王升曄 封巍 程國(guó)平 陳夢(mèng)圓 陳明

大分割放療如立體定向放射治療（stereotactic body radiotherapy，SBRT）等使腫瘤受到較大生物有效劑量放療時(shí)，也增加了臨近及放療區(qū)域內(nèi)正常器官的放射損傷。胸部腫瘤的大分割放療主要引起心、肺等器官的損傷。胸部放療引起的心臟疾病有很多，包括心肌病變或纖維化、心包炎癥、心臟瓣膜損傷、冠狀動(dòng)脈事件、心臟傳導(dǎo)問題甚至發(fā)生猝死[1-3]。放射治療的射線能引起一系列炎癥級(jí)聯(lián)應(yīng)激事件，從而導(dǎo)致細(xì)胞核等結(jié)構(gòu)的相關(guān)損傷。已有的實(shí)驗(yàn)研究表明，心臟受到輻照后，心肌炎癥和內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及毛細(xì)血管密度減低等可以在心臟功能性損傷前就發(fā)生[4-6]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在無癥狀表現(xiàn)的確診有心臟疾病的乳腺癌放療患者中，放療后6個(gè)月出現(xiàn)區(qū)域性的心臟灌注缺失。上述研究結(jié)果顯示，早期的心臟微血管損傷有導(dǎo)致嚴(yán)重心功能損傷的可能性。目前，放療學(xué)家們逐漸關(guān)注到放療引起的心臟疾病所帶來的風(fēng)險(xiǎn)，而放療相關(guān)心臟疾病的發(fā)生機(jī)制及與心臟微血管損傷、動(dòng)脈粥樣硬化等的關(guān)系還未明確。本研究旨在探討小鼠心臟受到大分割單次16Gy放療后，其心臟病理學(xué)結(jié)構(gòu)改變和可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由浙江中醫(yī)藥大學(xué)提供20只8～10周的SPF級(jí)C57BL/6J家系的雄性小鼠，體重約（20±2）g，所有小鼠在同一天入組，采用隨機(jī)區(qū)組法被分為對(duì)照組1、對(duì)照組2，放療組1、放療組2：對(duì)照組1、放療組1小鼠入組12周時(shí)被處死，對(duì)照組2、放療組2小鼠入組30周時(shí)被處死。5只小鼠為一組，在溫控約22℃、相對(duì)濕度約70%的動(dòng)物飼養(yǎng)房?jī)?nèi)分籠飼養(yǎng)，每天進(jìn)行照明與黑暗交替，每12h更替一次，即20:00～8:00熄燈，用標(biāo)準(zhǔn)的水和食物給予喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)操作中嚴(yán)格遵照浙江中醫(yī)藥大學(xué)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室相關(guān)規(guī)章制度，依照動(dòng)物倫理學(xué)的要求對(duì)待所有實(shí)驗(yàn)小鼠。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 抗體：Anti-CD34(ab81289，上海艾博抗貿(mào)易有限公司，免疫組化稀釋比1∶400）；Anti-Von Willebrand Factor（ab9378，上海艾博抗貿(mào)易有限公司，免疫組化稀釋比1∶100）。其他輔助試劑：10%的中性福爾馬林緩沖液，蘇木精液，HRP標(biāo)記的抗兔二抗，pH值為7.4～7.6的磷酸緩沖鹽溶液，pH值為9.0的乙二胺四乙酸修復(fù)液。

1.3 方法

1.3.1 放療步驟 清醒狀態(tài)下未行麻醉的實(shí)驗(yàn)小鼠每組5只仰臥位并排于板上，用可調(diào)節(jié)夾具固定和限制小鼠的胸部和軀干，并用紙膠進(jìn)一步將小鼠固定在板上。用單次劑量為16Gy的6MVX線照射放療組小鼠的胸部包括心臟區(qū)域，照射范圍為10.6mm×15mm。為保證小鼠的心臟能夠全部受到輻照，放療區(qū)域?qū)⑸儆?/3的肺組織也包括在內(nèi)。放療組1、2均在入組第1天完成單次照射。

1.3.2 樣本采集 按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)入組的小鼠觀察12周和30周，之后對(duì)其麻醉并用頸椎脫臼法處死，立即尸解其心臟。將心臟組織在0.1mol/L磷酸緩沖液中漂洗2次，切取小塊心臟組織，大小為1cm3左右，經(jīng)固定、水洗、脫水、透明、浸蠟包埋等步驟制作標(biāo)本包埋塊。經(jīng)石蠟包埋、制作蠟塊并常規(guī)切片，進(jìn)行HE染色及免疫組化染色檢測(cè)。

1.3.3 免疫組化檢測(cè) 采用二步法的免疫組化方法。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇溶液脫水后，用抗原高壓熱修復(fù)，加入一抗后在室溫下孵育1h，加入二抗于室溫下30min，3，3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽顯色，蘇木精液復(fù)染后，經(jīng)過脫水、透明、封片，用顯微鏡觀察。陽性對(duì)照按照產(chǎn)品說明書采用已知為陽性表達(dá)的組織，陰性對(duì)照用磷酸緩沖鹽溶液替代。

