張健，馬海#，楊柳，楊紅春，何振興

南充市中心醫(yī)院1普外科，2呼吸內(nèi)科，四川 南充637000

肝癌為臨床常見的一種惡性腫瘤，在過去20年中，全世界肝癌的發(fā)病率和病死率均增長了約1倍[1]。在中國，肝癌的發(fā)病率和病死率分別居惡性腫瘤第3位和第2位，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康[2]。腫瘤相關(guān)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白2（tumor-associated calcium signal transducer 2，Trop-2）是GA733基因家族中的一個細(xì)胞表面受體，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)導(dǎo)Ca2+信號[3]。相關(guān)研究表明，Trop-2在肺腺癌、胃癌和卵巢漿液性囊腺癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，且其高表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤的生長，與患者的預(yù)后不良有關(guān)[4-6]。Trop-2高表達(dá)可能參與腫瘤的惡性生物學(xué)行為，但其在肝癌中的作用及作用機(jī)制尚不明確。蛋白激酶 C-α（protein kinase C alpha，PKC-α）作為上游調(diào)節(jié)因子，通過磷酸化核因子κB抑制因子（inhibitor of nuclear factor kappa B，IκB）激活核因子-κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB），從而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)展[7]。本研究探究了Trop-2基因在肝癌組織和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探究了其對肝癌細(xì)胞增殖的影響，旨在為肝癌的預(yù)后和靶點(diǎn)治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2016—2017年于南充市中心醫(yī)院行手術(shù)切除的10例肝癌患者的肝癌組織標(biāo)本和癌旁正常組織標(biāo)本，所有患者在手術(shù)之前均未接受任何治療。人肝癌細(xì)胞株HepG2、人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株HCCLM3和人正常肝細(xì)胞株HL-7702均購自武漢普諾賽公司。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基和雙抗（青霉素和鏈霉素）均購自美國Hyclone公司，南美胎牛血清購自美國Hyclone公司，PE Mouse Anti-Human Trop-2（564837）、Cycletest Plus DNA Reagent kit均購自美國BD生物公司，兔抗人Trop-2、兔抗人PKC-α、兔抗人p-PKC-α和兔抗人NF-κB抗體均購自美國Abcam公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗購自美國CST公司，總RNA提取試劑盒、CCK-8試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，Prime-ScriptTMRT reagent kit、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司，Trop-2和β-acting引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。TDZ4-WS型臺式低速離心機(jī)購自長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司，MCO-15AC型二氧化碳培養(yǎng)箱購自三洋電機(jī)國際貿(mào)易有限公司，酶標(biāo)儀（Multlskan）購自賽默飛世爾儀器有限公司，Cytoflex型流式分析儀購自美國Beckman公司。

1.3 Trop-2 siRNA引物序列設(shè)計

在GeneBank中查找Trop-2的基因序列，設(shè)計Trop-2siRNA和無關(guān)序列的寡核苷酸。Trop-2siRNA上游引物：5'-CACCTTCAAGACGTTTTTTG-3'，下游引物：5'-AGCTCAAAAAACGTCTTGAA-3'；陰性對照siRNA上游引物：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，下游引物：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。以上引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將人肝癌細(xì)胞HepG2、人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞HCCLM3和人正常肝細(xì)胞HL-7702分別接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)80%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或進(jìn)行實驗。收集處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，分為3組：空白對照組，僅添加Lipofectamine 2000不做轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞；陰性對照組，轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的HepG2細(xì)胞；Trop-2siRNA組，轉(zhuǎn)染Trop-2siRNA序列的HepG2細(xì)胞。采用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h后更換培養(yǎng)液，24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格參照試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.5 免疫組織化學(xué)染色法檢測不同組織中Trop-2蛋白的表達(dá)情況

