周寧，譚曉殊，許婷婷，王帆榮，胡書婭

四川綿陽四〇四醫(yī)院病理科，四川綿陽621000

三陰性乳腺癌占全部乳腺癌類型的20%[1]，是乳腺癌的亞型之一，其雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表達(dá)均為陰性，好發(fā)于50歲以下年輕女性，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）可分解基底膜中的纖維連接蛋白和層粘連蛋白，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移[3]，Kazal基序富含半胱氨酸的逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)蛋白（reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs，RECK）是一種基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）抑制劑，在抑制腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲等過程中有重要作用[4-5]。目前，RECK、MMP9在三陰性乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚，因此，本研究探討RECK、MMP9在三陰性乳腺癌中的表達(dá)情況及其與患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2017年1月四川綿陽四〇四醫(yī)院收治的三陰性乳腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理活檢確診為三陰性乳腺癌；既往未接受過手術(shù)和放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他臟器功能障礙；合并炎性乳腺癌或其他部位惡性腫瘤。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入43例三陰性乳腺癌患者，年齡32～65歲，平均年齡為（35.14±5.87）歲，≥45歲29例，＜45歲14例；腫瘤直徑：≤2 cm 23例，＞2 cm 20例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例；組織學(xué)分級(jí)：G1級(jí)11例，G2級(jí)25例，G3級(jí)7例；TNM分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期20例，Ⅲ期6例。同期選取了43例健康體檢者，年齡30～69歲，平均年齡為（35.74±6.03）歲。兩組受試者年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫組化染色方法

取三陰性乳腺癌患者的三陰性乳腺癌組織標(biāo)本和對(duì)照組受試者正常乳腺組織標(biāo)本，常規(guī)切片5 μm、脫蠟。組織切片放入pH=8.0的乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）修復(fù)液中，高壓鍋內(nèi)高壓2.5 min，3%過氧化氫室溫孵育20 min，正常兔血清封閉非特異性抗原15 min。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗后，加入鼠抗人MMP9單克隆抗體和RECK多克隆抗體，37℃孵育60 min，4℃放置過夜。PBS沖洗3次，加入二抗，37℃孵育40 min，PBS沖洗3次，滴加鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）溶液，37℃放置 30 min，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察RECK、MMP9蛋白的染色情況，選取PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

RECK、MMP9蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒判定為細(xì)胞陽性。依據(jù)著色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無著色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；依據(jù)陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分：陽性細(xì)胞所占比例＜10%計(jì)0分，陽性細(xì)胞所占比例為10%～25%計(jì)1分，陽性細(xì)胞所占比例為26%～50%計(jì)2分，陽性細(xì)胞所占比例為51%～75%計(jì)3分，陽性細(xì)胞所占比例＞75%計(jì)4分。將著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分相加，總分＜3分為陰性表達(dá)，≥3分為陽性表達(dá)。

1.4 隨訪方法

采用電話隨訪和門診復(fù)診的方式，對(duì)所有三陰性乳腺癌患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止時(shí)間為2019年5月，無失訪病例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料的比較采用秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RECK、MMP9蛋白表達(dá)情況的比較

三陰性乳腺癌組織中RECK蛋白的陽性表達(dá)率為32.56%（14/43），明顯低于正常乳腺組織的93.02%（40/43），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=33.644，P＜0.01）。三陰性乳腺癌組織中MMP9蛋白的陽性表達(dá)率為88.37%（38/43），明顯高于正常乳腺組織的6.98%（3/43），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=57.100，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征三陰性乳腺癌患者三陰性乳腺癌組織中RECK、MMP9蛋白的陽性表達(dá)情況

不同TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況三陰性乳腺癌患者三陰性乳腺癌組織中RECK蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=6.479、10.689，P＜0.05；χ2=4.669，P＜0.05）；不同年齡、腫瘤直徑三陰性乳腺癌患者三陰性乳腺癌組織中RECK蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況三陰性乳腺癌患者三陰性乳腺癌組織中MMP9蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.749，P＜0.05）；不同年齡、腫瘤直徑、TNM分期和組織學(xué)分級(jí)三陰性乳腺癌患者三陰性乳腺癌組織中MMP9蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征三陰性乳腺癌患者三陰性乳腺癌組織中RECK、MMP9蛋白的陽性表達(dá)情況（n=43）

2.3 RECK、MMP9蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，RECK蛋白與MMP9蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.527，P＜0.05）。

2.4 RECK、MMP9蛋白表達(dá)情況與三陰性乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

43例三陰性乳腺癌患者隨訪6～30個(gè)月，中位隨訪時(shí)間29個(gè)月，復(fù)發(fā)21例，死亡3例。隨訪30個(gè)月時(shí)，RECK蛋白陽性表達(dá)三陰性乳腺癌患者的無進(jìn)展生存率為71.4%，高于RECK蛋白陰性表達(dá)患者的31.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.820，P＜0.05）；MMP9陽性表達(dá)三陰性乳腺癌患者的無進(jìn)展生存率為36.8%，低于MMP9陰性表達(dá)患者的100%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.935，P＜0.05）。（圖1、圖2）

