曹文娟 羅政強 徐飛 鄭澤航 吳驍偉

平板振動療法是近年來臨床上廣泛應用的一種治療方式，振動療法的治療效果與振動頻率、振動幅度及振動時間相關。低頻振動是指頻率低于100 Hz的振動，低頻振動對于肌肉萎縮性疾病有一定的療效［1］，其產生作用的機制主要為振動作用通過力學信號系統(tǒng)轉導至細胞內產生作用。在骨骼系統(tǒng)中，力學信號同樣有重要作用。機械應力信號能通過細胞表面的感受器轉化為生物學信號發(fā)揮作用［2］。低頻振動對骨骼系統(tǒng)產生作用是現階段的研究熱點之一［3］。振動可以增加人體的平衡感，增強肌力；同時，振動被認為可以促進成骨細胞活性，抵消衰老對骨質的影響，防止骨質流失［4］。現階段有較多振動對骨骼系統(tǒng)影響的研究，但結果并不一致，其原因可能為各研究的振動頻率和幅度不同［5-9］。

骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是骨骼系統(tǒng)中骨形成的主要來源細胞，其不僅可分化為成骨細胞而且能分泌相關細胞因子影響破骨細胞的形成與分化［10］。本研究采用低頻振動干預BMSCs 向成骨分化的進程，并檢測相關分泌因子，以明確低頻振動對BMSCs 成骨分化的影響。

材料與方法

一、分離、培養(yǎng)及鑒定小鼠BMSCs

取3 周齡C57BL/6 小鼠（由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物實驗遵守我院倫理委員會相關規(guī)定），麻醉后采用頸椎脫臼法處理小鼠。收集小鼠的雙側股骨與雙側脛骨，注射器沖洗取其內的BMSCs，采用全骨髓培養(yǎng)法進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為a-MEM（Hyclone 公司，美國）［10%胎牛血清（fetal calf serum, FCS；Gibico 公司，美國）+1%抗生素］。72 h進行換液，以后每3 d進行換液，細胞長到90%進行傳代。培養(yǎng)的第3代細胞分別進行誘導成骨細胞分化、脂肪細胞分化及軟骨細胞分化，誘導分化結束進行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色，油紅O 染色及阿利新藍染色（Sigma 公司，美國），并采用流式細胞學技術測定其細胞相關表面標志物。

二、體外低頻振動干預小鼠BMSCs的成骨分化

取第3 代BMSCs 進行成骨誘導，成骨誘導培養(yǎng)基為a-MEM含10%FCS，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，0.1 μmol/L 地塞米松，50 mg/L 維生素C。在誘導過程中采用平板振動臺（Juvent Health 公司，美國）進行低頻振動（15 Hz，垂直加速度0.3 g）干預，干預方式為每天一次，一次45 min，于干預第7天及第14天收獲細胞。對照組細胞，每天只將細胞放置在平板振動臺上45 min，但不進行振動干預，同樣于第7天及第14天收獲細胞。

三、ALP染色及茜素紅染色

將收獲的第7天細胞進行ALP染色，步驟如下：采用10%甲醛固定1 min，然后磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，加入BCIP染色液，避光環(huán)境下染色15 min。自來水下沖洗，保持稍濕潤。將收獲的第14天的細胞進行茜素紅染色，染色步驟如下：吸去培養(yǎng)基，PBS小心漂洗3次，4%的多聚甲醛固定30 min；吸去固定液，去離子水漂洗3 次，加入茜素紅染色液（pH 4.1～4.3），常溫下避光孵育45 min；小心吸去染色液，去離子水漂洗細胞至少4 次；最后一次加入PBS 保持細胞濕潤。

四、Real-time PCR分析

干預14 天后收獲細胞，每107個細胞加入1 ml Trizol 進行裂解，沖打后冰上靜置5 min，將Trizol 移至1.5 ml EP 管，加入0.2 ml 三氯甲烷，孵育3 min，4 ℃、1 200×g 離心15 min，將上層清液轉移到一個新的EP 管中，并加入0.5 ml 異丙醇，4 ℃、1 200×g離心10 min，EP管底部即為RNA，棄上清，再用75%乙醇洗滌所提RNA 一次，并調整兩組總RNA 濃度一致，采用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄為cDNA。Real-time PCR 檢測：Ⅰ型膠原蛋白（collagen type Ⅰ,ColⅠ），骨橋蛋白（osteopontin,OPN），骨鈣素（osteocalcin，OCN），骨保護素（osteoprotegerin, OPG）和破骨細胞分化因子（receptor activator of NF-κB ligand,RANKL）等基因的表達（內參選用18S）。所用引物序列如表1所示。

五、培養(yǎng)上清酶聯免疫吸附試驗（ELISA）分析

在誘導分化的第12 天將成骨誘導培養(yǎng)基的FCS含量更換為0.5%，培養(yǎng)48 h后，換為無血清成骨誘導培養(yǎng)基，24 h 后收集上清液。按照ELISA 試驗盒（USCN）操作指南測定培養(yǎng)上清液中OPG 及RANKL的含量。

表1 Real-time PCR所用引物序列

六、統(tǒng)計學處理

應用SPSS 20.1統(tǒng)計軟件（IBM公司，美國）進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、BMSCs的鑒定

將培養(yǎng)的第3 代細胞進行誘導分化，成骨誘導7 d進行ALP染色，成脂誘導7 d進行油紅O染色，成軟骨誘導14 d進行阿利新藍染色。三系分化均為陽性（圖1），所分離細胞具有向成骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞的多項分化潛能；流式細胞學檢測，顯示其表面標志物Scal-1（+）、CD29（+）、CD11b（-）、CD45（-）（圖2）。

