張健,馬海#,楊柳,楊紅春,何振興
南充市中心醫(yī)院1普外科,2呼吸內科,四川 南充637000
肝癌為臨床常見的一種惡性腫瘤,在過去20年中,全世界肝癌的發(fā)病率和病死率均增長了約1倍[1]。在中國,肝癌的發(fā)病率和病死率分別居惡性腫瘤第3位和第2位,嚴重威脅著人們的生命健康[2]。腫瘤相關鈣信號轉導蛋白2(tumor-associated calcium signal transducer 2,Trop-2)是GA733基因家族中的一個細胞表面受體,負責轉導Ca2+信號[3]。相關研究表明,Trop-2在肺腺癌、胃癌和卵巢漿液性囊腺癌等多種惡性腫瘤中高表達,且其高表達能夠促進腫瘤的生長,與患者的預后不良有關[4-6]。Trop-2高表達可能參與腫瘤的惡性生物學行為,但其在肝癌中的作用及作用機制尚不明確。蛋白激酶 C-α(protein kinase C alpha,PKC-α)作為上游調節(jié)因子,通過磷酸化核因子κB抑制因子(inhibitor of nuclear factor kappa B,IκB)激活核因子-κB(nuclear factor of kappa B,NF-κB),從而促進卵巢癌的發(fā)展[7]。本研究探究了Trop-2基因在肝癌組織和肝癌細胞中的表達情況,并進一步探究了其對肝癌細胞增殖的影響,旨在為肝癌的預后和靶點治療提供理論依據。
選取2016—2017年于南充市中心醫(yī)院行手術切除的10例肝癌患者的肝癌組織標本和癌旁正常組織標本,所有患者在手術之前均未接受任何治療。人肝癌細胞株HepG2、人高轉移肝癌細胞株HCCLM3和人正常肝細胞株HL-7702均購自武漢普諾賽公司。
DMEM培養(yǎng)基和雙抗(青霉素和鏈霉素)均購自美國Hyclone公司,南美胎牛血清購自美國Hyclone公司,PE Mouse Anti-Human Trop-2(564837)、Cycletest Plus DNA Reagent kit均購自美國BD生物公司,兔抗人Trop-2、兔抗人PKC-α、兔抗人p-PKC-α和兔抗人NF-κB抗體均購自美國Abcam公司,辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)二抗購自美國CST公司,總RNA提取試劑盒、CCK-8試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司,Prime-ScriptTMRT reagent kit、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司,Trop-2和β-acting引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。TDZ4-WS型臺式低速離心機購自長沙湘儀離心機儀器有限公司,MCO-15AC型二氧化碳培養(yǎng)箱購自三洋電機國際貿易有限公司,酶標儀(Multlskan)購自賽默飛世爾儀器有限公司,Cytoflex型流式分析儀購自美國Beckman公司。
在GeneBank中查找Trop-2的基因序列,設計Trop-2siRNA和無關序列的寡核苷酸。Trop-2siRNA上游引物:5'-CACCTTCAAGACGTTTTTTG-3',下游引物:5'-AGCTCAAAAAACGTCTTGAA-3';陰性對照siRNA上游引物:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3',下游引物:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。以上引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
將人肝癌細胞HepG2、人高轉移肝癌細胞HCCLM3和人正常肝細胞HL-7702分別接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達80%時,進行傳代培養(yǎng)或進行實驗。收集處于對數生長期的HepG2細胞,分為3組:空白對照組,僅添加Lipofectamine 2000不做轉染的HepG2細胞;陰性對照組,轉染無關序列的HepG2細胞;Trop-2siRNA組,轉染Trop-2siRNA序列的HepG2細胞。采用Lipofectamine 2000進行轉染,6 h后更換培養(yǎng)液,24 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。細胞轉染步驟嚴格參照試劑盒操作說明書進行。
