張健，馬海#，楊柳，楊紅春，何振興

南充市中心醫(yī)院1普外科，2呼吸內科，四川 南充637000

肝癌為臨床常見的一種惡性腫瘤，在過去20年中，全世界肝癌的發(fā)病率和病死率均增長了約1倍[1]。在中國，肝癌的發(fā)病率和病死率分別居惡性腫瘤第3位和第2位，嚴重威脅著人們的生命健康[2]。腫瘤相關鈣信號轉導蛋白2（tumor-associated calcium signal transducer 2，Trop-2）是GA733基因家族中的一個細胞表面受體，負責轉導Ca2+信號[3]。相關研究表明，Trop-2在肺腺癌、胃癌和卵巢漿液性囊腺癌等多種惡性腫瘤中高表達，且其高表達能夠促進腫瘤的生長，與患者的預后不良有關[4-6]。Trop-2高表達可能參與腫瘤的惡性生物學行為，但其在肝癌中的作用及作用機制尚不明確。蛋白激酶 C-α（protein kinase C alpha，PKC-α）作為上游調節(jié)因子，通過磷酸化核因子κB抑制因子（inhibitor of nuclear factor kappa B，IκB）激活核因子-κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB），從而促進卵巢癌的發(fā)展[7]。本研究探究了Trop-2基因在肝癌組織和肝癌細胞中的表達情況，并進一步探究了其對肝癌細胞增殖的影響，旨在為肝癌的預后和靶點治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2016—2017年于南充市中心醫(yī)院行手術切除的10例肝癌患者的肝癌組織標本和癌旁正常組織標本，所有患者在手術之前均未接受任何治療。人肝癌細胞株HepG2、人高轉移肝癌細胞株HCCLM3和人正常肝細胞株HL-7702均購自武漢普諾賽公司。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基和雙抗（青霉素和鏈霉素）均購自美國Hyclone公司，南美胎牛血清購自美國Hyclone公司，PE Mouse Anti-Human Trop-2（564837）、Cycletest Plus DNA Reagent kit均購自美國BD生物公司，兔抗人Trop-2、兔抗人PKC-α、兔抗人p-PKC-α和兔抗人NF-κB抗體均購自美國Abcam公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗購自美國CST公司，總RNA提取試劑盒、CCK-8試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，Prime-ScriptTMRT reagent kit、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司，Trop-2和β-acting引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。TDZ4-WS型臺式低速離心機購自長沙湘儀離心機儀器有限公司，MCO-15AC型二氧化碳培養(yǎng)箱購自三洋電機國際貿易有限公司，酶標儀（Multlskan）購自賽默飛世爾儀器有限公司，Cytoflex型流式分析儀購自美國Beckman公司。

1.3 Trop-2 siRNA引物序列設計

在GeneBank中查找Trop-2的基因序列，設計Trop-2siRNA和無關序列的寡核苷酸。Trop-2siRNA上游引物：5'-CACCTTCAAGACGTTTTTTG-3'，下游引物：5'-AGCTCAAAAAACGTCTTGAA-3'；陰性對照siRNA上游引物：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，下游引物：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。以上引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 細胞培養(yǎng)及轉染

將人肝癌細胞HepG2、人高轉移肝癌細胞HCCLM3和人正常肝細胞HL-7702分別接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達80%時，進行傳代培養(yǎng)或進行實驗。收集處于對數生長期的HepG2細胞，分為3組：空白對照組，僅添加Lipofectamine 2000不做轉染的HepG2細胞；陰性對照組，轉染無關序列的HepG2細胞；Trop-2siRNA組，轉染Trop-2siRNA序列的HepG2細胞。采用Lipofectamine 2000進行轉染，6 h后更換培養(yǎng)液，24 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。細胞轉染步驟嚴格參照試劑盒操作說明書進行。

1.5 免疫組織化學染色法檢測不同組織中Trop-2蛋白的表達情況

取肝癌組織和癌旁正常組織，常規(guī)石蠟包埋切片后，65℃烤片30 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。3%過氧化氫室溫浸泡15 min后，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，每次5 min，滴加5%牛血清蛋白封閉液，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，吸去多余液體，滴加1∶100稀釋的Trop-2一抗，4℃冰箱過夜。37℃培養(yǎng)箱復溫30 min，PBS清洗3次，每次5 min。滴加IgG，37℃培養(yǎng)箱孵育30 min后，PBS沖洗3次，每次5 min。滴加鏈霉抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復 合 物（streptavidin-biotin-peroxidase complex，SABC）試劑，37℃培養(yǎng)箱孵育30 min后PBS清洗3次，每次5 min。3，3’-二氨基聯苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）顯色5 min（顯微鏡下控制），使細胞質均勻著黃棕色，自來水終止顯色，蘇木素復染細胞核2～3 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化（快速），梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性光學樹脂封片。采用PBS替代一抗作為陰性對照組。使用IPP 6.0軟件對免疫組化圖片進行積分光密度值（integral optical density，IOD）檢測。