1.3.4 微血管密度（microvascular density，MVD）計(jì)算方法 參照Weidner的計(jì)算方法[7]，首先在低倍鏡視野下（×100倍）選擇MVD最高的3個(gè)熱點(diǎn)視野，然后在高倍鏡下（×100倍）計(jì)數(shù)3個(gè)視野內(nèi)的微血管數(shù)量，取3者的平均值作為一個(gè)心臟標(biāo)本的MVD值。無論管腔存在與否，單個(gè)陽性染色細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)均可作為一個(gè)微血管，而管腔截面比8個(gè)紅細(xì)胞大的血管則不能算為微血管。經(jīng)CD34+或vWF標(biāo)記的免疫組化染色后組織切片也行MVD計(jì)數(shù)，此時(shí)將棕黃染色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為一條微血管。

1.3.5 心外膜厚度的測(cè)量 取每只小鼠左心室壁（包括壁膜間隔成分）的心臟組織，經(jīng)包埋蠟塊、切片及HE染色后，在低倍鏡下（×100倍）選取每個(gè)心臟標(biāo)本心外膜的不同部位，然后在高倍鏡下（×400倍）對(duì)每個(gè)心臟標(biāo)本行12次外膜厚度測(cè)量，計(jì)算平均值作為該心臟標(biāo)本的心外膜厚度。每組小鼠再取平均值作為該組的心外膜厚度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 放療結(jié)果 放療組2中的1只小鼠在放療后29周4天時(shí)發(fā)生猝死。其余小鼠在規(guī)定的相應(yīng)時(shí)間被處死。

2.2 12周時(shí)兩組小鼠心臟MVD計(jì)數(shù)比較 見圖1-3、表 1。

表1 12周時(shí)兩組小鼠心臟MVD計(jì)數(shù)比較

由圖1-3和表1可見，小鼠經(jīng)單次大分割放療后12周時(shí)，心外膜和心肌上的巨噬細(xì)胞含鐵血黃素有所增加，彈性纖維被破壞，呈現(xiàn)為雜亂無序，并可見腫脹的內(nèi)皮細(xì)胞和橫紋肌細(xì)胞。放療組1小鼠心臟HE染色下MVD較對(duì)照組1明顯減少（P＜0.01）；CD34+和vWF標(biāo)記的MVD明顯增加（均P＜0.01）。

2.3 30周時(shí)兩組小鼠心臟MVD計(jì)數(shù)比較 見圖4-6、表 2。

由圖4-6和表2可見，小鼠經(jīng)單次大分割放療后30周時(shí)，心外膜和心肌上的巨噬細(xì)胞及其含鐵血黃素有進(jìn)一步的增加，更多的彈性纖維被破壞甚至斷裂，雜亂無序的表象更為明顯，腫脹的內(nèi)皮細(xì)胞和橫紋肌細(xì)胞在鏡下隨處可見。放療組2小鼠心臟HE染色下MVD較對(duì)照組2明顯減少（P＜0.01）；CD34+和vWF標(biāo)記的MVD明顯增加（均P＜0.01）。

2.4 12周和30周時(shí)兩組小鼠心外膜厚度比較 12周時(shí)放療組1小鼠心外膜厚度為20.6μm，對(duì)照組1為 9.4μm；30周時(shí)放療組2小鼠心外膜厚度為22.2μm，對(duì)照組2為10.2μm。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，放療組2心外膜較對(duì)照組2明顯增厚，見圖7。

圖 1 12 周時(shí)小鼠心肌組織 HE 染色圖（A：對(duì)照組 1，×100；B：對(duì)照組 1，×400；C：放療組 1，×100；D：放療組 1，×400）

圖2 12周時(shí)小鼠心肌組織CD34+標(biāo)記的免疫組化染色圖（A：對(duì)照組 1，×400；B：放療組 1，×400）

圖3 12周時(shí)小鼠心肌組織vWF標(biāo)記的免疫組化染色圖（A：對(duì)照組1，×400；B：放療組 1，×400）

表2 30周時(shí)兩組小鼠心臟MVD計(jì)數(shù)比較

圖 4 30 周時(shí)小鼠心肌組織 HE 染色圖（A：對(duì)照組 2，×100；B：對(duì)照組 2，×400；C：放療組 2，×100；D：放療組 2，×400）

