魯志剛，賈慧瓊，張欣，魯艷

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1胸外科，2高壓氧科，呼和浩特 010050

3內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，呼和浩特010010

食管癌是中國(guó)常見的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均高于世界主要發(fā)達(dá)國(guó)家水平[1]。高壓氧（hyperbaric oxygen，HBO）是臨床用于治療外傷、缺血、缺氧性疾病的常見手段[2]，過(guò)去由于擔(dān)心高氧分壓會(huì)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，HBO在惡性腫瘤中的應(yīng)用起步較晚[3]。Feldmeier等[4]研究指出，HBO用于惡性腫瘤是安全的；后續(xù)研究指出，HBO甚至可能對(duì)某些惡性腫瘤亞型具有生長(zhǎng)抑制作用，對(duì)腫瘤放射治療有增強(qiáng)作用[5]。因此，深入研究惡性腫瘤氧合作用及其增強(qiáng)放化療療效的機(jī)制十分必要[6]。目前，HBO對(duì)惡性腫瘤的作用研究已在乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、血液腫瘤、結(jié)直腸癌及泌尿系腫瘤中開展[7]，但在食管癌中的研究較少。本研究建立了裸鼠食管癌模型，采用HBO聯(lián)合化療方式進(jìn)行干預(yù)，觀察該聯(lián)合方式的治療效果，并對(duì)磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphate and tension homolog，PTEN）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的表達(dá)情況進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c裸鼠40只，4～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，雌性與雄性裸鼠各20只，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；TE-1人食管癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。

1.2 食管癌模型建立

參考胡翠梨等[8]方法建立裸鼠食管癌模型，隨機(jī)選取30只BALB/c裸鼠采用皮下接種法向裸鼠右側(cè)腋部皮下注入甲基芐基亞硝胺（methyl-benzyl-nitrosamine，MBNA），每次3.5 mg/kg，每周2次，連續(xù)注射20周，建立食管癌大鼠模型。以瘤結(jié)節(jié)直徑達(dá)0.5 cm作為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。選取30只食管癌成模裸鼠及10只同期飼養(yǎng)的健康裸鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及治療方案

將同期飼養(yǎng)的10只健康裸鼠作為對(duì)照組，采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只食管癌模型裸鼠隨機(jī)分為模型組、化療組、化療聯(lián)合HBO組（聯(lián)合組），每組10例。對(duì)照組與模型組裸鼠均給予5 ml/kg生理鹽水灌服，每天1次，共30天；化療組裸鼠給予4 mg/ml替加氟溶液灌服，5 ml/kg，每天1次，共30天；聯(lián)合組在化療組裸鼠的基礎(chǔ)上給予HBO治療（在應(yīng)用化療藥物前進(jìn)行），2.0絕對(duì)大氣壓穩(wěn)壓吸氧60 min，每天1次，治療10天，停10天，再治療10天，共30天。

1.4 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

治療結(jié)束后處死裸鼠，測(cè)量所有食管癌模型裸鼠的腫瘤大小，腫瘤體積=瘤體長(zhǎng)徑×瘤體短徑2×0.5。取對(duì)照組裸鼠的正常食管黏膜組織和其他3組裸鼠的移植瘤組織，采用免疫組織化學(xué)半定量分析正常食管黏膜組織和移植瘤組織中PTEN、HIF-1α的表達(dá)情況。每張切片在高倍鏡（×400）下隨機(jī)選取5個(gè)具有代表性的視野拍照，使用圖像分析軟件IPP 6.0（image pro plus 6.0）進(jìn)行光密度測(cè)量：選擇圖片上免疫組化反應(yīng)物的黃色區(qū)域（排除細(xì)胞核上藍(lán)色的復(fù)染區(qū)域不會(huì)影響測(cè)量），然后測(cè)量這些區(qū)域的平均光密度（optical density，OD）值，取5個(gè)視野測(cè)量值的平均值。免疫組織化學(xué)法結(jié)果判定：細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃顆粒為PTEN、HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤體積的比較

治療后，模型組、化療組、聯(lián)合組裸鼠的腫瘤體積分別為（47.20±4.43）、（25.45±3.79）、（20.40±4.47）cm3，三組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=112.730，P＜0.01）。其中，化療組與聯(lián)合組裸鼠的腫瘤體積均小于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合組裸鼠的腫瘤體積小于化療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 PTEN及HIF-1α表達(dá)水平的比較

對(duì)照組裸鼠正常食管黏膜組織和模型組、化療組、聯(lián)合組裸鼠的移植瘤組織中PTEN和HIF-1α的表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=29.549、23.788，P＜0.01）。模型組、化療組和聯(lián)合組裸鼠的移植瘤組織中PTEN的表達(dá)水平均低于對(duì)照組，HIF-1α的表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組裸鼠的移植瘤組織中PTEN的表達(dá)水平低于化療組和聯(lián)合組，HIF-1α的表達(dá)水平高于化療組和聯(lián)合組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；化療組裸鼠的移植瘤組織中PTEN的表達(dá)水平低于聯(lián)合組，HIF-1α的表達(dá)水平高于聯(lián)合組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同組別裸鼠中PTEN、HIF-1α表達(dá)水平的比較（±s）

