買爾哈巴·艾合麥提 ，田月珍 ，柏 妍 ，楊雪梅 ，田可川 *，黃錫霞 *

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆阿克蘇地區(qū)畜牧技術(shù)推廣中心，新疆 阿克蘇 843000；3.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊 830000）

巨大的國內(nèi)市場需求為中國細(xì)毛羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展創(chuàng)造了機(jī)遇，同時(shí)也形成了挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)的育種方法已經(jīng)不能完全滿足羊毛生產(chǎn)與市場需求，因此，分子育種在細(xì)毛羊的選種選育過程中尤為重要。中國美利奴羊（新疆型）是在1984年由澳洲美利奴公羊與新疆細(xì)毛羊雜交培育而成的毛用細(xì)毛羊品種[1-2]，在該品種審定之后，就繼續(xù)開展有計(jì)劃、有規(guī)模的選種選育工作。該品種羊的肌肉發(fā)達(dá)、體質(zhì)健碩、適宜放牧，并且具有毛長且彎曲、毛叢結(jié)構(gòu)好、呈油白色和乳白色、凈毛量高和含量均勻適中等特點(diǎn)。艾買提·買買提[3]和瑪依拉·吐爾遜[4]采用PCR-SSCP技術(shù)對中國美利奴羊（新疆型）群體中的KAP基因和KRT基因分別進(jìn)行了多態(tài)性檢測以及關(guān)聯(lián)性分析了這兩個(gè)基因與羊毛性狀的關(guān)系；馮靜等[5-7]通過采用克隆測序法和PCR-SSCP技術(shù)對KAP1.1、KAP1.3及KAP6.1基因的多態(tài)性及其與羊毛性狀的關(guān)系在中國美利奴羊 （軍墾型）群體中進(jìn)行了研究；許漢峰[8]對中國美利奴羊（軍墾型）群體中角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白基因（KAP及KRT基因）與綿羊毛品質(zhì)的相關(guān)性進(jìn)行了研究分析。這些研究都為影響中國美利奴羊（新疆型）的羊毛性狀候選基因的研究分析提供了方法和理論依據(jù)。GPR143基因也被稱為OA1蛋白，作為G偶聯(lián)蛋白受體家族的成員之一[9-10]，編碼包含404個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)是一種黑素小體膜整合性蛋白，重點(diǎn)是在視網(wǎng)膜的色素上皮層、皮膚的黑色素細(xì)胞以及虹膜中表達(dá)，在眼睛、皮膚以及毛發(fā)中的色素蛋白質(zhì)的形成中起重要作用[11]，并發(fā)揮著轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的作用，其功能是調(diào)節(jié)黑色素小體的生長[12]。本研究目的是通過分析中國美利奴羊（新疆型）群體內(nèi)的GPRl43基因的遺傳特征來尋找多態(tài)性，并對GPRl43基因的多態(tài)性與羊毛重要經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，以期發(fā)現(xiàn)GPRl43基因?qū)ρ蛎焚|(zhì)性狀的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)由新疆伊犁新源縣鞏乃斯種羊場提供，試驗(yàn)動(dòng)物為新疆鞏乃斯種羊場所供應(yīng)的中國美利奴羊（新疆型）周歲羊，共采集550只中國美利奴羊（新疆型）的毛樣及血樣，其中，周歲羊418只，兩周歲羊132只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 數(shù)據(jù)收集和整理

收集鞏乃斯種羊場2011-2012年418只的周歲羊與2010-2012年132只的兩周歲羊羊毛品質(zhì)鑒定記錄，用EXCEL軟件進(jìn)行初步整理。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI提供的綿羊GPR143基因序列 （Gene Bank登錄號NC-019484），采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并送至上海Sangon Biotech公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的模板是提取的基因組DNA，總體積是20 μL，反應(yīng)體系見表2。通過梯度PCR尋求樣品的最佳退火溫度，PCR的擴(kuò)增程序見表3，將擴(kuò)增產(chǎn)物放置于2%瓊脂糖凝膠并在100 V的條件下電泳檢測20 min。

表2 PCR反應(yīng)體系

表3 PCR反應(yīng)程序

1.2.4 PCR-SSCP凝膠電泳

取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與8 μL變性緩沖液，將其離心混勻，98℃變性10 min，之后立刻冰浴20min。將變性后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物全部上樣于12%非變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，在300 V的電壓下預(yù)電泳30 min，隨后180 V恒壓電泳16 h。在聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)束之后，采用銀染色法對凝膠進(jìn)行染色，并通過顯色情況判定其基因型。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)、純合度及雜合度及多態(tài)信息含量（PIC），并用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)品種內(nèi)基因型的分布。用SAS8.1軟件對GPR143基因的不同基因型和中國美利奴羊（新疆型）羊毛性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。分析模型如下：

