xiàn)Ccng1是miR-9的下游靶基因，在卵巢癌化療耐藥細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)。

Capn2編碼的鈣蛋白酶2參與細(xì)胞骨架重塑，細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期的進(jìn)展，細(xì)胞凋亡等生理活動，Chen等[19]研究發(fā)現(xiàn)在人肝癌細(xì)胞中下調(diào)Capn2基因可以減少基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）的分泌，MMP-9可降解多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。Ccl25通過對骨髓源性肝干細(xì)胞具有趨化作用而參與肝臟纖維化發(fā)生、發(fā)展過程。Ocln編碼的緊密連接蛋白，是細(xì)胞間緊密連接的重要組成部分，在緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能維持中起著重要作用。Nrcam編碼的神經(jīng)細(xì)胞黏附分子能介導(dǎo)細(xì)胞間和細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的黏附作用。

在具體的GO注釋中，Ⅱ1a正向調(diào)節(jié)血管再生；Capn2參與缺氧應(yīng)答；Ep300參與缺氧應(yīng)答、調(diào)節(jié)膠原蛋白生物合成。在具體的Pathway注釋中，Ep300參與TGF-β信號通路；Rras2、Ⅱ1a參與MAPK信號通路；Il1a、Capn2參與細(xì)胞凋亡通路。以上功能注釋和參與的信號通路與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。

綜上所述，筆者推測miR-132表達(dá)上調(diào)可能通過以上靶基因參與激活EMT、細(xì)胞凋亡、減少細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解等過程而參與早期RIF的發(fā)生、發(fā)展，且可能是RIF進(jìn)展中的一個促進(jìn)因子。進(jìn)一步研究需對預(yù)測的miR-132靶基因進(jìn)行鑒定。