取肝癌組織和癌旁正常組織，常規(guī)石蠟包埋切片后，65℃烤片30 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。3%過氧化氫室溫浸泡15 min后，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，每次5 min，滴加5%牛血清蛋白封閉液，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，吸去多余液體，滴加1∶100稀釋的Trop-2一抗，4℃冰箱過夜。37℃培養(yǎng)箱復(fù)溫30 min，PBS清洗3次，每次5 min。滴加IgG，37℃培養(yǎng)箱孵育30 min后，PBS沖洗3次，每次5 min。滴加鏈霉抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù) 合 物（streptavidin-biotin-peroxidase complex，SABC）試劑，37℃培養(yǎng)箱孵育30 min后PBS清洗3次，每次5 min。3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）顯色5 min（顯微鏡下控制），使細(xì)胞質(zhì)均勻著黃棕色，自來水終止顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核2～3 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化（快速），梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性光學(xué)樹脂封片。采用PBS替代一抗作為陰性對照組。使用IPP 6.0軟件對免疫組化圖片進(jìn)行積分光密度值（integral optical density，IOD）檢測。

1.6 實時熒光定量PCR檢測不同組織中Trop-2 mRNA表達(dá)

采用總RNA提取試劑提取肝癌組織及癌旁正常組織中的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime-Script?RT reagent kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，制備 cDNA，各cDNA樣品分別用下列引物進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）。Trop-2上游引物：5'-CCTCATCGCCGTCATCGT-3'；下游引物：5'-CGGTTCCTTTCTCAACTCCC-3'。β-actin上游引物：5'-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3'；下游引物：5'-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3'。反應(yīng)體系12.5 μl：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 6.25 μl、上游引物0.5 μl、下游引物 0.5 μl、雙蒸水 4.25 μl、cDNA 1 μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25個循環(huán)。以βactin為內(nèi)參，以2-ΔΔCt法計算肝癌組織及癌旁正常組織中Trop-2mRNA的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同細(xì)胞中Trop-2蛋白表達(dá)

取對數(shù)生長期的未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HepG2、HCCLM3和HL-7702細(xì)胞，接種于DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至融合度達(dá)80%時收集細(xì)胞，參照FIX/PERM試劑盒操作說明書，在培養(yǎng)液中加入100 ml Reagent A室溫孵育10 min，400g離心5 min，吸棄上清液；采用適量PBS洗滌2次，每次3 min，350g離心5 min，吸棄上清液，加入100 μl Reagent B混勻后，加入PE Mouse Anti-Human Trop-2，避光混勻，4℃避光反應(yīng)30 min，PBS洗滌2次，每次3 min，350g離心5 min，吸棄上清液，加入1%多聚甲醛重懸細(xì)胞后，采用流式細(xì)胞儀檢測HepG2細(xì)胞、HCCLM3細(xì)胞及HL-7702細(xì)胞中Trop-2蛋白的表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）檢測蛋白表達(dá)量

1.8.1 不同組織中相關(guān)蛋白檢測 肝癌組織和癌旁正常組織中相關(guān)蛋白檢測：取適當(dāng)大小的組織塊，加入300 L細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解30 min，其間在渦旋器上進(jìn)行充分混合；然后以12 000 r/min于4℃離心20 min，收集上清液。采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法進(jìn)行蛋白質(zhì)定性，每4 μl蛋白質(zhì)樣品中加入1 μl十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（5×），混合蛋白質(zhì)樣品和緩沖液，煮沸5 min，樣品于-20℃保存?zhèn)溆?。使用等量蛋白質(zhì)上樣，選擇10%SDS-PAGE進(jìn)行分離，分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，封閉結(jié)束后結(jié)合一抗（Trop-2、PKC-α、p-PKC-α、NF-κB和β-actin均按1∶400稀釋），4℃孵育過夜后TBST清洗，然后加入二抗（稀釋比例均為1∶5000）室溫孵育1 h，TBST清洗，ECL暗室顯色。顯色后的蛋白使用Bio-Rad全功能成像系統(tǒng)采集圖像，Image-ProPlus分析光密度，以β-actin為內(nèi)參，檢測肝癌組織和癌旁組織中NF-κB、PKC-α、p-PKC-α、Trop-2的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.8.2 不同細(xì)胞中相關(guān)蛋白檢測 收集處于對數(shù)生長期的未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HepG2、HCCLM3、HL-7702細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后的空白對照組、陰性對照組、Trop-2siRNA組HepG2細(xì)胞，預(yù)冷PBS沖洗2次，每次3 min，每孔加入約100 μl全細(xì)胞蛋白質(zhì)裂解液，振蕩混勻，置冰上10 min后將細(xì)胞收集于1.5 ml離心管中。裂解體系在冰上進(jìn)行超聲作用，每次3 s，共3次，每次間隔1 s，超聲后的裂解體系于4℃、13 000 r/min離心5 min并收集上清。用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。其余操作方法同“1.8.1”。計算未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HepG2、HCCLM3和HL-7702細(xì)胞中Trop-2的相對表達(dá)量及空白對照組、陰性對照組、Trop-2siRNA組HepG2細(xì)胞中Trop-2、NF-κB、PKC-α和p-PKC-α蛋白的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.9 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖率