取肝癌組織和癌旁正常組織,常規(guī)石蠟包埋切片后,65℃烤片30 min,二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水。3%過氧化氫室溫浸泡15 min后,采用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)沖洗3次,每次5 min,滴加5%牛血清蛋白封閉液,置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min,吸去多余液體,滴加1∶100稀釋的Trop-2一抗,4℃冰箱過夜。37℃培養(yǎng)箱復溫30 min,PBS清洗3次,每次5 min。滴加IgG,37℃培養(yǎng)箱孵育30 min后,PBS沖洗3次,每次5 min。滴加鏈霉抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復 合 物(streptavidin-biotin-peroxidase complex,SABC)試劑,37℃培養(yǎng)箱孵育30 min后PBS清洗3次,每次5 min。3,3’-二氨基聯苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)顯色5 min(顯微鏡下控制),使細胞質均勻著黃棕色,自來水終止顯色,蘇木素復染細胞核2~3 min,水洗,1%鹽酸乙醇分化(快速),梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性光學樹脂封片。采用PBS替代一抗作為陰性對照組。使用IPP 6.0軟件對免疫組化圖片進行積分光密度值(integral optical density,IOD)檢測。
采用總RNA提取試劑提取肝癌組織及癌旁正常組織中的總RNA,使用逆轉錄試劑盒Prime-Script?RT reagent kit進行逆轉錄,制備 cDNA,各cDNA樣品分別用下列引物進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)。Trop-2上游引物:5'-CCTCATCGCCGTCATCGT-3';下游引物:5'-CGGTTCCTTTCTCAACTCCC-3'。β-actin上游引物:5'-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3';下游引物:5'-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3'。反應體系12.5 μl:SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 6.25 μl、上游引物0.5 μl、下游引物 0.5 μl、雙蒸水 4.25 μl、cDNA 1 μl;反應條件:95℃預變性3 min;95℃變性10 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共25個循環(huán)。以βactin為內參,以2-ΔΔCt法計算肝癌組織及癌旁正常組織中Trop-2mRNA的相對表達量。實驗重復3次。
取對數生長期的未經轉染的HepG2、HCCLM3和HL-7702細胞,接種于DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至融合度達80%時收集細胞,參照FIX/PERM試劑盒操作說明書,在培養(yǎng)液中加入100 ml Reagent A室溫孵育10 min,400g離心5 min,吸棄上清液;采用適量PBS洗滌2次,每次3 min,350g離心5 min,吸棄上清液,加入100 μl Reagent B混勻后,加入PE Mouse Anti-Human Trop-2,避光混勻,4℃避光反應30 min,PBS洗滌2次,每次3 min,350g離心5 min,吸棄上清液,加入1%多聚甲醛重懸細胞后,采用流式細胞儀檢測HepG2細胞、HCCLM3細胞及HL-7702細胞中Trop-2蛋白的表達水平。實驗重復3次。
1.8.1 不同組織中相關蛋白檢測 肝癌組織和癌旁正常組織中相關蛋白檢測:取適當大小的組織塊,加入300 L細胞裂解液,置于冰上裂解30 min,其間在渦旋器上進行充分混合;然后以12 000 r/min于4℃離心20 min,收集上清液。采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法進行蛋白質定性,每4 μl蛋白質樣品中加入1 μl十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液(5×),混合蛋白質樣品和緩沖液,煮沸5 min,樣品于-20℃保存?zhèn)溆谩J褂玫攘康鞍踪|上樣,選擇10%SDS-PAGE進行分離,分離后的蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,用5%的脫脂奶粉封閉1 h,封閉結束后結合一抗(Trop-2、PKC-α、p-PKC-α、NF-κB和β-actin均按1∶400稀釋),4℃孵育過夜后TBST清洗,然后加入二抗(稀釋比例均為1∶5000)室溫孵育1 h,TBST清洗,ECL暗室顯色。顯色后的蛋白使用Bio-Rad全功能成像系統采集圖像,Image-ProPlus分析光密度,以β-actin為內參,檢測肝癌組織和癌旁組織中NF-κB、PKC-α、p-PKC-α、Trop-2的相對表達量。實驗重復3次。