1.6 實時熒光定量PCR檢測不同組織中Trop-2 mRNA表達

采用總RNA提取試劑提取肝癌組織及癌旁正常組織中的總RNA，使用逆轉錄試劑盒Prime-Script?RT reagent kit進行逆轉錄，制備 cDNA，各cDNA樣品分別用下列引物進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）。Trop-2上游引物：5'-CCTCATCGCCGTCATCGT-3'；下游引物：5'-CGGTTCCTTTCTCAACTCCC-3'。β-actin上游引物：5'-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3'；下游引物：5'-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3'。反應體系12.5 μl：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 6.25 μl、上游引物0.5 μl、下游引物 0.5 μl、雙蒸水 4.25 μl、cDNA 1 μl；反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25個循環(huán)。以βactin為內參，以2-ΔΔCt法計算肝癌組織及癌旁正常組織中Trop-2mRNA的相對表達量。實驗重復3次。

1.7 流式細胞術檢測不同細胞中Trop-2蛋白表達

取對數生長期的未經轉染的HepG2、HCCLM3和HL-7702細胞，接種于DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至融合度達80%時收集細胞，參照FIX/PERM試劑盒操作說明書，在培養(yǎng)液中加入100 ml Reagent A室溫孵育10 min，400g離心5 min，吸棄上清液；采用適量PBS洗滌2次，每次3 min，350g離心5 min，吸棄上清液，加入100 μl Reagent B混勻后，加入PE Mouse Anti-Human Trop-2，避光混勻，4℃避光反應30 min，PBS洗滌2次，每次3 min，350g離心5 min，吸棄上清液，加入1%多聚甲醛重懸細胞后，采用流式細胞儀檢測HepG2細胞、HCCLM3細胞及HL-7702細胞中Trop-2蛋白的表達水平。實驗重復3次。

1.8 蛋白質印跡法（Westernblot）檢測蛋白表達量

1.8.1 不同組織中相關蛋白檢測 肝癌組織和癌旁正常組織中相關蛋白檢測：取適當大小的組織塊，加入300 L細胞裂解液，置于冰上裂解30 min，其間在渦旋器上進行充分混合；然后以12 000 r/min于4℃離心20 min，收集上清液。采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法進行蛋白質定性，每4 μl蛋白質樣品中加入1 μl十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（5×），混合蛋白質樣品和緩沖液，煮沸5 min，樣品于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂玫攘康鞍踪|上樣，選擇10%SDS-PAGE進行分離，分離后的蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，封閉結束后結合一抗（Trop-2、PKC-α、p-PKC-α、NF-κB和β-actin均按1∶400稀釋），4℃孵育過夜后TBST清洗，然后加入二抗（稀釋比例均為1∶5000）室溫孵育1 h，TBST清洗，ECL暗室顯色。顯色后的蛋白使用Bio-Rad全功能成像系統采集圖像，Image-ProPlus分析光密度，以β-actin為內參，檢測肝癌組織和癌旁組織中NF-κB、PKC-α、p-PKC-α、Trop-2的相對表達量。實驗重復3次。

1.8.2 不同細胞中相關蛋白檢測 收集處于對數生長期的未經轉染的HepG2、HCCLM3、HL-7702細胞和轉染后的空白對照組、陰性對照組、Trop-2siRNA組HepG2細胞，預冷PBS沖洗2次，每次3 min，每孔加入約100 μl全細胞蛋白質裂解液，振蕩混勻，置冰上10 min后將細胞收集于1.5 ml離心管中。裂解體系在冰上進行超聲作用，每次3 s，共3次，每次間隔1 s，超聲后的裂解體系于4℃、13 000 r/min離心5 min并收集上清。用BCA法進行蛋白質定量。其余操作方法同“1.8.1”。計算未經轉染的HepG2、HCCLM3和HL-7702細胞中Trop-2的相對表達量及空白對照組、陰性對照組、Trop-2siRNA組HepG2細胞中Trop-2、NF-κB、PKC-α和p-PKC-α蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.9 CCK-8法檢測細胞增殖率