圖1 RECK陽性表達(dá)（n=14）和RECK陰性表達(dá)（n=29）三陰性乳腺癌患者的無進(jìn)展生存曲線

圖2 MMP9陽性表達(dá)（n=38）和MMP9陰性表達(dá)（n= 5）三陰性乳腺癌患者的無進(jìn)展生存曲線

3 討論

乳腺癌是一種異質(zhì)性腫瘤，包括Luminal A型、Luminal B型、HER2過表達(dá)型和basal-like型。不同類型的乳腺癌具有不同的臨床特征和分子生物學(xué)特征，對(duì)治療的反應(yīng)和預(yù)后也不盡相同。三陰性乳腺癌患者因ER、PR、HER2均為陰性表達(dá)而不適用于內(nèi)分泌治療和靶向治療[6-7]，組織學(xué)分級(jí)和侵襲性更高，復(fù)發(fā)率和病死率較其他類型的乳腺癌更高[8-9]。

RECK是一種轉(zhuǎn)化抑制基因，可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制MMP9的表達(dá)，也可通過抑制MMP9的分泌來抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和新生血管生成[10-12]。RECK基因也可抑制上游啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子特異性位點(diǎn)的結(jié)合，抑制細(xì)胞的不典型增生和癌變[13-14]。RECK在正常組織中表達(dá)水平較高，但在食管癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌等多種上皮源性腫瘤組織中表達(dá)明顯降低或缺失，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫系統(tǒng)疾病組織中表達(dá)水平也較低。本研究結(jié)果顯示，三陰性乳腺癌組織中RECK蛋白的陽性表達(dá)率為32.56%，明顯低于正常乳腺組織的93.02%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與張靖[15]、Bravaccini和Maltoni[16]的研究結(jié)果一致，表明RECK表達(dá)缺失可能參與了三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。研究顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中RECK的陽性表達(dá)率較低，且隨著臨床分期的增高而逐漸降低[17-18]，表明RECK在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演關(guān)鍵的角色。本研究結(jié)果顯示，不同TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況三陰性乳腺癌患者三陰性乳腺癌組織中RECK蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明RECK表達(dá)水平較低或缺失可能與三陰性乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)。為了解RECK與三陰性乳腺癌患者預(yù)后關(guān)系，本研究通過長期隨訪發(fā)現(xiàn)，RECK蛋白陽性表達(dá)三陰性乳腺癌患者的無進(jìn)展生存率為71.4%，高于RECK蛋白陰性表達(dá)患者的31.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明可通過檢測RECK的表達(dá)情況預(yù)測三陰性乳腺癌患者的預(yù)后，為臨床治療提供參考。

MMP是高度保守內(nèi)肽酶，能降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)所有蛋白，MMP9屬于MMP家族成員，具有MMP結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可通過降解明膠和Ⅳ型膠原破壞基底膜完整性，有助于腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[19-20]。腫瘤組織中MMP9的表達(dá)水平較高，方明等[3]分別觀察三陰性乳腺癌組織、乳腺增生組織和正常乳腺組織中MMP9表達(dá)的差異，結(jié)果顯示，三陰性乳腺癌組織中MMP9的陽性表達(dá)率最高，且MMP9陽性表達(dá)與三陰性乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，與本研究結(jié)果一致。吳鳳蘭[10]的研究結(jié)果顯示，RECK蛋白表達(dá)下調(diào)，可減弱對(duì)MMP9的抑制作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，RECK與MMP9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明RECK和MMP9可能在三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中存在關(guān)聯(lián)機(jī)制，臨床可通過上調(diào)RECK的表達(dá)，抑制MMP9的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移等過程，達(dá)到抗腫瘤治療的目的。預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，MMP9同樣與三陰性乳腺癌患者預(yù)后密切相關(guān)，MMP9陽性表達(dá)三陰性乳腺癌患者無進(jìn)展生存率為36.8%，低于MMP9陰性表達(dá)患者的100%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這與RECK和MMP9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的結(jié)論一致。臨床應(yīng)重視MMP9表達(dá)水平較高的惡性腫瘤患者，積極采取措施抑制腫瘤進(jìn)展，加強(qiáng)隨訪和干預(yù)，以積極改善患者預(yù)后。但本研究樣本例數(shù)較少，可能導(dǎo)致結(jié)果偏倚，應(yīng)在以后研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，增加觀察指標(biāo)，為三陰性乳腺癌診療提供更可靠參考。

綜上所述，三陰性乳腺癌組織中RECK的表達(dá)水平較低，MMP9的表達(dá)水平較高，RECK蛋白的表達(dá)可能與三陰性乳腺癌患者的TNM分期、組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，MMP9蛋白的表達(dá)可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。RECK蛋白陰性表達(dá)和MMP9蛋白陽性表達(dá)的三陰性乳腺癌患者預(yù)后較差。