1.8.2 不同細胞中相關蛋白檢測 收集處于對數生長期的未經轉染的HepG2、HCCLM3、HL-7702細胞和轉染后的空白對照組、陰性對照組、Trop-2siRNA組HepG2細胞,預冷PBS沖洗2次,每次3 min,每孔加入約100 μl全細胞蛋白質裂解液,振蕩混勻,置冰上10 min后將細胞收集于1.5 ml離心管中。裂解體系在冰上進行超聲作用,每次3 s,共3次,每次間隔1 s,超聲后的裂解體系于4℃、13 000 r/min離心5 min并收集上清。用BCA法進行蛋白質定量。其余操作方法同“1.8.1”。計算未經轉染的HepG2、HCCLM3和HL-7702細胞中Trop-2的相對表達量及空白對照組、陰性對照組、Trop-2siRNA組HepG2細胞中Trop-2、NF-κB、PKC-α和p-PKC-α蛋白的相對表達量。實驗重復3次。
取處于對數生長期的陰性對照組、Trop-2siRNA組HepG2細胞,調整細胞濃度為4×104/ml,接種于96孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μl CCK-8,4 h后終止培養(yǎng),采用酶標儀于450 nm波長下測定細胞吸光度值。實驗重復3次。
采用SPSS 20.0軟件對數據進行分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差(±s)表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,3組間比較用單因素方差分析(ANOVA-LSD);計數資料以例數表示。以P<0.05為差異有統計學意義。
免疫組織化學染色結果顯示:肝癌組織細胞質中淺黃色顆粒較多,癌旁正常組織細胞質中淺黃色顆粒極少(圖1)。IPP6.0軟件對免疫組織化學染色圖片進行IOD檢測,結果顯示:肝癌組織中Trop-2蛋白的相對表達量為(0.27±0.01),明顯高于癌旁正常組織的(0.23±0.01),差異有統計學意義(t=12.637,P<0.01)。
圖1 肝癌組織和癌旁正常組織中Trop-2蛋白的表達情況(免疫組織化學染色法,×400)
qRT-PCR檢測結果顯示:肝癌組織中Trop-2mRNA的相對表達量為(5.60±1.19),明顯高于癌旁正常組織的(0.98±0.18),差異有統計學意義(t=12.066,P<0.01)。
流式細胞術檢測結果顯示:HCCLM3細胞和HepG2細胞中Trop-2蛋白的相對表達量分別為(91.21±2.50)%、(94.14±2.36)%,均明顯高于HL-7702細胞的(7.97±1.50)%,差異均有統計學意義(t=49.550、53.440,P<0.01)(圖2)。Western blot檢測結果顯示,HCCLM3細胞和HepG2細胞中Trop-2蛋白的相對表達量分別為(0.91±0.08)、(0.81±0.04),均高于HL-7702細胞的(0.67±0.06),差異均有統計學意義(t=4.157、3.363,P<0.05)(圖3)。
圖2 流式細胞術檢測Trop-2蛋白在未經轉染的 3種細胞中的表達情況
圖3 Western blot檢測Trop-2蛋白在未經轉染的 3種細胞中的表達情況
肝癌組織中p-PKC-α、NF-κB和Trop-2蛋白的相對表達量均明顯高于癌旁正常組織,差異均有統計學意義(P<0.01)。肝癌組織中PKC-α蛋白的相對表達量與癌旁正常組織比較,差異無統計學意義(P>0.05)。(表1)
表1 不同組織中相關蛋白表達水平的比較(±s)
表1 不同組織中相關蛋白表達水平的比較(±s)
組織類型肝癌組織癌旁正常組織t值P值0.97±0.03 0.47±0.07 2.947<0.01 1.02±0.05 0.78±0.07 0.154<0.01 0.93±0.07 0.91±0.07 0.845>0.05 1.03±0.05 0.77±0.05 0.030<0.01 Trop-2 p-PCK-α PCK-α NF-κB
Western blot檢測結果顯示:Trop-2siRNA組HepG2細胞中Trop-2、p-PKC-α、PKC-α和NF-κB蛋白的相對表達量均低于空白對照組和陰性對照組,差異均有統計學意義(P<0.05);陰性對照組HepG2細胞中Trop-2、p-PKC-α、PKC-α和NF-κB蛋白的相對表達量與空白對照組比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。(表2)
表2 不同組別HepG 2細胞中相關蛋白表達水平的比較(±s)