取處于對數生長期的陰性對照組、Trop-2siRNA組HepG2細胞，調整細胞濃度為4×104/ml，接種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl CCK-8，4 h后終止培養(yǎng)，采用酶標儀于450 nm波長下測定細胞吸光度值。實驗重復3次。

1.10 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件對數據進行分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，3組間比較用單因素方差分析（ANOVA-LSD）；計數資料以例數表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中Trop-2蛋白表達水平的比較

免疫組織化學染色結果顯示：肝癌組織細胞質中淺黃色顆粒較多，癌旁正常組織細胞質中淺黃色顆粒極少（圖1）。IPP6.0軟件對免疫組織化學染色圖片進行IOD檢測，結果顯示：肝癌組織中Trop-2蛋白的相對表達量為（0.27±0.01），明顯高于癌旁正常組織的（0.23±0.01），差異有統計學意義（t=12.637，P＜0.01）。

圖1 肝癌組織和癌旁正常組織中Trop-2蛋白的表達情況（免疫組織化學染色法，×400）

2.2 不同組織中Trop-2 mRNA表達水平的比較

qRT-PCR檢測結果顯示：肝癌組織中Trop-2mRNA的相對表達量為（5.60±1.19），明顯高于癌旁正常組織的（0.98±0.18），差異有統計學意義（t=12.066，P＜0.01）。

2.3 不同細胞中Trop-2蛋白的表達情況

流式細胞術檢測結果顯示：HCCLM3細胞和HepG2細胞中Trop-2蛋白的相對表達量分別為（91.21±2.50）%、（94.14±2.36）%，均明顯高于HL-7702細胞的（7.97±1.50）%，差異均有統計學意義（t=49.550、53.440，P＜0.01）（圖2）。Western blot檢測結果顯示，HCCLM3細胞和HepG2細胞中Trop-2蛋白的相對表達量分別為（0.91±0.08）、（0.81±0.04），均高于HL-7702細胞的（0.67±0.06），差異均有統計學意義（t=4.157、3.363，P＜0.05）（圖3）。

圖2 流式細胞術檢測Trop-2蛋白在未經轉染的 3種細胞中的表達情況

圖3 Western blot檢測Trop-2蛋白在未經轉染的 3種細胞中的表達情況

2.4 Westernblot檢測不同組織中相關蛋白的表達

肝癌組織中p-PKC-α、NF-κB和Trop-2蛋白的相對表達量均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）。肝癌組織中PKC-α蛋白的相對表達量與癌旁正常組織比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同組織中相關蛋白表達水平的比較（±s）

表1 不同組織中相關蛋白表達水平的比較（±s）

組織類型肝癌組織癌旁正常組織t值P值0.97±0.03 0.47±0.07 2.947＜0.01 1.02±0.05 0.78±0.07 0.154＜0.01 0.93±0.07 0.91±0.07 0.845＞0.05 1.03±0.05 0.77±0.05 0.030＜0.01 Trop-2 p-PCK-α PCK-α NF-κB

2.5 沉默Trop-2對肝癌HepG 2細胞相關蛋白的影響

Western blot檢測結果顯示：Trop-2siRNA組HepG2細胞中Trop-2、p-PKC-α、PKC-α和NF-κB蛋白的相對表達量均低于空白對照組和陰性對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；陰性對照組HepG2細胞中Trop-2、p-PKC-α、PKC-α和NF-κB蛋白的相對表達量與空白對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同組別HepG 2細胞中相關蛋白表達水平的比較（±s）

表2 不同組別HepG 2細胞中相關蛋白表達水平的比較（±s）

注：a與空白對照組比較，P＜0.05；b與陰性對照組比較，P＜0.05

組別空白對照組陰性對照組Trop-2 siRNA組1.03±0.08 1.02±0.11 0.81±0.10a b 0.98±0.03 1.02±0.11 0.71±0.12a b0.97±0.03 0.93±0.09 0.78±0.06a b 1.00±0.00 0.98±0.10 0.73±0.11a b Trop-2 p-PCK-α PCK-α NF-κB

