董兵，劉曉隗，王蘇，陳秀軍

解放軍第三〇五醫(yī)院心胸外科，北京100017

近年來(lái)，肺癌的發(fā)病率逐步升高，嚴(yán)重威脅人類的身體健康，是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。相關(guān)研究顯示，吸煙、職業(yè)、環(huán)境、電流輻射、遺傳等因素均可引起非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[2]，早期臨床癥狀包括胸部脹痛、痰血等，晚期可出現(xiàn)疲乏、體重減輕、食欲下降和呼吸困難等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中異常表達(dá)的WNT1誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白2（WNT1 inducible signaling pathway protein 2，WISP2）可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]，但WISP2蛋白的具體作用機(jī)制尚未明確且其與生物學(xué)特征關(guān)系的報(bào)道較少。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，WISP2基因具有多功能調(diào)節(jié)的作用，是腫瘤細(xì)胞增殖的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，WISP2的缺失可能是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)失控的原因[5-7]，因此，WISP2成為近年來(lái)臨床的主要研究熱點(diǎn)[6]。本研究主要探討WISP2在NSCLC中的表達(dá)情況及對(duì)肺癌A549細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2019年3月解放軍第三〇五醫(yī)院收治的NSCLC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理學(xué)確診為NSCLC；②生存時(shí)間＞3個(gè)月；③臨床分期為Ⅰ～Ⅲ期；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未接受放化療及其他抗腫瘤治療；合并其他系統(tǒng)繼發(fā)性惡性腫瘤。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入60例NSCLC患者，其中男37例，女23例；年齡44～75歲，平均年齡為（55.38±6.77）歲，＜60歲21例，≥60歲39例；病理類型：鱗狀細(xì)胞癌35例，腺癌21例，其他4例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ期36例；分化程度：低分化31例，中分化26例，高分化3例；吸煙35例，不吸煙25例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例。同時(shí)取60例NSCLC患者的NSCLC組織和相應(yīng)的癌旁正常組織。

1.2 免疫組化法檢測(cè)WISP 2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況

取NSCLC組織和相應(yīng)的癌旁正常組織制成4 μm的切片，脫蠟、水化、修復(fù)等。采用鏈霉抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法檢測(cè)WISP2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況，具體步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。抗原修復(fù)后，滴加山羊非免疫血清工作液封閉，加入一抗，3℃孵育過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗后，加入二抗，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染。SP免疫組化法檢測(cè)NSCLC組織和癌旁正常組織中WISP2的表達(dá)情況。在光鏡下觀察WISP2蛋白的染色情況，選取PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性表達(dá)的石蠟切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞、主要試劑及儀器順鉑耐藥的肺癌A549細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)BD公司。膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，巴比妥鈉孵育緩沖液購(gòu)自美國(guó)ABI公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Corning公司，恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組取肺癌A549細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌A549細(xì)胞接種于6孔板，每孔1×105/ml。待細(xì)胞貼壁，按照試劑盒說(shuō)明書將WISP2蛋白過(guò)表達(dá)的載體轉(zhuǎn)染至肺癌A549細(xì)胞，作為觀察組，未轉(zhuǎn)染的肺癌A549細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況取NSCLC組和對(duì)照組肺癌A549細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，乙醇洗滌，1000 r/min離心15 min后，300 μl胎牛血清重懸細(xì)胞，加入預(yù)冷的70%乙醇5 ml，4℃固定過(guò)夜，收集細(xì)胞，加入PI染色液500 μl，4℃避光孵育30 min后，過(guò)300目篩網(wǎng)，采用200 μl的胎牛血清再次重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況采用Annexin V-FITC/PI雙染法，將NSCLC組和對(duì)照組肺癌A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，胰蛋白酶消化后，1000 r/min，離心5 min，除去上清液。加入1 ml預(yù)冷的胎牛血清重懸細(xì)胞，加入1 ml預(yù)冷的巴比妥鈉孵育緩沖液和5 μl的Annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育10 min，再加入10 μl的PI染色液，4℃避光孵育30 min后，過(guò)300目篩網(wǎng)，采用200 μl孵育緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WISP 2蛋白表達(dá)情況的比較

NSCLC組織中WISP2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為51.67%（31/60），低于癌旁正常組織的70.00%（42/60），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.232，P＜0.05）。