取處于對數(shù)生長期的陰性對照組、Trop-2siRNA組HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104/ml，接種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl CCK-8，4 h后終止培養(yǎng)，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長下測定細(xì)胞吸光度值。實驗重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，3組間比較用單因素方差分析（ANOVA-LSD）；計數(shù)資料以例數(shù)表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中Trop-2蛋白表達(dá)水平的比較

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：肝癌組織細(xì)胞質(zhì)中淺黃色顆粒較多，癌旁正常組織細(xì)胞質(zhì)中淺黃色顆粒極少（圖1）。IPP6.0軟件對免疫組織化學(xué)染色圖片進(jìn)行IOD檢測，結(jié)果顯示：肝癌組織中Trop-2蛋白的相對表達(dá)量為（0.27±0.01），明顯高于癌旁正常組織的（0.23±0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.637，P＜0.01）。

圖1 肝癌組織和癌旁正常組織中Trop-2蛋白的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色法，×400）

2.2 不同組織中Trop-2 mRNA表達(dá)水平的比較

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示：肝癌組織中Trop-2mRNA的相對表達(dá)量為（5.60±1.19），明顯高于癌旁正常組織的（0.98±0.18），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.066，P＜0.01）。

2.3 不同細(xì)胞中Trop-2蛋白的表達(dá)情況

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：HCCLM3細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中Trop-2蛋白的相對表達(dá)量分別為（91.21±2.50）%、（94.14±2.36）%，均明顯高于HL-7702細(xì)胞的（7.97±1.50）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=49.550、53.440，P＜0.01）（圖2）。Western blot檢測結(jié)果顯示，HCCLM3細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中Trop-2蛋白的相對表達(dá)量分別為（0.91±0.08）、（0.81±0.04），均高于HL-7702細(xì)胞的（0.67±0.06），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.157、3.363，P＜0.05）（圖3）。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測Trop-2蛋白在未經(jīng)轉(zhuǎn)染的 3種細(xì)胞中的表達(dá)情況

圖3 Western blot檢測Trop-2蛋白在未經(jīng)轉(zhuǎn)染的 3種細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.4 Westernblot檢測不同組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)

肝癌組織中p-PKC-α、NF-κB和Trop-2蛋白的相對表達(dá)量均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。肝癌組織中PKC-α蛋白的相對表達(dá)量與癌旁正常組織比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

表1 不同組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

組織類型肝癌組織癌旁正常組織t值P值0.97±0.03 0.47±0.07 2.947＜0.01 1.02±0.05 0.78±0.07 0.154＜0.01 0.93±0.07 0.91±0.07 0.845＞0.05 1.03±0.05 0.77±0.05 0.030＜0.01 Trop-2 p-PCK-α PCK-α NF-κB

2.5 沉默Trop-2對肝癌HepG 2細(xì)胞相關(guān)蛋白的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示：Trop-2siRNA組HepG2細(xì)胞中Trop-2、p-PKC-α、PKC-α和NF-κB蛋白的相對表達(dá)量均低于空白對照組和陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陰性對照組HepG2細(xì)胞中Trop-2、p-PKC-α、PKC-α和NF-κB蛋白的相對表達(dá)量與空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同組別HepG 2細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

表2 不同組別HepG 2細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

注：a與空白對照組比較，P＜0.05；b與陰性對照組比較，P＜0.05

組別空白對照組陰性對照組Trop-2 siRNA組1.03±0.08 1.02±0.11 0.81±0.10a b 0.98±0.03 1.02±0.11 0.71±0.12a b0.97±0.03 0.93±0.09 0.78±0.06a b 1.00±0.00 0.98±0.10 0.73±0.11a b Trop-2 p-PCK-α PCK-α NF-κB

2.6 沉默Trop-2對肝癌HepG 2細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法檢測結(jié)果顯示：Trop-2siRNA組HepG2細(xì)胞的增殖率為（76.953±9.043）%，低于陰性對照組的（96.940±15.752）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.564，P＜0.05）。