2.6 沉默Trop-2對肝癌HepG 2細胞增殖的影響

CCK-8法檢測結果顯示：Trop-2siRNA組HepG2細胞的增殖率為（76.953±9.043）%，低于陰性對照組的（96.940±15.752）%，差異有統計學意義（t=6.564，P＜0.05）。

3 討論

Trop-2由Lipinski在1981年首次從滋養(yǎng)層細胞膜上發(fā)現，并證實其在正常組織中幾乎不表達。喬宇[8]在對影響直腸癌轉移及預后的因子進行分析時發(fā)現，Trop-2在直腸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，且與患者的腫瘤分期、淋巴結轉移和遠處轉移情況有關。Heist等[9]對肺癌患者行Trop-2抗體聯合腫瘤藥物治療，結果顯示該聯合方案治療可以延緩患者的病情進展。目前，關于Trop-2在肝癌發(fā)生發(fā)展中作用機制的研究尚少。因此，本研究對Trop-2在肝癌組織和細胞中的表達情況進行研究，結果顯示，肝癌組織中Trop-2蛋白和mRNA的相對表達量均高于癌旁正常組織（P＜0.05）；流式細胞術和Western blot法對人肝癌細胞株HepG2、人高轉移肝癌細胞株HCCLM3和人正常肝細胞株HL-7702中Trop-2蛋白的表達水平進行檢測，結果顯示HepG2細胞和HCCLM3細胞中Trop-2蛋白的相對表達量均高于HL-7702細胞（P＜0.05）。提示Trop-2可能促進肝癌細胞的惡性增殖或遷移，可作為肝癌預后的標志基因。為了驗證這一推測，本研究采用RNA干擾技術沉默細胞中Trop-2基因表達，結果發(fā)現Trop-2沉默后，HepG2細胞增殖率被顯著性降低。進一步說明了Trop-2可能參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展，可以作為肝癌預后的標志基因。本研究上述結果也與乳腺癌、肺癌和頭頸部鱗狀細胞癌等惡性腫瘤報道的結果相一致[10-11]。

Trop-2作為一種跨膜鈣信號傳感器，能夠與PKC-α催化區(qū)結合，并磷酸化細胞質中的PKC-α，使其轉移至細胞膜并激活下游其他蛋白[12]。本研究采用Western blot法檢測不同組織中PKC-α和p-PKC-α的表達情況，結果發(fā)現肝癌組織中p-PKC-α蛋白的相對表達量明顯高于癌旁組織（P＜0.01），但兩種組織中PKC-α蛋白的相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。提示PKC-α可能是Trop-2的下游基因，過表達的Trop-2與PKC-α相結合，可以促進其激活。也有學者推測，Trop-2與PKC-α之間是一種正反饋調節(jié)，Trop-2被激活后，促使更多的PKC-α被磷酸化，而p-PKC-α又促進Trop-2的激活，這種正反饋調節(jié)在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[13]。正常生理條件下，NF-κB與抑制因子IκBα在細胞質中形成復合物，其功能活性被抑制；當受到上游配體或細胞外刺激激活后，IκB蛋白激酶復合物（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK）進入細胞核，調節(jié)相關因子表達。龐雪蓮[14]對PKC-α與NF-κB在食管癌中的關系進行研究，結果顯示PKC-α被磷酸化后，可以激活NF-κB上游激酶IKK，最終激活NF-κB，提高腫瘤細胞的遷移能力。本研究采用蛋Western blot法對肝癌組織和癌旁正常組織中NF-κB的表達水平進行檢測，結果顯示，與癌旁正常組織相比，肝癌組織中NF-κB的相對表達量明顯增高（P＜0.01）。提示在肝癌組織中被激活的PKC-α可能同樣激活了NF-κB。上述研究表明，Trop-2可能通過調控PKC-α/NF-κB通路影響肝癌的發(fā)生、發(fā)展。為了進一步驗證Trop-2對PKC-α和NF-κB的影響，本研究采用Trop-2siRNA干擾Trop-2表達，結果顯示：Trop-2siRNA組HepG2細胞中p-PKC-α、PKC-α和NF-κB蛋白的相對表達量均低于空白對照組和陰性對照組，表明Trop-2是PKC-α-NF-κB通路的上游基因。

綜上所述，Trop-2在肝癌組織中高表達，其可能通過PKC-α/NF-κB通路調控肝癌的發(fā)生發(fā)展，通過靶向沉默Trop-2可以抑制肝癌細胞的增殖，但其具體調節(jié)機制還需要更進一步的深入了解和研究。