2.2 不同臨床特征NSCLC患者NSCLC組織中WISP 2蛋白表達(dá)情況

不同年齡、性別NSCLC患者NSCLC組織中WISP2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同吸煙情況、病理類型、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況NSCLC患者NSCLC組織中WISP2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

2.3 細(xì)胞周期分布情況的比較

觀察組肺癌A549細(xì)胞G1期細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組細(xì)胞，S期和G2期細(xì)胞比例均明顯低于對(duì)照組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.01）。（表2）

2.4 細(xì)胞凋亡情況的比較

觀察組肺癌A549細(xì)胞的凋亡率為（5.55±0.69）%，明顯高于對(duì)照組細(xì)胞的（3.05±0.43）%，差異有統(tǒng)計(jì)意義（t=19.026，P＜0.01）。

表1 不同臨床特征NSCLC患者NSCLC組織中WISP 2蛋白表達(dá)情況（n=60）

表2 兩組肺癌 A549細(xì)胞周期分布情況的比較（±s）

表2 兩組肺癌 A549細(xì)胞周期分布情況的比較（±s）

組別G1期S期G2期觀察組對(duì)照組t值P值60.12±7.15 40.99±5.28 13.158 0.000 25.72±3.88 37.32±4.55 11.447 0.000 14.15±1.94 21.69±3.81 10.083 0.000

3 討論

相關(guān)研究顯示，惡性腫瘤的發(fā)展過(guò)程由多種因素、多個(gè)步驟共同作用，正常細(xì)胞在與外界接觸或自身因素的刺激下，逐漸惡性增殖、分化，最終進(jìn)展為惡性腫瘤細(xì)胞[8-10]。腫瘤細(xì)胞與腫瘤基質(zhì)成分可共同參與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程，在此過(guò)程中，細(xì)胞表面黏附分子的改變也發(fā)揮了重要作用，與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為密切相關(guān)[10-11]。表明腫瘤細(xì)胞的形成過(guò)程較為復(fù)雜，其特異性生物學(xué)行為隨腫瘤類型的不同而產(chǎn)生變化[12]。相關(guān)研究顯示，NSCLC早期癥狀不明顯，多數(shù)患者就診時(shí)已處于晚期，失去了最佳的手術(shù)時(shí)機(jī)，導(dǎo)致肺癌患者的生存率較低、病死率較高[13-14]。因此，早期診斷NSCLC，研究其發(fā)病機(jī)制，并對(duì)其腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為進(jìn)行探討，對(duì)提高NSCLC患者的生存率具有重要臨床意義。相關(guān)研究顯示，WISP2蛋白可抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖[15]，具有一定臨床價(jià)值，本研究主要探討WISP2在NSCLC中的表達(dá)情況及對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

研究顯示，WISP2是一種抑癌基因，可編碼多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡過(guò)程，對(duì)骨骼、神經(jīng)及血管的發(fā)育具有抑制作用[16-18]。WISP2含有28個(gè)半胱氨基酸，可參與多種重要的生物學(xué)過(guò)程。研究顯示，WISP2在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，WISP2可作為臨床治療NSCLC的重要靶蛋白[19]。臨床探討WISP2在NSCLC中的表達(dá)情況及相應(yīng)的生物學(xué)行為對(duì)NSCLC的早期診斷、治療和預(yù)防提供了理論依據(jù)[20-21]。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC組織中WISP2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為51.67%，低于癌旁正常組織的70.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。推測(cè)WISP2蛋白的表達(dá)情況與NSCLC的發(fā)生發(fā)展可能有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，不同吸煙情況、病理類型、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況NSCLC患者NSCLC組織中WISP2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；觀察組肺癌A549細(xì)胞G1期細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組細(xì)胞，S期和G2期細(xì)胞比例均明顯低于對(duì)照組細(xì)胞，觀察組細(xì)胞的凋亡率也明顯高于對(duì)照組細(xì)胞。表明WISP2可對(duì)腫瘤細(xì)胞的周期分布和凋亡進(jìn)行調(diào)控，有助于NSCLC的早期診斷并對(duì)其惡性程度進(jìn)行評(píng)估，為NSCLC的治療提供參考。

綜上所述，WISP2在NSCLC組織中表達(dá)水平較低，其在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。