二、低頻振動促進BMSCs成骨分化

通過低頻振動刺激7 d，兩組細胞均進行ALP染色。低頻振動組ALP 活性明顯高于對照組。刺激14 d 后，低頻振動組鈣節(jié)結形成量明顯多于對照組（圖3），說明低頻振動對BMSCs 向成骨分化起促進作用。

三、低頻振動能改變成骨細胞相關基因表達

圖1 三系分化染色均為陽性（×4） a：ALP染色；b：油紅O染色；c：阿利新藍染色

圖2 流式細胞術檢測示表面標志物 a：對照組；b～e：Scal-1（+）、CD29（+）、CD11b（-）、CD45（-）

低頻振動干預14 d后收獲細胞提取RNA，逆轉Real-time PCR 檢測了Col Ⅰ、OPN、OPG、RANKL、OCN等相關基因的表達。與對照組相比，低頻振動組Col Ⅰ、OPN、OCN、OPG基因表達增加，RANKL基因表達下降（圖4）。且細胞培養(yǎng)上清中，低頻振動組OPG 含量為（55.9±2.8）μg/L，較對照組的（30.5±1.8）μg/L 增高，RANKL 含量（3.5±0.1）μg/L，較對照組的（5.2±0.2）μg/L 下降，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，如圖5）。RANKL 能誘導破骨細胞生成，而OPG 通過競爭性抑制RANKL 的作用來抑制破骨細胞分化。這表明低頻振動能提高BMSCs 的成骨能力，且能通過分泌OPG、RANKL 等蛋白來參與對破骨細胞分化的調控。

圖3 細胞染色（大體觀） a：對照組ALP染色；b：低頻振蕩組ALP染色；c：對照組茜素紅染色；d：低頻振蕩組茜素紅染色

圖4 Col Ⅰ、OPN、OCN、OPG及RANKL基因表達（以18S作為內參進行標準化處理） 與對照組相比，*P＜0.05

圖5 兩組培養(yǎng)基上清液中OPG 及RANKL 含量 與對照組相比，*P＜0.05

討 論

BMSCs 是存在于骨髓腔內的主要細胞之一，在不同的條件下可分化為成骨細胞、脂肪細胞與軟骨細胞等，具有一定的干細胞特性。本研究中通過全骨髓貼壁培養(yǎng)法獲取了小鼠的BMSCs，在體外成功地誘導為成骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞；同時，采用流式細胞術檢測了其表面抗原標志物，結果顯示Scal-1（+）、CD29（+）、CD11b（-）、CD45（-），與相關研究表達一致［11，12］。BMSCs 向成骨分化的過程中，有多種因素可影響其分化結果，比如細胞因子、磁場與力學刺激等［13-15］。

生物機械應力及力學信號轉導在細胞分化方向調控過程中發(fā)揮重要作用。BMSCs 表面存在力學轉導的相關蛋白，能將力學信號轉導至細胞內發(fā)揮相關作用。細胞膜上的整合素、G 蛋白和離子通道等感受到外界應力后，通過細胞骨架及相關信號通路將信號轉導至細胞內，作用于細胞核［16］，其中重要的一條細胞信號通路為MAPKs 通路［17］。過度應力可激活p38 及ERK 破壞軟骨基質，介導軟骨細胞的凋亡。活化的激酶隨后轉入細胞核，通過活化轉錄因子調控相關基因的表達，從而將力學信號刺激從細胞外傳至細胞核，并介導產生基質金屬蛋白酶（matrix metallo proteinases, MMPs）在內的多種炎癥因子［18，19］。同時，外界應力刺激轉導至細胞內后可磷酸化I-κB，導致I-κB被降解、I-κB與NF-κB解聚、NF-κB被激活并發(fā)生核轉位，以p65/p50異二聚體的形式結合至DNA 上的相應位點，調控下游含有NFκB結合序列的靶基因的轉錄表達，從而影響細胞的功能［20］。

低頻振動作為力學刺激的一種，在醫(yī)療上應用廣泛。低頻振動在康復方面對肌萎縮有較好的療效，其機制為刺激肌肉過量表達IGF-I、MyoD，Myostatin 的表達減少，通過推動骨骼肌蛋白合成、抑制骨骼肌蛋白分解，從而推動骨骼肌萎縮的恢復［21］。低頻振動作用于BMSCs后，在誘導其向成骨分化過程中，ALP活性增高，且鈣結節(jié)數目增加，OCN、OPG表達增加，RANKL表達下降。ALP是評價成骨細胞分化過程中早期標志之一，鈣結節(jié)是評價成骨細胞功能的晚期指標，形成鈣結節(jié)的多少與成骨細胞功能呈正相關。RANKL 是單核細胞向破骨細胞分化過程中的一種重要蛋白，OPG是RANKL的一種競爭性抑制劑［22］。本研究結果表明，低頻振動對骨代謝起正性調節(jié)作用，一方面可促進骨生成，另一方面可通過成骨細胞分泌的相關蛋白來抑制破骨細胞的生成。

本研究亦存在相關不足，低頻振動是如何促進成骨生成的，并沒有深入研究，其機制如何，是否有NF-κB、MAPKs 通路的參與暫不得而知。我們計劃下一步繼續(xù)進行相關研究。對于低頻振動的頻率，我們僅采用了一種頻率，因為我們預試驗顯示此頻率有較好的誘導成骨效果。

綜上所述，低頻振動有較好的誘導骨髓間充質細胞成骨作用，且能通過成骨細胞分泌相關蛋白抑制破骨細胞的生成。同時，低頻振動具有無創(chuàng)傷、副作用小的優(yōu)點，在應用上前景廣泛，臨床使用價值高。