其中，Yijk=分析性狀的觀測值；μ=總體均值；ai=基因型效應(yīng)；bj=群別效應(yīng)；qk=年齡效應(yīng)；eijk=隨機(jī)誤差。

(2)多元化合作：①鼓勵(lì)“師傅型”教師與企業(yè)師傅合作交流，以結(jié)對子、拜師傅等形式交流傳承技能經(jīng)驗(yàn)，提高自身的職業(yè)能力；②參與校企合作召開的專業(yè)座談會(huì)、課程建設(shè)討論會(huì)、技能比賽等活動(dòng)，提升師資的企業(yè)文化理念與職業(yè)教育理念。

2 結(jié)果

2.1 DNA完整性檢測結(jié)果

用0.8%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢測DNA模板。如圖1所示，DNA純度高、質(zhì)量良好，可直接作為模板DNA使用。

圖1 DNA檢測結(jié)果電泳圖

2.2 GPR143基因的PCR檢測和PCR-SSCP多態(tài)性檢測結(jié)果

由圖2可知，用2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)GPR143基因的PCR產(chǎn)物大小為287 bp。結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得的片段長度與預(yù)期的大小一致，并且未形成引物二聚體，可以在后續(xù)試驗(yàn)的多態(tài)性檢測中運(yùn)用。

對GPR143基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行PCR-SSCP分析，由圖3可知，GPR143基因的擴(kuò)增片段在中國美利奴羊（新疆型）群體中存在三種不同的基因型，分別命名為 AA，AB，BB 型。泳道 1、2、4、5、6、7、8、9、11為AA基因型；泳道3和12為BB基因型；泳道10為AB基因型。

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖

圖3 PCR-SSCP電泳圖

2.3 多序列對比

由圖4可知，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA雙向測序，將測序結(jié)果與已知的綿羊GPR143基因的CDs序列進(jìn)行比對，在外顯子6上得到AA、BB和AB三種基因型。在217 bp處AA基發(fā)生堿基突變，即G→T；在229 bp處AB基因型發(fā)生堿基突變，即C→T。

圖4 不同基因型個(gè)體多序列對比圖

2.4 GPR143基因外顯子6基因頻率和基因型頻率分析

由表4可知，GPR143基因外顯子6的三種基因型AA、AB和BB的基因型頻率分別為0.76、0.16和0.08。其中A等位基因頻率為0.84，B等位基因頻率為0.16。經(jīng)過χ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)在中國美利奴羊（新疆型）群體中處在Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)(P＜0.05)。根據(jù)確定位點(diǎn)多態(tài)性的標(biāo)準(zhǔn)，GPR143基因的外顯子6的多態(tài)信息含量為0.23，屬于低度多態(tài)位點(diǎn)。

表4 GPR143基因外顯子6的基因型分布頻率及遺傳特性

2.5 GPR143基因與羊毛性狀的關(guān)聯(lián)性分析

使用SAS8.1軟件分析基因型、群別及年齡對羊毛性狀的影響。如表5所示，基因型對剪毛量、平均直徑、毛纖維直徑變異系數(shù)、油汗、毛彎曲數(shù)、鑒定時(shí)體重、剪毛后體重、體格大小、毛長度評分、毛彎曲評分、毛細(xì)度評分的影響不顯著（＞0.05）；而對光澤有顯著的影響（＜0.05）。群別對剪毛量、毛纖維直徑變異系數(shù)、油汗、鑒定時(shí)體重、剪毛后體重、光澤、毛長度評分、毛細(xì)度評分有極顯著影響(＜0.01)；而對平均直徑、毛彎曲數(shù)、體格大小、毛彎曲評分的影響不顯著（＞0.05）。年齡對剪毛量、平均直徑、油汗、剪毛后體重、光澤、毛彎曲評分有極顯著影響(＜0.01)；對鑒定時(shí)體重有顯著的影響（＜0.05）；而對毛纖維直徑變異系數(shù)、毛彎曲數(shù)、體格大小、毛長度評分、毛細(xì)度評分影響不顯著（＞0.05）。

2.6 不同基因型與毛性狀之間的最小二乘均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)誤及多重比較