3 討論

Trop-2由Lipinski在1981年首次從滋養(yǎng)層細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)，并證實其在正常組織中幾乎不表達(dá)。喬宇[8]在對影響直腸癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的因子進(jìn)行分析時發(fā)現(xiàn)，Trop-2在直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，且與患者的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。Heist等[9]對肺癌患者行Trop-2抗體聯(lián)合腫瘤藥物治療，結(jié)果顯示該聯(lián)合方案治療可以延緩患者的病情進(jìn)展。目前，關(guān)于Trop-2在肝癌發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制的研究尚少。因此，本研究對Trop-2在肝癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，肝癌組織中Trop-2蛋白和mRNA的相對表達(dá)量均高于癌旁正常組織（P＜0.05）；流式細(xì)胞術(shù)和Western blot法對人肝癌細(xì)胞株HepG2、人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株HCCLM3和人正常肝細(xì)胞株HL-7702中Trop-2蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示HepG2細(xì)胞和HCCLM3細(xì)胞中Trop-2蛋白的相對表達(dá)量均高于HL-7702細(xì)胞（P＜0.05）。提示Trop-2可能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的惡性增殖或遷移，可作為肝癌預(yù)后的標(biāo)志基因。為了驗證這一推測，本研究采用RNA干擾技術(shù)沉默細(xì)胞中Trop-2基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Trop-2沉默后，HepG2細(xì)胞增殖率被顯著性降低。進(jìn)一步說明了Trop-2可能參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展，可以作為肝癌預(yù)后的標(biāo)志基因。本研究上述結(jié)果也與乳腺癌、肺癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤報道的結(jié)果相一致[10-11]。

Trop-2作為一種跨膜鈣信號傳感器，能夠與PKC-α催化區(qū)結(jié)合，并磷酸化細(xì)胞質(zhì)中的PKC-α，使其轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜并激活下游其他蛋白[12]。本研究采用Western blot法檢測不同組織中PKC-α和p-PKC-α的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌組織中p-PKC-α蛋白的相對表達(dá)量明顯高于癌旁組織（P＜0.01），但兩種組織中PKC-α蛋白的相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示PKC-α可能是Trop-2的下游基因，過表達(dá)的Trop-2與PKC-α相結(jié)合，可以促進(jìn)其激活。也有學(xué)者推測，Trop-2與PKC-α之間是一種正反饋調(diào)節(jié)，Trop-2被激活后，促使更多的PKC-α被磷酸化，而p-PKC-α又促進(jìn)Trop-2的激活，這種正反饋調(diào)節(jié)在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[13]。正常生理條件下，NF-κB與抑制因子IκBα在細(xì)胞質(zhì)中形成復(fù)合物，其功能活性被抑制；當(dāng)受到上游配體或細(xì)胞外刺激激活后，IκB蛋白激酶復(fù)合物（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK）進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)因子表達(dá)。龐雪蓮[14]對PKC-α與NF-κB在食管癌中的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果顯示PKC-α被磷酸化后，可以激活NF-κB上游激酶IKK，最終激活NF-κB，提高腫瘤細(xì)胞的遷移能力。本研究采用蛋Western blot法對肝癌組織和癌旁正常組織中NF-κB的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，肝癌組織中NF-κB的相對表達(dá)量明顯增高（P＜0.01）。提示在肝癌組織中被激活的PKC-α可能同樣激活了NF-κB。上述研究表明，Trop-2可能通過調(diào)控PKC-α/NF-κB通路影響肝癌的發(fā)生、發(fā)展。為了進(jìn)一步驗證Trop-2對PKC-α和NF-κB的影響，本研究采用Trop-2siRNA干擾Trop-2表達(dá)，結(jié)果顯示：Trop-2siRNA組HepG2細(xì)胞中p-PKC-α、PKC-α和NF-κB蛋白的相對表達(dá)量均低于空白對照組和陰性對照組，表明Trop-2是PKC-α-NF-κB通路的上游基因。

綜上所述，Trop-2在肝癌組織中高表達(dá)，其可能通過PKC-α/NF-κB通路調(diào)控肝癌的發(fā)生發(fā)展，通過靶向沉默Trop-2可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制還需要更進(jìn)一步的深入了解和研究。