表1 不同組別裸鼠中PTEN、HIF-1α表達(dá)水平的比較（±s）

注：a與對(duì)照組比較，P＜0.05；b與模型組比較，P＜0.05；c與化療組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組（n=10）模型組（n=10）化療組（n=10）聯(lián)合組（n=10）0.386±0.102 0.053±0.011a 0.205±0.083a b 0.278±0.095a b c 0.032±0.019 0.313±0.121a 0.239±0.065a b 0.166±0.070a b c PTEN HIF-1α

3 討論

包括食管癌在內(nèi)，各類型的實(shí)體瘤組織中均有不同程度的缺氧，而缺氧環(huán)境可以刺激腫瘤細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），促進(jìn)腫瘤新血管生成，因此缺氧可能促進(jìn)惡性腫瘤的生物學(xué)演進(jìn)[9]。相關(guān)研究指出，低氧環(huán)境可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定，使腫瘤細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，提高腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[10]。因此，改善腫瘤微環(huán)境缺氧狀態(tài)成為近年來(lái)腫瘤治療的新手段，其中HBO是最常見而簡(jiǎn)便的手段[11]。目前，HBO聯(lián)合放療或化療在食管癌治療方面的研究較少，臨床研究具體實(shí)踐參數(shù)資料缺乏，因此本文擬從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開始研究HBO對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響，為后續(xù)HBO的臨床應(yīng)用提供參考。

Yang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，低氧刺激可以促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖，而通過(guò)miRNA-146a下調(diào)CADM2表達(dá)可以減緩腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖速率。本研究結(jié)果顯示，化療組與聯(lián)合組裸鼠的腫瘤體積均小于模型組（P＜0.05），而聯(lián)合組裸鼠的腫瘤體積小于化療組（P＜0.05）。提示HBO聯(lián)合化療在裸鼠食管癌模型中可以有效縮小腫瘤體積，較單獨(dú)應(yīng)用化療的療效更好。Qi等[13]研究表明，高氧分壓狀態(tài)下腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性增加。由于本研究?jī)H對(duì)食管癌模型裸鼠進(jìn)行了30天的HBO治療，明顯短于實(shí)際化療時(shí)間；而且本研究為預(yù)實(shí)驗(yàn)，每組僅10只裸鼠，因此下一步還需要增加樣本量，進(jìn)一步研究食管癌細(xì)胞對(duì)HBO聯(lián)合化療的敏感性[14]。

HIF-1廣泛存在于人和哺乳動(dòng)物體內(nèi)，由HIF-1α和HIF-1β兩種異源二聚體組成[15]，其中β亞基可以在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定表達(dá)，而α亞基在有氧條件下會(huì)被細(xì)胞內(nèi)氧依賴性泛素蛋白酶快速降解，而缺氧環(huán)境中HIF-1α可穩(wěn)定存在[16]。本研究結(jié)果顯示，各組裸鼠中HIF-1α的表達(dá)水平由高到低依次為模型組、化療組、聯(lián)合組及對(duì)照組，且組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示在HBO作用下，食管癌組織中氧分壓增高，可以降低HIF-1α的表達(dá)水平。Masoud和Li[17]研究指出，HIF-1可以促進(jìn)VEGF基因轉(zhuǎn)錄，并增強(qiáng)VEGFmRNA的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)腫瘤的新血管生成。因此，HIF-1可以間接減少腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)[18]。

PTEN基因位于第10號(hào)染色體，由9個(gè)外顯子組成，可編碼403個(gè)氨基酸，合成PTEN蛋白[19]。Shen等[20]研究表明，PTEN高表達(dá)可以降低HIF-1的穩(wěn)定性。本研究結(jié)果顯示，各組裸鼠中PTEN的表達(dá)水平由高到低依次為對(duì)照組、聯(lián)合組、化療組及模型組，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示HBO可以增強(qiáng)PTEN的表達(dá)，間接增加了對(duì)HIF-1表達(dá)的阻斷作用。此外，PTEN具有磷酸酯酶的活性，對(duì)黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）等磷酸化酶有拮抗作用，Jaraíz-Rodríguez等[21]研究發(fā)現(xiàn)，PTEN基因異常的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的FAK活性明顯增高；轉(zhuǎn)染野生型PTEN基因后，細(xì)胞的FAK活性明顯降低，而且腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力也均明顯降低。Kuchay等[22]研究發(fā)現(xiàn)，PTEN蛋白還可以通過(guò)抑制肌醇三磷酸（inositol triphosphate，IP3）的活性，間接地抑制胰島素（insulin）/IP3/磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)通路的活性。上述研究表明，PTEN蛋白可能是一種作用廣泛的腫瘤抑制因子。

綜上所述，HBO聯(lián)合化療可以上調(diào)食管癌裸鼠模型腫瘤組織中PTEN的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)HIF-1α的表達(dá)，提高化療藥物對(duì)食管癌的殺滅效果。