表6 不同基因型與羊毛性狀之間最小二乘均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤及多重比較

3 討論

在NCBI數(shù)據(jù)庫中可以查到，GPR143基因位于綿羊的X染色體上，全基因組序列長度為40022 bp，由10個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成。最常見的眼白化病類型是眼部白化病I型（OA1），是由GPR143基因突變導(dǎo)致的，其產(chǎn)物OA1蛋白是一種G蛋白受體，在細(xì)胞與細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)和物質(zhì)運(yùn)輸中起重要作用。GPR143基因提供了制造涉及眼睛和皮膚的著色（色素沉著）的蛋白質(zhì)。 這種蛋白質(zhì)在視網(wǎng)膜和皮膚細(xì)胞的光敏組織中形成的。GPR143蛋白是控制黑素體生長和成熟的信號傳導(dǎo)途徑的一部分，黑素體是產(chǎn)生和儲(chǔ)存稱為黑色素的色素的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。 黑色素是給皮膚，毛發(fā)和眼睛填充顏色的物質(zhì)。在視網(wǎng)膜中，這種色素在正常視力中也起著關(guān)鍵的作用。GPR143基因也可導(dǎo)致嚴(yán)重的視力障礙，例如眼球震顫、畏光、斜視、視力低下、色素沉著不均勻等。Schiaffino等[13]用免疫熒光學(xué)技術(shù)將內(nèi)源性O(shè)A1蛋白定位在黑素細(xì)胞中的黑素小體膜上。在后來的研究過程中發(fā)現(xiàn)OA1蛋白在非黑素細(xì)胞中被定位在溶酶體膜上。金怡軒和劉斐等[14]研究了一例OA1型家族的致病基因GPR143，并對該基因進(jìn)行突變檢測，發(fā)現(xiàn)該基因GPR143出現(xiàn)了新的突變。通過PCR擴(kuò)增OA1型致病基因GPR143的外顯子以及鄰近的內(nèi)含子，并進(jìn)行直接測序，結(jié)果顯示，在OA1型的患者的致病基因GPR143中發(fā)現(xiàn)了整個(gè)外顯子的缺失突變，從而擴(kuò)展了OA1型致病基因的突變頻譜。

周琦等[15]的研究表明：OA1型致病基因GPR143的產(chǎn)物是OA1蛋白，它是在視網(wǎng)膜色素的上皮細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生的。大多數(shù)的突變改變的是GPR143蛋白質(zhì)的大小或形狀。這些基因變化經(jīng)常阻礙異常蛋白質(zhì)到達(dá)黑素體，這些黑素體需要控制這些含色素結(jié)構(gòu)的生長。GPR143蛋白通常到達(dá)黑素體，但突變阻止蛋白質(zhì)與其信號通路中的其他分子相互作用。 沒有功能性的GPR143蛋白質(zhì)，皮膚細(xì)胞和視網(wǎng)膜中的黑色素體就會(huì)異常增大。 目前尚不清楚這些巨大黑素體（macromelanosomes）與眼部白化病患者的視力喪失和其他眼部異常有關(guān)。

Masukawa D等[16]的研究表明，OA1-免疫反應(yīng)分布在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元或細(xì)胞，使用SDOCT技術(shù)來確定眼白化病患者GPR143基因的突變頻率，應(yīng)用PCR擴(kuò)增的完整編碼序列進(jìn)行突變篩查和確定GPR143基因的序列并分析揭示了兩個(gè)病人病理基因突變[17]。

目前，GPR143基因?qū)χ袊览ㄐ陆停┫嚓P(guān)性狀調(diào)控的研究分析尚未見報(bào)道，但通過它的生物學(xué)功能，我們可以推測出該基因可能對羊毛的毛品質(zhì)性狀有影響。本試驗(yàn)選取同一品種中國美利奴（新疆型）不同年齡（周歲，兩歲），經(jīng)過PCR-SSCP技術(shù)，在GPR143基因外顯子6上發(fā)現(xiàn)堿基突變，產(chǎn)生三種帶型：AA，AB和BB基因型。BB基因型的光澤顯著高于AA和AB型。在217 bp處AA基發(fā)生堿基突變，即G→T；在229 bp處AB基因型發(fā)生堿基突變，即C→T。

4 結(jié)論

采用PCR-SSCP技術(shù)對綿羊GPR143基因外顯子6區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行了分析，將測序結(jié)果與已知的綿羊GPR143的CDs序列進(jìn)行比對，在外顯子6上得到三種基因型，首次在外顯子6發(fā)現(xiàn)堿基突變。該位點(diǎn)屬于低度多態(tài)位點(diǎn)并且該位點(diǎn)的突變可能是影響羊毛光澤的重要位點(diǎn)。本研究設(shè)計(jì)的引物片段較少，擴(kuò)增針對的外顯子不全面，所以有待擴(kuò)大樣本量，延伸基因區(qū)域范圍進(jìn)行更深入的研究，從而更全面的確定GPR143基因的功能。