表2 不同組別HepG 2細胞中相關蛋白表達水平的比較(±s)
注:a與空白對照組比較,P<0.05;b與陰性對照組比較,P<0.05
組別空白對照組陰性對照組Trop-2 siRNA組1.03±0.08 1.02±0.11 0.81±0.10a b 0.98±0.03 1.02±0.11 0.71±0.12a b0.97±0.03 0.93±0.09 0.78±0.06a b 1.00±0.00 0.98±0.10 0.73±0.11a b Trop-2 p-PCK-α PCK-α NF-κB
CCK-8法檢測結果顯示:Trop-2siRNA組HepG2細胞的增殖率為(76.953±9.043)%,低于陰性對照組的(96.940±15.752)%,差異有統計學意義(t=6.564,P<0.05)。
Trop-2由Lipinski在1981年首次從滋養(yǎng)層細胞膜上發(fā)現,并證實其在正常組織中幾乎不表達。喬宇[8]在對影響直腸癌轉移及預后的因子進行分析時發(fā)現,Trop-2在直腸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織,且與患者的腫瘤分期、淋巴結轉移和遠處轉移情況有關。Heist等[9]對肺癌患者行Trop-2抗體聯合腫瘤藥物治療,結果顯示該聯合方案治療可以延緩患者的病情進展。目前,關于Trop-2在肝癌發(fā)生發(fā)展中作用機制的研究尚少。因此,本研究對Trop-2在肝癌組織和細胞中的表達情況進行研究,結果顯示,肝癌組織中Trop-2蛋白和mRNA的相對表達量均高于癌旁正常組織(P<0.05);流式細胞術和Western blot法對人肝癌細胞株HepG2、人高轉移肝癌細胞株HCCLM3和人正常肝細胞株HL-7702中Trop-2蛋白的表達水平進行檢測,結果顯示HepG2細胞和HCCLM3細胞中Trop-2蛋白的相對表達量均高于HL-7702細胞(P<0.05)。提示Trop-2可能促進肝癌細胞的惡性增殖或遷移,可作為肝癌預后的標志基因。為了驗證這一推測,本研究采用RNA干擾技術沉默細胞中Trop-2基因表達,結果發(fā)現Trop-2沉默后,HepG2細胞增殖率被顯著性降低。進一步說明了Trop-2可能參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展,可以作為肝癌預后的標志基因。本研究上述結果也與乳腺癌、肺癌和頭頸部鱗狀細胞癌等惡性腫瘤報道的結果相一致[10-11]。
Trop-2作為一種跨膜鈣信號傳感器,能夠與PKC-α催化區(qū)結合,并磷酸化細胞質中的PKC-α,使其轉移至細胞膜并激活下游其他蛋白[12]。本研究采用Western blot法檢測不同組織中PKC-α和p-PKC-α的表達情況,結果發(fā)現肝癌組織中p-PKC-α蛋白的相對表達量明顯高于癌旁組織(P<0.01),但兩種組織中PKC-α蛋白的相對表達量比較,差異無統計學意義(P>0.05)。提示PKC-α可能是Trop-2的下游基因,過表達的Trop-2與PKC-α相結合,可以促進其激活。也有學者推測,Trop-2與PKC-α之間是一種正反饋調節(jié),Trop-2被激活后,促使更多的PKC-α被磷酸化,而p-PKC-α又促進Trop-2的激活,這種正反饋調節(jié)在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[13]。正常生理條件下,NF-κB與抑制因子IκBα在細胞質中形成復合物,其功能活性被抑制;當受到上游配體或細胞外刺激激活后,IκB蛋白激酶復合物(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,IKK)進入細胞核,調節(jié)相關因子表達。龐雪蓮[14]對PKC-α與NF-κB在食管癌中的關系進行研究,結果顯示PKC-α被磷酸化后,可以激活NF-κB上游激酶IKK,最終激活NF-κB,提高腫瘤細胞的遷移能力。本研究采用蛋Western blot法對肝癌組織和癌旁正常組織中NF-κB的表達水平進行檢測,結果顯示,與癌旁正常組織相比,肝癌組織中NF-κB的相對表達量明顯增高(P<0.01)。提示在肝癌組織中被激活的PKC-α可能同樣激活了NF-κB。上述研究表明,Trop-2可能通過調控PKC-α/NF-κB通路影響肝癌的發(fā)生、發(fā)展。為了進一步驗證Trop-2對PKC-α和NF-κB的影響,本研究采用Trop-2siRNA干擾Trop-2表達,結果顯示:Trop-2siRNA組HepG2細胞中p-PKC-α、PKC-α和NF-κB蛋白的相對表達量均低于空白對照組和陰性對照組,表明Trop-2是PKC-α-NF-κB通路的上游基因。
綜上所述,Trop-2在肝癌組織中高表達,其可能通過PKC-α/NF-κB通路調控肝癌的發(fā)生發(fā)展,通過靶向沉默Trop-2可以抑制肝癌細胞的增殖,但其具體調節(jié)機制還需要更進一步的深入了解和研究。