圖5 30周時(shí)小鼠心肌組織CD34+標(biāo)記的免疫組化染色圖（A：對(duì)照組 2，×400；B：放療組 2，×400）

圖6 30周時(shí)小鼠心肌組織vWF標(biāo)記的免疫組化染色圖（A：對(duì)照組2，×400；B：放療組 2，×400）

圖7 30周時(shí)小鼠心外膜染色圖（A：放療組2；B：對(duì)照組2；HE染色，×400，箭頭示心外膜）

3 討論

近年來，放療學(xué)家們對(duì)于放療所造成的細(xì)胞毒 性及其輻射損傷日益關(guān)注。輻射損傷造成小鼠相關(guān)臟器組織的病理生理學(xué)改變的研究也時(shí)有報(bào)道。心臟作為對(duì)輻射較為敏感的靶器官，其大體結(jié)構(gòu)和微血管結(jié)構(gòu)存在著放射劑量和時(shí)間上的相關(guān)性和依賴性。大分割劑量的放療可能造成較嚴(yán)重的心臟損傷，且可能放療后早期就發(fā)生，損傷隨著時(shí)間的推移而進(jìn)展。從放療后12周和30周處死的小鼠心臟標(biāo)本來看，放療組小鼠的心外膜較對(duì)照組顯著增厚；提示放療組小鼠心臟纖維廣泛增厚。接受單次16Gy胸部放療的小鼠在放療后早期，即12周時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞的丟失大于細(xì)胞的增殖，MVD呈下降趨勢(shì)，30周時(shí)MVD出現(xiàn)進(jìn)一步下降。

CD34+分子是一種黏附分子，屬于鈣黏蛋白家族。它可以在哺乳動(dòng)物包括人類的造血祖或干細(xì)胞的表面有選擇地表達(dá)。它以受體-配體相結(jié)合的方式起作用，是參與細(xì)胞間信號(hào)遞呈、免疫應(yīng)答、炎癥發(fā)生和凝血反應(yīng)等多個(gè)病理生理過程的主要分子[8]。血管性假血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）由血管巨核細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞生成和分泌，參與止血過程。缺乏vWF可造成血管性假血友病。在內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷或刺激時(shí)，血漿vWF的數(shù)量出現(xiàn)增高[9]。當(dāng)出現(xiàn)持續(xù)進(jìn)展的血管滲漏，微血管結(jié)構(gòu)受到損害，CD34+和vWF的表達(dá)增多，提示內(nèi)皮細(xì)胞受損[10-12]。多個(gè)研究認(rèn)為，受到劑量較高的放療時(shí)心臟組織中能發(fā)現(xiàn)心肌白蛋白沉積，這與淀粉樣變性相關(guān)，提示血管的滲漏[13-14]。淀粉樣變性由異常原纖維或胞外不溶性物沉積而成，也可能由錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)匯聚形成，其重要的臨床特點(diǎn)是會(huì)導(dǎo)致心臟衰竭[15]，由此我們推斷這可能是導(dǎo)致個(gè)別小鼠在隨訪后期出現(xiàn)猝死的潛在原因。

多個(gè)研究提示，盡管經(jīng)輻射后小鼠的血管結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)受到了較大程度的損傷，但其心功能的改變?cè)谠缙谑禽^小的，并不是進(jìn)展性的。由此推斷小鼠心肌的重組、重構(gòu)在一定程度上可能代償了部分血管結(jié)構(gòu)改變和功能損傷[16]。個(gè)別小鼠在放療后不到30周時(shí)死亡，最可靠的方法是可以用尸檢來明確其真正死因。除了之前提及的淀粉樣變是可能的原因外，另一個(gè)可能原因是心肌的這種代償機(jī)制在較高劑量輻照下并非能較長(zhǎng)時(shí)期保持。離體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，受到早期炎癥反應(yīng)激發(fā)后，心肌細(xì)胞相應(yīng)發(fā)出明顯信號(hào)[17]，該過程可直接產(chǎn)生大量的巨噬細(xì)胞。心肌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間的這種相互反應(yīng)，使心肌收縮力出現(xiàn)下降從而使心臟舒張期和收縮期的充盈程度均下降。心肌收縮力的減退可以用心肌細(xì)胞減少和膠原黏著增加來部分解釋[18]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ca2+-ATP酶可以代償損傷心肌的部分功能，以盡可能保持正常的舒張和收縮能力。

本研究提示小鼠心臟接受單次16Gy放療后，觀察12周和30周后處死，放療組小鼠心外膜較對(duì)照組有明顯增厚；MVD逐漸下降，提示內(nèi)皮細(xì)胞的減少，同時(shí)用CD34+和vWF標(biāo)記的MVD逐漸增加，也相應(yīng)提示內(nèi)皮細(xì)胞損傷。限制性心包炎可以造成炎癥細(xì)胞和含鐵巨噬細(xì)胞的增多，常常伴有心外膜增厚；這種限制性的心肌重塑可能造成舒張期和收縮期心臟大血管和心肌表面的淀粉樣變沉積，從而可能加重血管滲漏。這個(gè)機(jī)制或許能部分解釋小鼠猝死的原因。

本研究是對(duì)單次大分割放療后的小鼠心臟的病理學(xué)研究，因樣本量和實(shí)驗(yàn)條件的限制，僅對(duì)其病理改變行HE、免疫組化等較基本的病理學(xué)研究，為人體心臟放射損傷的機(jī)制提供了部分依據(jù)。未來的研究可以建立高血壓或者動(dòng)脈粥樣硬化的小鼠模型，并對(duì)其心臟進(jìn)行不同放療分割劑量的照射，來進(jìn)一步觀察建模小鼠在不同放療分割劑量下的心臟病理改變。